尚曉麟，孟瑞榮，王穎

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，內(nèi)蒙古呼和浩特010059

川崎病（Kawasaki disease）是一種以中小動脈炎癥病變?yōu)橹饕±砀淖兊淖陨砻庖咝匝苎拙C合征，是以全身血管炎癥為主要病變特征的小兒疾?。?-2］。1，25-二羥維生素D3［1，25（OH）2D3］的生物活性作用是通過結(jié)合和激活其胞內(nèi)特異維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）實現(xiàn)的［3］。Wnt／β-catenin通路對機體細胞的增殖、分化和凋亡均具有重要調(diào)節(jié)作用。MicroRNAs（miRNAs）是一類由20~25個核苷酸構(gòu)成的單鏈非編碼RNA，能夠不完全互補于mRNA 3′端的非編碼區(qū)，從而抑制靶mRNA的翻譯或促進靶mRNA的裂解，多種miRNA表達的失調(diào)與Wnt密切相關(guān)［4-6］。miR-154可使Wnt／β-catenin通路激活，而miR-154對Wnt／β-catenin通路的調(diào)控作用在T細胞增殖中的作用尚需進一步研究。

本文就1，25（OH）2D3對T細胞抑制增殖作用的Wnt機制及miR-154的表達進行研究。

1 材料與方法

1.1 樣本 采集2015年1月—2017年4月在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院就診的川崎病患兒靜脈血40份，作為實驗組，設(shè)對照組（該院體檢健康兒童20名）。所有人員均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及儀器1，25（OH）2D3、Facollin液購自美國Sigma公司；1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；蛋白提取試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人Wnt、β-catenin、GAPDH多抗及堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG購自美國CST公司；定量PCR試劑盒（批號：SIGS0002861-1）購自廣州銳博生物科技有限公司；ECL試劑盒、酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；T細胞分離柱、T細胞過濾柱購自美國RD公司。

1.3 外周血T細胞的分離 采用T細胞分離柱分離外周血T細胞，將2倍血液體積的Facollin液加至血液中，1 500×g離心15 min；收集中間部分的絮狀物，PBS洗滌1次，用2 mL紅細胞裂解液裂解紅細胞，1 000×g離心5 min；棄上清，將細胞加至T細胞過濾柱中，靜置15 min；加入洗液8 mL，800×g離心2 min；收集細胞。

1.4 T細胞的體外培養(yǎng) 用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基37℃，5% CO2培養(yǎng)24 h。

1.5 不同濃度1，25（OH）2D3對T細胞增殖作用影響的檢測 采用MTT法。制備T細胞懸液，將其加至96孔板中，100 μL／孔，37℃培養(yǎng)；換1次液后，分別加入不同濃度（0、10-1、10-2、10-3、10-4和10-5μmol／L）1，25（OH）2D3，每個濃度設(shè)5個復(fù)孔，作用24 h；加入50 μL MTT，作用4 h；棄孔內(nèi)液體，加入DMSO，100 μL／孔，于酶標(biāo)儀490 nm波長處測定A值，并按下式計算細胞增殖抑制率。

細胞增殖抑制率（%）=（A藥物／A對照）×100%

1.6 實驗分組 共分為3組。1，25（OH）2D3組：將最佳1，25（OH）2D3濃度作用于川崎病患兒T細胞；川崎病組：川崎病患兒T細胞；對照組：健康兒童T細胞。

1.7 1，25（OH）2D3對T細胞Wnt通路影響的檢測采用Western blot法。用總濃度為10-3μmol／L的1，25（OH）2D3作用于T細胞，分別于0、30和60 min收集細胞，PBS洗滌3次，每管加入含PMSF的裂解液裂解30 min，用蛋白提取試劑盒提取T細胞蛋白。將蛋白樣品與等體積上樣緩沖液混合，100℃水浴5 min，經(jīng)12% SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至NC膜上，以GAPDH為內(nèi)參，加入兔抗人多抗（Wnt：1∶800稀釋；β-catenin：1∶600稀釋；GAPDH：1∶900稀釋），4℃過夜；PBST洗滌2次，每次10 min，PBS洗滌1次，10 min，加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（1∶2 000稀釋），室溫振蕩孵育1 h；PBST洗滌2次，每次10 min，PBS洗滌1次，10 min，將ECL試劑盒中兩種底物液按1∶1比例混合，滴加至NC膜的蛋白面上作用2 min，拍照。試驗重復(fù)5次。

1.8 1，25（OH）2D3對miR-154表達量影響的檢測采用定量PCR法。用總濃度為10-3μmol／L的1，25（OH）2D3作用于T細胞，分別于0、30和60 min收集細胞，檢測miR-154的表達量，具體操作按定量PCR試劑盒說明書進行。miR-154上游引物序列：5′-CACTCCAGCTGGGAATCATACACGGTTGA-3′，下游引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG-3′；引物由廣州銳博生物科技有限公司合成。反應(yīng)條件為：95℃30 s，95℃10 s，60℃30 s，共40個循環(huán)。試驗重復(fù)5次。

2 結(jié)果

2.1 1，25（OH）2D3對T細胞增殖作用的影響MTT法檢測結(jié)果顯示，從加入1，25（OH）2D3開始，細胞增殖抑制率逐漸降低，10-3μmol／L 1，25（OH）2D3對T細胞增殖抑制作用最強，為（98.05±0.37）%，見表1。

表1 不同濃度1，25（OH）2D3作用于T細胞24 h的細胞增殖抑制率（%，±s，n=5）Tab.1 Inhibitory rates of T cells treated with 1，25（OH）2D3 at various concentrations for 24 h（%，±s，n=5）

表1 不同濃度1，25（OH）2D3作用于T細胞24 h的細胞增殖抑制率（%，±s，n=5）Tab.1 Inhibitory rates of T cells treated with 1，25（OH）2D3 at various concentrations for 24 h（%，±s，n=5）

注：a表示與0 μmol／L 1，25（OH）2D3組比較，P＜0.05；b表示與10-1 μmol／L 1，25（OH）2D3組比較，P＜0.05；c表示與10-2 μmol／L 1，25（OH）2D3組比較，P＜0.05。

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2.2 1，25（OH）2D3對T細胞Wnt通路的影響Western blot分析顯示，川崎病組T細胞Wnt和β-catenin的表達基本無變化，且明顯高于對照組（FWnt分別為11.24和14.68，F(xiàn)β-catenin分別為13.42和15.17，P均＜0.05）。1，25（OH）2D3作用30、60 min后，Wnt和βcatenin表達明顯降低，與川崎病組和對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（FWnt分別為12.4和14.6，F(xiàn)β-catenin分別為16.1和13.5，P均＜0.05）。見圖1和圖2。

圖1 Western blot分析10-3 μmol／L 1，25（OH）2D3作用T細胞不同時間Wnt（A）和β-catenin（B）的表達情況Fig.1 Western blotting of expressions of Wnt（A）and βcatenin（B）in T cells treated with 10-3 μmol／L 1，25（OH）2D3 for various minutes

圖2 10-3 μmol／L 1，25（OH）2D3作用T細胞不同時間對Wnt（A）及β-catenin（B）表達的影響Fig.2 Effect of treatment of T cells with 10-3 μmol／L 1，25（OH）2D3 for various minutes on expressions of Wnt（A）and β-catenin（B）

2.3 1，25（OH）2D3對T細胞miR-154表達量的影響PCR檢測結(jié)果表明，加入10-3μmol／L 1，25（OH）2D3后，隨作用時間延長，miR-154表達量逐漸降低（F30vs0為12.34，F(xiàn)60vs0為17.14，F(xiàn)60vs30為15.2；P均＜0.05）；而川崎病組miR-154表達量基本無變化，且明顯高于對照組（F分別為4.2、3.37和3.14，P均＞0.05）。見表2。

表2 PCR法檢測1，25（OH）2D3對T細胞miR-154表達量的影響（±s，n=5）Tab.2 Determination of effect of 1，25（OH）2D3 on miR-154 expression level in T cells by PCR（±s，n=5）

表2 PCR法檢測1，25（OH）2D3對T細胞miR-154表達量的影響（±s，n=5）Tab.2 Determination of effect of 1，25（OH）2D3 on miR-154 expression level in T cells by PCR（±s，n=5）

注：a表示與0 min比較，P＜0.05；b表示與30 min比較，P＜0.05。

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3 討論

川崎病是一種常見的免疫性兒科疾病。近年該病發(fā)生率呈上升趨勢，已取代風(fēng)濕病成為引起兒童后天性心臟病的主要疾病，嚴(yán)重威脅患者生命安全［7-8］。1，25（OH）2D3的生物活性作用是通過結(jié)合和激活其胞內(nèi)特異維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）實現(xiàn)的［3］。在川崎病治療中，1，25（OH）2D3具有重要作用。有學(xué)者報道將白細胞與1，25（OH）2D3共溫育，發(fā)現(xiàn)這種激素使殺傷性T細胞失活［7，9-10］。在本研究中，用總濃度10-3μmol／L的1，25（OH）2D3作用于T細胞后，Western blot分析結(jié)果表明，Wnt和β-catenin隨時間延長表達量逐漸降低，而miR-154表達量也逐漸降低。表明1，25（OH）2D3對T細胞生長的抑制作用是通過抑制Wnt、β-catenin及miR-154的表達量來實現(xiàn)的。有研究表明，氯化鋰對T細胞的細胞周期和細胞增殖有明顯的抑制作用，這與抑制Wnt信號傳導(dǎo)通路有關(guān)［10-12］。本研究發(fā)現(xiàn)，1，25（OH）2D3具有與氯化鋰相似的作用，為1，25（OH）2D3的進一步研究奠定了基礎(chǔ)。