周振歆，易力，張晗，趙勇，楊驕雪，王丹丹，苗睿，張玉平，董少忠

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明650031

腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）是導(dǎo)致兒童及嬰幼兒手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）重癥和死亡病例的主要病原體［1-2］。過去40余年，HFMD在歐洲、美洲及亞太地區(qū)暴發(fā)流行，2008—2014年間，我國(guó)兒童HFMD患者超過1 200萬例，死亡約3 200例，對(duì)兒童及嬰幼兒生命健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅［3-5］。由于尚無明確治療HFMD的藥物上市，疫苗仍是控制HFMD流行的主要手段［6-7］。EV71滅活疫苗自2015在中國(guó)獲批上市，顯示出良好的有效性及安全性［8-10］，保護(hù)率達(dá)90%以上，且免疫后第2年保護(hù)力仍較高［11-12］。

根據(jù)國(guó)家藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)的企業(yè)注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)，EV71滅活疫苗的效力試驗(yàn)包括體外相對(duì)效力試驗(yàn)和體內(nèi)效力試驗(yàn)，體外相對(duì)效力試驗(yàn)為抗原含量測(cè)定，體內(nèi)效力試驗(yàn)包括ED50效力試驗(yàn)和中和抗體效價(jià)測(cè)定。體內(nèi)相對(duì)效力試驗(yàn)操作周期長(zhǎng)，檢測(cè)結(jié)果受試驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體差異的影響較大，且受動(dòng)物倫理的約束，因此，用簡(jiǎn)便有效的體外相對(duì)效力試驗(yàn)替代體內(nèi)相對(duì)效力試驗(yàn)顯得尤為重要，建立替代方法的基礎(chǔ)是疫苗生物活性成分含量與免疫效果是否具有相關(guān)性［13］。本實(shí)驗(yàn)以EV71滅活疫苗上市以后一個(gè)自然年內(nèi)生產(chǎn)的62批EV71滅活疫苗成品為研究對(duì)象，對(duì)其進(jìn)行抗原含量、半效稀釋倍數(shù)、ED50效力、中和抗體效價(jià)檢測(cè)，并對(duì)抗原含量與半效稀釋倍數(shù)、抗原含量與ED50效力、抗原含量與中和抗體效價(jià)、ED50效力與中和抗體效價(jià)之間的相關(guān)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 供試品及標(biāo)準(zhǔn)品 供試品為中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所EV71滅活疫苗上市以后一個(gè)自然年內(nèi)生產(chǎn)的62批EV71滅活疫苗成品（完成企業(yè)自檢，并取得批簽發(fā)合格證）；EV71抗原標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

1.2 細(xì)胞及病毒RD細(xì)胞購自ATCC；EV71 FY-523毒株由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；EV71滅活病毒液由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所制備。

1.3 主要試劑TritonX-100、二乙醇胺及0.05%的聚山梨酯20購自美國(guó)Sigma公司；顯色A液（TMB溶液）、B液（醋酸緩沖液）購自美國(guó)Seracare-KPL公司；酶結(jié)合物（親和素標(biāo)記的HRP）購自美國(guó)Thermo Fisher公司；EV71抗原檢測(cè)板（包被兔抗EV71多克隆抗體）、生物素標(biāo)記的EV71抗體、PBS（0.01 mol／L，pH 7.4±0.2）、2 mol／L H2SO4及0.35 mg／mL Al（OH）3均由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所制備。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)BALB／c小鼠，35～42日齡，體重18～22 g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為：SCXK（滇）K2014-0002。

1.5 抗原含量的檢測(cè) 用PBS對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和解離后的供試品（采用TritonX-100和二乙醇胺對(duì)供試品進(jìn)行解離）進(jìn)行2倍系列稀釋，取5～8個(gè)稀釋度，加入至EV71抗原檢測(cè)板，每個(gè)稀釋度設(shè)2個(gè)復(fù)孔，100 μL／孔，同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照（EV71滅活病毒液）、陰性對(duì)照（PBS）及空白對(duì)照，（37±1）℃孵育1 h；洗滌液（含0.05%聚山梨酯20的PBS）洗滌5次，加入生物素標(biāo)記的EV71抗體，100 μL／孔，（37±1）℃孵育1 h；洗滌液洗滌5次，加入顯色液A、B液，均50 μL／孔，37℃避光顯色10 min；加入終止液（2 mol／L H2SO4），50 μL／孔，終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀檢測(cè)A450值。采用量反應(yīng)平行線測(cè)定法計(jì)算抗原含量［14］，單位以U／mL進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.6 ED50效力試驗(yàn) 用0.35 mg／mL Al（OH）3將供試品分別按1∶16、1∶32、1∶64稀釋，經(jīng)腹腔接種小鼠，1.0mL／只，每個(gè)稀釋度10只，接種28 d，經(jīng)眼球或心臟采血，分離血清。將血清稀釋為1∶4～1∶16，加入EV71 FY-523，50 μL／孔（劑量為100 CCID50／孔），同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照（100 μL稀釋液）、血清對(duì)照（50 μL供試品血清+50 μL稀釋液）和病毒對(duì)照（50 μL EV71 FY-523+50 μL稀釋液），均設(shè)2個(gè)復(fù)孔，37℃中和2 h；加入RD細(xì)胞懸液，100 μL／孔，（37±0.5）℃培養(yǎng)7 d。以1∶8血清稀釋度供試品孔細(xì)胞未發(fā)生病變判為EV71中和抗體陽性，并按下式（Reed-Muench法）計(jì)算半效稀釋倍數(shù)，ED50效力為抗原含量與半效稀釋倍數(shù)的比值，單位以U／mL統(tǒng)計(jì)。

半效稀釋倍數(shù)=lg-1［lg大于50%陽轉(zhuǎn)率稀釋度+（大于50%陽轉(zhuǎn)率-50%）／（大于50%陽轉(zhuǎn)率-小于50%陽轉(zhuǎn)率）×lg2］

1.7 中和抗體效價(jià)的檢測(cè) 將原倍供試品經(jīng)腹腔注射小鼠，0.5 mL／只，接種后28 d，經(jīng)眼球或心臟采血，分離血清。將抗體稀釋為1∶4～1∶512，其他檢測(cè)步驟同1.6項(xiàng)。以1∶8血清稀釋度供試品孔細(xì)胞未發(fā)生病變判為EV71中和抗體陽性，反之判為陰性，計(jì)算中和抗體GMT值，以GMT值除以8作為1個(gè)效力單位，單位以EU統(tǒng)計(jì)。

1.8 相關(guān)性分析 將62批EV71滅活疫苗的抗原含量與半效稀釋倍數(shù)、ED50效力、中和抗體效價(jià)進(jìn)行相關(guān)性分析；同時(shí)，將62批EV71滅活疫苗的ED50效力與中和抗體效價(jià)進(jìn)行相關(guān)性分析。應(yīng)用SPSS 20軟件統(tǒng)計(jì)抗原含量、半效稀釋倍數(shù)、ED50效力、中和抗體效價(jià)的正態(tài)分布情況，再進(jìn)行Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并繪制相關(guān)性散點(diǎn)圖。

2 結(jié)果

2.1 抗原含量、半效稀釋倍數(shù)、ED50效力、中和抗體效價(jià)的檢測(cè)62批EV71滅活疫苗成品抗原含量、半效稀釋倍數(shù)、ED50效力、中和抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果均服從正態(tài)分布?？乖繛?00～320 U／mL，均值為248.645U／mL，標(biāo)準(zhǔn)差為26.530 0 U／mL；半效稀釋倍數(shù)為13.8～26.7，均值為18.960，標(biāo)準(zhǔn)差為2.521 1；ED50效力為5.1～7.8 U／mL，均值為6.606 U／mL，標(biāo)準(zhǔn)差為0.608 4 EU；中和抗體效價(jià)為3.5～7.4 EU，均值為5.345 EU、標(biāo)準(zhǔn)差為0.883 5 EU。

2.2 相關(guān)性分析

2.2.1 抗原含量與半效稀釋倍數(shù)的相關(guān)性62批EV71滅活疫苗抗原含量與半效稀釋倍數(shù)呈良好正相關(guān)（r=0.711，P＜0.01），見圖1。

圖1 EV71滅活疫苗抗原含量與半效稀釋倍數(shù)相關(guān)性的散點(diǎn)圖Fig.1 Scatter diagram of antigen content and median effective dilution factor of inactivated EV71 vaccine

2.2.2 抗原含量與ED50效力的相關(guān)性62批EV71滅活疫苗抗原含量與ED50效力無相關(guān)性（r=0.131，P＞0.05），見圖2。

圖2 EV71滅活疫苗抗原含量與ED50效力相關(guān)性的散點(diǎn)圖Fig.2 Scatter diagram of antigen content and ED50 potency of inactivated EV71 vaccine

2.2.3 抗原含量與中和抗體效價(jià)的相關(guān)性62批EV71滅活疫苗抗原含量與中和抗體效價(jià)呈良好正相關(guān)（r=0.388，P＜0.01），見圖3。

圖3 EV71滅活疫苗抗原含量與中和抗體效價(jià)相關(guān)性的散點(diǎn)圖Fig.3 Scatter diagram of antigen content and neutralizing antibody titer of inactivated EV71 vaccine

2.2.4 ED50效力與中和抗體效價(jià)的相關(guān)性62批EV71滅活疫苗ED50效力與中和抗體效價(jià)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.356，P＜0.01），見圖4。

圖4 EV71滅活疫苗ED50效力與中和抗體效價(jià)相關(guān)性的散點(diǎn)圖Fig.4 Scatter diagram of ED50 potency and neutralizing antibody titer of inactivated EV71 vaccine

3 討論

體外和體內(nèi)相對(duì)效力試驗(yàn)均可用于疫苗效力檢測(cè)。體外相對(duì)效力試驗(yàn)具有靈敏、特異、快捷、準(zhǔn)確等特點(diǎn)；體內(nèi)效力檢測(cè)需使用動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，其檢驗(yàn)時(shí)間較長(zhǎng)，易受動(dòng)物的種屬、窩別、年齡、性別、體重、健康狀況、飼養(yǎng)營(yíng)養(yǎng)及飼料環(huán)境等影響。根據(jù)WHO及國(guó)際生物制品標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)要求，盡量不使用動(dòng)物法進(jìn)行生物制品質(zhì)量檢定［15］，《中國(guó)藥典》三部（2005版）［16］也規(guī)定，應(yīng)盡量采用準(zhǔn)確可靠的化學(xué)、物理學(xué)或細(xì)胞學(xué)方法取代動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)行生物制品質(zhì)量檢定，以減少采用動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，該版《中國(guó)藥典》開始將重組酵母乙肝疫苗的體外抗原檢測(cè)替代體內(nèi)抗體檢測(cè)作為疫苗效價(jià)指標(biāo)。有研究基于同原理建立了滅活甲肝疫苗體外效力檢測(cè)方法［17］，并收錄至2005年后的各版《中國(guó)藥典》中。因此，用體外相對(duì)效力試驗(yàn)代替動(dòng)物體內(nèi)效力試驗(yàn)是必然趨勢(shì)［17］。

劉建生等［18］研究顯示，抗原免疫劑量與半效稀釋倍數(shù)之間存在良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系，半效稀釋倍數(shù)與抗原免疫劑量呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，62批EV71滅活疫苗的抗原含量與半效稀釋倍數(shù)呈良好正相關(guān)（P＜0.01）。二者結(jié)論相符，即抗原含量越高，其半效稀釋倍數(shù)越大；抗原含量越低，其半效稀釋倍數(shù)越小。但抗原含量變化的幅度或倍數(shù)與半效稀釋倍數(shù)變化的幅度或倍數(shù)并非完全一致，半效稀釋倍數(shù)的結(jié)果受試驗(yàn)過程中單只或少數(shù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量、敏感性波動(dòng)的影響較大，ED50效力為抗原含量與半效稀釋倍數(shù)的比值，因此，抗原含量與ED50效力可能出現(xiàn)正相關(guān)、負(fù)相關(guān)或不相關(guān)的情況。本研究中，抗原含量與ED50效力無相關(guān)性，符合試驗(yàn)特點(diǎn)、為合理結(jié)果。

韓金樂等［19］發(fā)現(xiàn)，的21株EV71抗原的特異比活與免疫血清中和抗體間存在強(qiáng)相關(guān)性；另外，毛群穎等［20］對(duì)免疫前抗體陰性的嬰幼兒免疫后的血清進(jìn)行中和抗體檢測(cè)，結(jié)果表明，EV71滅活疫苗免疫后呈良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。本研究結(jié)果表明，62批EV71滅活疫苗的抗原含量與中和抗體效價(jià)呈良好正相關(guān)（P＜0.01），與上述研究結(jié)果相符。

當(dāng)疫苗抗原含量一定的情況下，ED50效力越低，表明其半效稀釋倍數(shù)越大，試驗(yàn)動(dòng)物陽轉(zhuǎn)越高，疫苗免疫效果越好［21］，但對(duì)于中和抗體效價(jià)則相反，即中和抗體效價(jià)越高、疫苗保護(hù)效果越好［22］，因此，同批次疫苗，若ED50效力與中和抗體效價(jià)呈負(fù)相關(guān)，表明該疫苗的保護(hù)效果良好。本研究的結(jié)果顯示，62批EV71滅活疫苗成品的ED50效力與中和抗體效價(jià)呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），表明檢測(cè)的疫苗具有良好的免疫效果。

綜上所述，體外相對(duì)效力試驗(yàn)（抗原含量測(cè)定）替代體內(nèi)相對(duì)效力試驗(yàn)（ED50效力試驗(yàn)和中和抗體效價(jià)檢測(cè)）用于EV71滅活疫苗效力檢測(cè)具有可行性。