張生琰，吳元元，孫燕，劉鵬，孫振鵬，王革，李薇

蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司中試研究室

甘肅省疫苗工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州730046

犬腎上皮（Madin-Darby canine kidney，MDCK）細(xì)胞MDCK-siat7e是將人siat7e基因轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞后，經(jīng)懸浮馴化所獲得的適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系。MDCK-siat7e細(xì)胞克服了貼壁細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)困難、操作復(fù)雜、難以放大的缺點(diǎn)，能夠用于疫苗的研發(fā)及生產(chǎn)［1］。蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司應(yīng)用無(wú)血清無(wú)蛋白培養(yǎng)基cellhappy BD001（簡(jiǎn)稱BD001）培養(yǎng)MDCK-siat7e細(xì)胞，在優(yōu)化培養(yǎng)工藝的基礎(chǔ)上能夠獲得理想的細(xì)胞密度，有望用于流感疫苗的研發(fā)及生產(chǎn)［2］。MDCK-siat7e細(xì)胞在傳代培養(yǎng)的過(guò)程中有目的基因丟失的風(fēng)險(xiǎn)，這勢(shì)必會(huì)造成細(xì)胞種群異質(zhì)性的發(fā)生，使得細(xì)胞種群與起始細(xì)胞種群間存在差異，影響流感病毒在細(xì)胞上的易感性，另外還有成瘤性和致瘤性發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，影響流感疫苗的研發(fā)［3］。因此，MDCK-siat7e細(xì)胞如用于大規(guī)模流感疫苗生產(chǎn)，需建立穩(wěn)定的MDCKsiat7e細(xì)胞系，確定MDCK-siat7e細(xì)胞培養(yǎng)代次，才能為MDCK-siat7e細(xì)胞從搖瓶放大培養(yǎng)至規(guī)?；a(chǎn)提供依據(jù)，但目前相關(guān)MDCK-siat7e細(xì)胞傳代穩(wěn)定性方面的研究較少。

本研究從細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)曲線、生長(zhǎng)代謝、siat7e基因表達(dá)量、成瘤性和致瘤性等方面進(jìn)行了MDCKsiat7e細(xì)胞的傳代穩(wěn)定性研究，以期為MDCK-siat7e穩(wěn)定細(xì)胞系的建立及MDCK-siat7e細(xì)胞在規(guī)?；糯笾写蔚拇_立提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞MDCK-siat7e細(xì)胞由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health，NIH）惠贈(zèng)，由蘭州生物制品研究所第六研究室經(jīng)搖瓶馴化無(wú)血清懸浮培養(yǎng)后，建立細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑及儀器 無(wú)血清無(wú)蛋白培養(yǎng)基cellhappy BD001（簡(jiǎn)稱BD001）購(gòu)自甘肅健順生物科技有限公司；One Step SYBR PrimeScript RT-PCR kit購(gòu)自日本TaKaRa公司；RNeasy Mini kit購(gòu)自美國(guó)Qiagen公司；7500 Real time PCR system購(gòu)自美國(guó)ABI公司；Bioprofile 400生化分析儀購(gòu)自美國(guó)Nova Biomedical公司；CASY細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀購(gòu)自德國(guó)INNOVATIS公司。

1.3 MDCK-siat7e細(xì)胞的傳代培養(yǎng) 復(fù)蘇工作細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞活率＞95%時(shí)，按（0.8~1）×106個(gè)／mL接種至三角搖瓶，即為0代細(xì)胞，置37℃，5% CO2，20 r／min條件下培養(yǎng)。每日取樣檢測(cè)細(xì)胞密度及活率，每隔3~4 d傳代1次，連續(xù)傳代獲得7、17、28及45代細(xì)胞。

1.4 不同代次MDCK-siat7e細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況觀察及生長(zhǎng)曲線繪制 將0、7、17、28及45代MDCK-siat7e細(xì)胞在BD001培養(yǎng)基中按接種密度（0.7~1）×106個(gè)／mL進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：37℃，5% CO2濃度。連續(xù)培養(yǎng)9 d，培養(yǎng)期間不再添加培養(yǎng)基。每日取樣計(jì)數(shù)并檢測(cè)細(xì)胞活率。培養(yǎng)4 d時(shí)取樣，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，包括細(xì)胞形態(tài)、大小均勻性、是否聚團(tuán)等。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，活細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。

1.5 不同代次MDCK-siat7e細(xì)胞各生長(zhǎng)指標(biāo)及生化指標(biāo)的比較 計(jì)算并比較0、7、17、28及45代MDCKsiat7e細(xì)胞的比生長(zhǎng)速率（μ）、葡萄糖比消耗率［Qi（Gluc）24h］、乳酸比生成率［Qi（Lac）24h］及氨比生成率［Qi（NH4+）24h］。

1.6 45代MDCK-siat7e細(xì)胞的成瘤性及致瘤性檢測(cè) 委托中國(guó)食品藥品檢定研究院進(jìn)行45代MDCKsiat7e細(xì)胞的成瘤性和致瘤性檢測(cè)。依據(jù)《中國(guó)藥典》三部（2015版）中《生物制品生產(chǎn)檢定用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程》中相關(guān)規(guī)定，采用裸鼠體內(nèi)接種法檢測(cè)MDCK-siat7e細(xì)胞的成瘤性；采用細(xì)胞裂解物裸鼠體內(nèi)接種法和細(xì)胞DNA裸鼠體內(nèi)接種法檢測(cè)MDCK-siat7e細(xì)胞的致瘤性。

1.7 不同代次MDCK-siat7e細(xì)胞中siat7e基因表達(dá)量的比較 采用qRT-PCR法，具體參考文獻(xiàn)［4］進(jìn)行。取細(xì)胞密度為1×106個(gè)／mL、細(xì)胞活率＞95%的0、7、17、28及45代MDCK-siat7e細(xì)胞，用RNeasy Mini kit提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)提取RNA的純度及濃度，-80℃凍存?zhèn)溆?。上游引物序列?′-ATGAAGACCCTGCGCC-3′，下游引物序列：5′-TTAGAACACAGGTTTATTCTCAGG-3′，擴(kuò)增片段大小為1 010 bp。引物設(shè)計(jì)及合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。以不同代次的MDCK-siat7e細(xì)胞同一濃度的RNA為模板，采用One Step SYBR PrimeScript RTPCR kit檢測(cè)siat7e基因表達(dá)量。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸10 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。以DEPC水為空白，GAPDH基因作為內(nèi)參基因，采用△△Ct法按下式計(jì)算各代次細(xì)胞中siat7e基因表達(dá)量的相對(duì)倍數(shù)，即目的基因的量（2-△△Ct）。

△△Ct=（實(shí)驗(yàn)組目的基因Ct-實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參基因Ct）-（對(duì)照組目的基因Ct-對(duì)照組內(nèi)參基因Ct）

1.8 細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞活率檢測(cè) 應(yīng)用CASY細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。按下式計(jì)算細(xì)胞比生長(zhǎng)速率（μ），即細(xì)胞生長(zhǎng)速率與培養(yǎng)基中細(xì)胞密度之比［5］。

式中t為培養(yǎng)時(shí)間（d），tn和tn+1分別表示試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)間（d）；μtn+1為細(xì)胞在tn+1時(shí)刻的比生長(zhǎng)速率（d-1）；Xtn和Xtn+1分別為tn和tn+1時(shí)刻的活細(xì)胞密度（個(gè)／mL）。

1.9 葡萄糖、乳酸、氨含量檢測(cè) 應(yīng)用生化分析儀進(jìn)行檢測(cè)。計(jì)算營(yíng)養(yǎng)物（葡萄糖）的比消耗率［Qi（Gluc）24h］和副產(chǎn)物乳酸［Qi（Lac）24h］和氨的比生成率［Qi（NH4+）24h］［6］。

營(yíng)養(yǎng)物（葡萄糖）的比消耗率，表示單位細(xì)胞在單位時(shí)間內(nèi)消耗的營(yíng)養(yǎng)物的量，按下式計(jì)算。

式中P表示營(yíng)養(yǎng)物；CP表示營(yíng)養(yǎng)物濃度（mmol／L），Cp，tn和Cp，tn+1分別為tn和tn+1時(shí)刻營(yíng)養(yǎng)物濃度（mmol／L）；Qp，tn+1表示在tn+1時(shí)刻營(yíng)養(yǎng)物的比消耗速率［mmol／（L·h）］。

副產(chǎn)物（乳酸、氨）的比生成速率，表示單位細(xì)胞在單位時(shí)間內(nèi)生成的代謝副產(chǎn)物的量，按下式計(jì)算。

式中P表示副產(chǎn)物；CP表示副產(chǎn)物濃度（mmol／L），Cp，tn+1和Cp，tn分別為tn和tn+1時(shí)刻副產(chǎn)物濃度（mmol／L）；Qp，tn+1表示在tn+1時(shí)刻副產(chǎn)物的比生成速率［mmol／（L·h）］。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用F檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同代次MDCK-siat7e細(xì)胞的形態(tài)觀察 顯微鏡下觀察顯示，5個(gè)不同代次的MDCK-siat7e細(xì)胞均呈圓形，細(xì)胞邊緣清晰，細(xì)胞均勻分散于培養(yǎng)液中，無(wú)聚團(tuán)現(xiàn)象，呈懸浮生長(zhǎng)狀態(tài)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。見(jiàn)圖1。

圖1 不同代次MDCK-siat7e細(xì)胞的形態(tài)觀察（×40）Fig.1 Morphologies of MDCK-siat7e cells of various passages（×40）

2.2 不同代次MDCK-siat7e細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的比較0、7、17、28及45代MDCK-siat7e細(xì)胞按相同密度接種后，經(jīng)1~2 h的停滯期后進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，細(xì)胞在培養(yǎng)基中懸浮增殖，以指數(shù)方式生長(zhǎng)，細(xì)胞濃度達(dá)6.5×106個(gè)／mL，呈極高的活力，存活率至少為95%，細(xì)胞培養(yǎng)后期仍呈單個(gè)懸浮生長(zhǎng)狀況，生長(zhǎng)至后期細(xì)胞活率逐漸下降。見(jiàn)圖2和圖3。

圖2 不同代次MDCK-siat7e細(xì)胞的增殖曲線Fig.2 Growth curve of MDCK-siat7e cells of various passages

圖3 不同代次MDCK-siat7e細(xì)胞的活率Fig.3 Survival rates of MDCK-siat7e cells of various passages

2.3 不同代次MDCK-siat7e細(xì)胞各生長(zhǎng)指標(biāo)及生化指標(biāo)的比較 不同代次MDCK-siat7e細(xì)胞的μ、Qi（Gluc）24h、Qi（Lac）24h及Qi（NH4+）24h差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表1。

表1 不同代次MDCK-siat7e細(xì)胞各生長(zhǎng)指標(biāo)和生化指標(biāo)（±s，n=9）Tab.1 Growth and biochemical indexes of MDCK-siat7e cells of various passages（±s，n=9）

表1 不同代次MDCK-siat7e細(xì)胞各生長(zhǎng)指標(biāo)和生化指標(biāo)（±s，n=9）Tab.1 Growth and biochemical indexes of MDCK-siat7e cells of various passages（±s，n=9）

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2.4 45代MDCK-siat7e細(xì)胞的成瘤性和致瘤性裸鼠體內(nèi)接種法成瘤性檢測(cè)結(jié)果顯示，10只裸鼠中有1只裸鼠的肺部可見(jiàn)0.2 cm×0.2 cm結(jié)節(jié)，心、肝、脾、腎、淋巴結(jié)等其余主要臟器未見(jiàn)結(jié)節(jié)，其余9只裸鼠心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)等主要臟器未見(jiàn)結(jié)節(jié)；10只裸鼠中僅1只裸鼠肺組織可見(jiàn)轉(zhuǎn)移瘤，瘤組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞形態(tài)清晰，細(xì)胞異型性明顯，局部區(qū)域可見(jiàn)瘤栓形成，與陰性對(duì)照相比，該只裸鼠心、肝、脾、腎、淋巴結(jié)病理改變無(wú)明顯差異；其余9只裸鼠與陰性對(duì)照相比，心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)病理改變無(wú)明顯差異。

細(xì)胞裂解物裸鼠體內(nèi)接種法和細(xì)胞DNA裸鼠體內(nèi)接種法致瘤性檢測(cè)結(jié)果顯示，裸鼠心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)等主要臟器未見(jiàn)結(jié)節(jié)，且與陰性對(duì)照相比，心、肝、脾、肺、腎、淋巴結(jié)組織病理改變無(wú)明顯差異。

2.5 不同代次MDCK-siat7e細(xì)胞中siat7e基因表達(dá)量 不同代次MDCK-siat7e細(xì)胞siat7e基因表達(dá)量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2。

表2 不同代次MDCK-siat7e細(xì)胞siat7e基因表達(dá)量的比較（±s，n=3）Tab.2 Expression levels of siat7e gene in MDCK-siat7e cells of various passages（±s，n=3）

表2 不同代次MDCK-siat7e細(xì)胞siat7e基因表達(dá)量的比較（±s，n=3）Tab.2 Expression levels of siat7e gene in MDCK-siat7e cells of various passages（±s，n=3）

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3 討論

MDCK細(xì)胞是常見(jiàn)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，廣泛用于人用和獸用疫苗的研發(fā)及生產(chǎn)，具有培養(yǎng)簡(jiǎn)單、增殖速度快、易感病毒、病毒產(chǎn)量高的特點(diǎn)，其在流感疫苗的研發(fā)中擴(kuò)增的流感病毒與原始流感病毒株高度相似，且免疫效果相近［7］。siat7e基因編碼α-2，6唾液酸轉(zhuǎn)移酶，調(diào)控細(xì)胞的貼壁性，其表達(dá)水平越高，細(xì)胞黏附性越低［8］。人siat7e基因轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，經(jīng)過(guò)懸浮馴化后獲得MDCK-siat7e細(xì)胞系，應(yīng)用生物反應(yīng)器大規(guī)模懸浮培養(yǎng)有望成為疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞基質(zhì)［9］。蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司應(yīng)用無(wú)血清無(wú)蛋白培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCK-siat7e細(xì)胞，該培養(yǎng)基無(wú)動(dòng)物源性成分，培養(yǎng)基成分明確，消除了動(dòng)物源性成分在細(xì)胞培養(yǎng)中產(chǎn)生的不確定性，也明顯減輕了下游純化工藝的負(fù)擔(dān)，有助于最終產(chǎn)品質(zhì)量的提高［10］。

在前期研究中，蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司已能夠應(yīng)用無(wú)血清無(wú)蛋白培養(yǎng)基培養(yǎng)MDCKsiat7e細(xì)胞用于流感疫苗的研發(fā)，且獲得了較高的細(xì)胞密度，而MDCK-siat7e細(xì)胞在無(wú)血清無(wú)蛋白培養(yǎng)基中傳代穩(wěn)定性方面的研究尚缺乏研究數(shù)據(jù)。《中國(guó)藥典》三部（2015版）中《生物制品生產(chǎn)檢定用動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)程》中明確規(guī)定，要對(duì)人用生物制品生產(chǎn)／檢定用的動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)進(jìn)行穩(wěn)定性檢查［11］。MDCK-siat7e細(xì)胞株的穩(wěn)定性在工業(yè)化生產(chǎn)中對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性具有重要作用［12］。因此，本文開(kāi)展了MDCK-siat7e細(xì)胞的傳代穩(wěn)定性研究。

本研究結(jié)果顯示，0、7、17、28及45代MDCKsiat7e細(xì)胞在培養(yǎng)4 d時(shí)均呈圓形，細(xì)胞邊緣清晰，均勻分散于培養(yǎng)液中，無(wú)聚團(tuán)現(xiàn)象，呈懸浮生長(zhǎng)狀態(tài)，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。5個(gè)不同代次細(xì)胞均按照相同密度接種，經(jīng)過(guò)1~2 h停滯期后均進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和活率、μ均有較好的吻合，無(wú)明顯變化；培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞代謝指標(biāo)Qi（Gluc）24h、Qi（Lac）24h及Qi（NH4+）24h也無(wú)明顯差異。不同代次MDCK-siat7e細(xì)胞的siat7e基因表達(dá)量也無(wú)明顯差異。MDCK-siat7e細(xì)胞連續(xù)傳代至45代后無(wú)致瘤性，但有成瘤性的風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，MDCK-siat7e細(xì)胞的傳代穩(wěn)定性較好，在規(guī)?；糯笈囵B(yǎng)中即使細(xì)胞代次有大的變化，但只要在45代范圍內(nèi)，細(xì)胞傳代穩(wěn)定性均良好。本研究為流感疫苗的開(kāi)發(fā)、規(guī)模放大、制定細(xì)胞傳代限定代次等提供了參考，但需要關(guān)注高代次細(xì)胞成瘤性的風(fēng)險(xiǎn)。