王麗嬋，譚亞軍，衛(wèi)辰，張庶民，張華捷，馬霄

中國食品藥品檢定研究院百白破疫苗與毒素室衛(wèi)生部生物技術(shù)產(chǎn)品檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點實驗室，北京102629

帶有莢膜多糖的細(xì)菌如流感嗜血桿菌、腦膜炎奈瑟球菌、肺炎鏈球菌等，是嚴(yán)重威脅人類健康的幾種侵襲性呼吸道細(xì)菌，對5歲以下兒童尤其是2歲以下嬰幼兒和70歲以上老年人是主要的致命性病原菌。細(xì)菌多糖存在于細(xì)菌表面，在細(xì)菌感染過程中起關(guān)鍵作用。多糖提取后即可作為疫苗預(yù)防細(xì)菌感染，細(xì)菌多糖疫苗對肺炎鏈球菌、流行性腦膜炎球菌、b型流感嗜血桿菌等多種細(xì)菌引起的傳染病具有顯著的預(yù)防效果，但多糖疫苗也有其自身的一些缺點，如多糖抗原為T細(xì)胞非依賴型（T cell independent，TI），使其在免疫系統(tǒng)發(fā)育尚未完全的2歲以下兒童中免疫效果極不理想，對于免疫缺陷人群及65歲以上老年人的保護性也較差［1-2］。目前通用的解決方案是使用化學(xué)方法將細(xì)菌多糖與某個能夠引起T細(xì)胞免疫反應(yīng)的載體蛋白偶聯(lián)制備多糖蛋白結(jié)合疫苗，從而實現(xiàn)抗原類型從TI到T細(xì)胞依賴型（T cell dependent，TD）的轉(zhuǎn)化，解決嬰幼兒接種多糖疫苗無免疫應(yīng)答、低免疫應(yīng)答和不能產(chǎn)生長期保護的問題。

目前常用的載體種類有限，包括白喉類毒素（diphtheria toxoid，DT）、破傷風(fēng)類毒素（tetanus toxoid，TT）以及白喉毒素突變體CRM197等，其中TT的免疫原性及免疫持久性最好，這也是目前已上市的多糖-蛋白結(jié)合疫苗使用的主要載體。隨著多糖結(jié)合疫苗種類的增多，載體蛋白的開發(fā)跟不上多糖結(jié)合疫苗的發(fā)展，勢必出現(xiàn)相同載體蛋白同時應(yīng)用于幾個多糖結(jié)合疫苗的情況，將會引起爭奪體內(nèi)有限的載體蛋白特異性T淋巴細(xì)胞的現(xiàn)象，從而影響免疫效果。此外，TT本身為百白破聯(lián)合疫苗中破傷風(fēng)疫苗的成分，重復(fù)接種有增加TT接種量的風(fēng)險，很可能會引起超負(fù)荷或免疫抑制等問題［3-4］。因此，進一步開展對載體蛋白的研究和開發(fā)一系列有效的載體蛋白勢在必行。

流感嗜血桿菌D蛋白（protein D，PD）是流感嗜血桿菌的外膜蛋白成分，也是其毒力因子之一，作用于宿主的呼吸系統(tǒng)，為流感嗜血桿菌在鼻咽部的定居提供可能［5］。PD相對分子質(zhì)量約為42 000，幾乎存在于所有流感嗜血桿菌中，因其能與人類免疫球蛋白D結(jié)合而命名［6］。以PD為載體的結(jié)合疫苗在國外早有研究，并已有產(chǎn)品上市，如葛蘭素史克公司研制的10價肺炎球菌結(jié)合疫苗，經(jīng)多項臨床評價，顯示其免疫原性及安全性良好，既能提高肺炎球菌多糖的免疫原性，又能通過產(chǎn)生的D蛋白特異性抗體在一定程度上預(yù)防流感嗜血桿菌感染引起的疾病，如中耳炎［7-15］。本研究旨在對流感嗜血桿菌PD為載體蛋白的A群腦膜炎奈瑟菌（group A meningococcal polysaccharide，GAMP）結(jié)合物進行初步免疫效果評價。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 重組PD為本室前期自行制備保存；TT蛋白和GAMP多糖由中國食品藥品檢定研究院呼吸道細(xì)菌室提供；A群腦膜炎球菌多糖由北京衛(wèi)信天成公司提供；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG、IgG1和IgG2a為美國Santa Cruz公司產(chǎn)品；小鼠淋巴細(xì)胞分離液、無血清細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞因子檢測試劑盒為深圳達科為公司產(chǎn)品；RPMI1640培養(yǎng)液為美國Hyclone公司產(chǎn)品；OPD顯色試劑為美國Ameresco公司產(chǎn)品；PMA、Ionomycin、FHA、DMF、TTC和DMSO為美國Sigma公司產(chǎn)品；Mouse CD3 PerCP、Mouse CD4 FITC、Mouse IFNγ PE、Mouse IL-4 APC和Brefeldin A為美國Biolegend公司產(chǎn)品；Sepharose 4FF凝膠層析柱為美國GE公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為美國Molecular Devices公司產(chǎn)品；ELISPOT檢測分析儀為美國CTL公司產(chǎn)品；流式檢測分析儀為美國Becton Dickinson產(chǎn)品；細(xì)胞計數(shù)儀為日本Celltac公司產(chǎn)品；圓形底組織培養(yǎng)微量滴定板和ELISA酶標(biāo)板為美國Costar公司產(chǎn)品；圓形、方形培養(yǎng)皿為美國Nunc公司產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗動物SPF級BALB／c小鼠，雌性，4周齡，體重16～18 g，由中國食品藥品檢定研究院實驗動物中心提供。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2014-0013。

1.3 多糖-蛋白結(jié)合物的制備 蛋白與多糖以CDAP活化法結(jié)合［16-17］，該方法可在弱堿性條件下完成，減少由于強堿條件對多糖結(jié)構(gòu)或抗原表位的破壞。此外，CDAP活化法可不需使用連接臂直接將活化的多糖與載體蛋白相連。結(jié)合物經(jīng)Sepharose 4FF凝膠層析柱純化后，用0.22 μm濾器除菌過濾，2～8℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 多糖-蛋白結(jié)合物理化性質(zhì)檢測 參照《中國藥典》三部（2015版）［18］，結(jié)合物中蛋白質(zhì)含量采用改良Lowry法測定；A多糖含量采用磷測定法進行折算，根據(jù)二者的含量計算多糖／蛋白比值。

1.5 多糖-蛋白結(jié)合物的動物免疫 將小鼠隨機分為6組：A群腦膜炎球菌多糖組（GAMP）、GAMP-PD結(jié)合物組、PD組、GAMP-TT結(jié)合物組、TT蛋白組和陰性對照組（生理鹽水組），每組12只，經(jīng)腹部皮下接種。單獨多糖組按多糖含量5 μg／mL免疫，單獨蛋白組按蛋白含量10 μg／mL免疫，多糖-蛋白結(jié)合物組按多糖含量5 μg／mL免疫，免疫劑量為0.5 mL／只。共免疫3次，第1、10、20日免疫，分別于第9、19、27天眼眶采血，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 多糖-蛋白結(jié)合物的免疫效果評價

1.6.1 小鼠血清抗多糖特異性IgG、IgG1、IgG2a的檢測 采用間接ELISA法檢測各組小鼠免疫后血清中A群多糖特異性IgG、IgG1、IgG2a抗體水平及第3針免疫后IgG1和IgG2a抗體亞類。用終濃度3 μg／mL的GAMP多糖包被酶標(biāo)板，4℃過夜；洗板3次，加入按一定比例稀釋的待檢小鼠血清，37℃孵育1 h；洗板6次，加入相對應(yīng)的羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a，37℃孵育1 h；洗板6次，加入OPD顯色，2 mol／L硫酸終止顯色，酶標(biāo)儀讀取A490值。以試驗組A490值≥PBS對照組A490值的2.1倍為抗體滴度。

1.6.2 小鼠血清抗蛋白特異性IgG、IgG1、IgG2a的檢測 采用間接ELISA法檢測各組小鼠免疫后血清中載體蛋白特異性IgG、IgG1、IgG2a抗體水平及第3針免疫后IgG1、IgG2a抗體亞類。方法同1.6.1項，包被抗原為TT和PD。以試驗組A值≥PBS對照組A值的2.1倍為抗體滴度。

1.6.3 細(xì)胞因子IFNγ和IL-4的檢測 采用ELISPOT法。取各組第3次免疫7 d后小鼠6只，按照ELISPOT試劑盒說明，取小鼠脾臟，分離脾淋巴細(xì)胞，檢測IFNγ和IL-4。每只小鼠均設(shè)復(fù)孔及不加刺激物的對照孔。對于同一結(jié)合組小鼠，分別給予不同免疫成分的刺激，即相應(yīng)蛋白、多糖及蛋白多糖混合物，以便更直觀地觀察小鼠在接受不同成分刺激物刺激時產(chǎn)生細(xì)胞因子的變化情況。刺激物孔內(nèi)終濃度除PD為10 μg／mL外，多糖為30 μg／mL，陽性刺激物ConA終濃度為100 ng／mL，陰性對照孔為PBS。試驗孔最終斑點形成細(xì)胞（spot forming cell，SFC）數(shù)為試驗孔SFC-未加刺激物的對照孔SFC，復(fù)孔取平均值。

1.6.4 Th1和Th2細(xì)胞亞群檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測小鼠免疫后脾淋巴細(xì)胞在體外經(jīng)非特異性刺激劑刺激后，其本身Th1和Th2細(xì)胞狀態(tài)的變化。試驗結(jié)果以Th1／Th2細(xì)胞亞群比值顯示。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用IBM SPSS Statistics 20進行統(tǒng)計學(xué)分析。組間比較采用單因素方差分析和t檢驗，Kolmogorov-Smirnov法檢驗數(shù)據(jù)的正態(tài)性。檢驗水平：α=0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 多糖-蛋白結(jié)合物的理化性質(zhì)GAMP-PD的多糖／蛋白比值為1.64，GAMP-TT的多糖／蛋白比值為0.47，見表1。

表1多糖-蛋白結(jié)合物理化性質(zhì)檢測結(jié)果Tab.1 Test results of physical and chemical properties of polysaccharide-protein conjugates

2.2 多糖-蛋白結(jié)合物的免疫效果

2.2.1 小鼠血清抗多糖特異性IgG、IgG1、IgG2a抗體水平及亞類GAMP-PD和GAMP-TT組每次加強免疫后，均能增強抗-GAMP抗體的IgG水平。與GAMP組相比，接種3針后，GAMP-PD和GAMP-TT組抗-GAMP IgG水平均顯著升高（t=5.242，P=0.000 1），且產(chǎn)生免疫記憶，誘導(dǎo)IgG1、IgG2a的產(chǎn)生。見表2。

表2 各組小鼠血清抗-GAMP IgG抗體水平及亞類Tab.2 Anti-GAMP IgG levels and subclasses in sera of mice of various groups

2.2.2 小鼠血清抗蛋白特異性IgG、IgG1、IgG2a抗體水平及亞類GAMP-PD和PD組抗-PD IgG水平在各針次之間均有顯著增長；接種3針后，PD組抗-PD IgG和IgG1顯著高于GAMP-PD組（t=4.097，P=0.025）。TT組在各針次之間均有顯著增長。GAMPTT組各針次的抗-TT IgG抗體均未檢出。見表3。表明PD、TT蛋白與A群多糖結(jié)合后，其自身免疫原性受到不同程度的抑制，尤其是TT與A群多糖結(jié)合后，TT的免疫原性完全受到抑制。

表3 蛋白及蛋白與A群多糖結(jié)合組免后抗-蛋白抗體IgG及其亞類的檢測Tab.3 Anti-PD IgG and anti-TT IgG levels and subclasses of mice after immunization with protein or conjugate of protein and group A meningococcal polysaccharide

2.2.3細(xì)胞因子IFNγ和IL-4產(chǎn)生情況PD與多糖結(jié)合誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞因子SFC數(shù)量高于TT與多糖結(jié)合；總體來看，與單獨多糖組相比，各多糖蛋白結(jié)合組在受相應(yīng)刺激后均能誘導(dǎo)產(chǎn)生IFNγ和IL-4，激發(fā)細(xì)胞免疫與體液免疫反應(yīng)。與GAMP-TT組相比，GAMP-PD組誘導(dǎo)的IFNγ SFC數(shù)量更高（F=7.853，P=0.026）。見圖1。

圖1 GAMP與各蛋白結(jié)合組免疫后小鼠體外經(jīng)不同刺激物刺激后的細(xì)胞因子產(chǎn)生情況Fig.1 Production of cytokines in mice immunized with conjugates of GAMP and various proteins after stimulation with different stimuli in vitro

2.2.4 小鼠脾細(xì)胞Th1和Th2亞群分析 與陰性對照組相比，GAMP-PD和GAMP-TT組的Th1／Th2比值大部分顯著升高（F=56.136，P分別為0.009和0.001）；與GAMP與GAMP-PD組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=17.389，P=0.507），但GAMPTT組顯著高于多糖組（F=17.389，P=0.01）。見表4。

表4 各組小鼠體外脾淋巴細(xì)胞Th1／Th2細(xì)胞亞群比值Tab.4 Ratios of Th1／Th2 subsets in spleen cells of mice in various groups

3 討論

細(xì)菌的莢膜多糖為TI抗原，具有多個重復(fù)的B細(xì)胞表位，免疫原性弱，直接激活B細(xì)胞產(chǎn)生抗體，無需Th細(xì)胞的輔助。TI抗原刺激B細(xì)胞產(chǎn)生的體液免疫應(yīng)答一般不發(fā)生抗體同種型轉(zhuǎn)換，僅產(chǎn)生IgM類抗體，且無免疫記憶，不能刺激T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答［19］。這些缺點使細(xì)菌多糖疫苗的應(yīng)用受到限制，為此，研究者將蛋白載體與多糖通過化學(xué)方式結(jié)合，使多糖的TI抗原性質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)門D抗原，既能激活B細(xì)胞，又能激活T細(xì)胞，且具有免疫記憶。本文主要研究以流感嗜血桿菌PD作為腦膜炎球菌多糖疫苗蛋白載體的可行性。

本研究中蛋白與多糖的活化方法為1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟硼酸（1-cyano-4-dimethylamino pyridinium tetrafluoroborate，CDAP）法。此方法最大的優(yōu)點是可使反應(yīng)在更溫和的條件下進行，反應(yīng)的pH條件較溴化氰活化法范圍更廣，可在弱堿性條件下完成，減少強堿條件下對多糖結(jié)構(gòu)或抗原表位的破壞。此外，CDAP活化法可不需使用連接臂直接將活化的多糖與載體蛋白相連［16-17］。

PD顯著增強與之結(jié)合的多糖的免疫原性，對A群多糖的免疫增強作用較明顯。A群多糖與PD和TT蛋白結(jié)合組均檢測到IgG1和IgG2a，且前者顯著高于后者；而單獨GAMP組IgG1和IgG2a的A值均低于PBS對照組A值的2.1倍。表明PD與A群多糖結(jié)合后能顯著增強多糖的免疫原性，產(chǎn)生免疫記憶，抗體類型發(fā)生轉(zhuǎn)換，與GAMP-TT組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。抗蛋白抗體檢測結(jié)果顯示，與單獨蛋白組比較，蛋白與A群多糖結(jié)合后，其自身免疫原性均受到一定程度的限制，尤其TT蛋白抗體，幾乎檢測不到，這種現(xiàn)象在文獻中也有報道［20-21］。表明對某些蛋白來說，與多糖結(jié)合后會或多或少抑制蛋白的免疫原性，可能在結(jié)合過程中多糖遮蓋了蛋白的抗原表位［22-23］；也可能是蛋白在與多糖結(jié)合時發(fā)生了構(gòu)象變化，使免疫原性減弱；對于TT來說，還有一種可能是TT在化學(xué)脫毒過程中破壞了T細(xì)胞表位，影響其免疫原性［24］，具體原因尚需確證。

ELISPOT細(xì)胞因子檢測結(jié)果提示，PD與多糖的結(jié)合能激活機體的細(xì)胞免疫反應(yīng)，但流式檢測Th1／Th2比值與單獨多糖組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），流式細(xì)胞術(shù)與ELISPOT技術(shù)相比，其敏感性相對較差，有待于進一步實驗確證。

綜上所述，PD與多糖結(jié)合后能增強多糖的免疫原性，使其由TI抗原轉(zhuǎn)換為TD抗原，誘導(dǎo)抗體類型發(fā)生轉(zhuǎn)換，產(chǎn)生免疫記憶，提高了體液免疫反應(yīng)的能力，又能激發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)，提示PD具備作為腦膜炎奈瑟菌多糖蛋白載體應(yīng)用的潛力。