姜寧，郭禹汐，李春秋，蘇明俊，孔凡志，孫東波

黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院，黑龍江大慶163319

副流感病毒5型（parainfluenza virus 5，PIV5）為一種不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒，屬副黏病毒科（Paramyxoviridae）、副黏病毒亞科（Paramyxovirinae）、腮腺炎病毒屬（Rubulavirus）。1956年，PIV5作為原代猴腎細(xì)胞培養(yǎng)過程中的污染物被HULL等成功分離，隨后被命名為猴病毒5型（simian virus，SV5）。盡管最早于猴腎細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，但并無充分資料證明PIV5為猴源病毒［1］。因此，該病毒于2009年被國際分類委員會重新命名為PIV5，隨后又更名為哺乳動物腮腺炎病毒5型［2］。

PIV5病毒粒子直徑在50~200 nm之間，鏡下觀察多呈圓形或多形性。其基因組在副黏病毒中最小，長15 246 nt［3］。從3′到5′端分別為NP、V／P、M、F、SH、HN和L基因。目前PIV5廣泛存在于自然界，大量物種被證實(shí)為其宿主［4-6］。本研究對本實(shí)驗(yàn)室保存的一株豬源PIV5 SH毒株進(jìn)行全基因組測序及遺傳進(jìn)化分析，旨在豐富PIV5的分子生物學(xué)信息，為其后續(xù)研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病毒、載體及菌株P(guān)IV5-SH毒株由黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)豬病防制實(shí)驗(yàn)室保存；pGM-T載體購自天根生化科技（北京）有限公司；E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞購自博邁德生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑 病毒RNA提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；RNA酶抑制劑、dNTP、反轉(zhuǎn)錄酶和2×premix預(yù)混液購自近岸科技（上海）有限公司；Ex Taq超保真聚合酶、DNA marker DL2000和瓊脂糖購自TaKaRa生物技術(shù)（大連）有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank中登錄的豬源PIV5 KNU-11毒株（GenBank登錄號：KC852177）基因組序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)10對引物（表1），引物由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司合成。

表1 PIV5全基因組引物Tab.1 Primers for complete genome of PIV5

1.4 病毒基因組克隆及測序 用病毒RNA提取試劑盒提取病毒基因組RNA，使用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板擴(kuò)增各基因片段。PCR條件：94℃預(yù)變性1 min；94℃變性30 s，60℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。陽性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳切膠后，按照凝膠純化回收試劑盒說明書進(jìn)行回收純化?；厥占兓a(chǎn)物與pGM-T載體連接后轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。陽性質(zhì)粒送哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司測序。

1.5 序列分析及遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建 將PIV5-SH毒株全基因組測序，測序結(jié)果進(jìn)行拼接。拼接得到的病毒全基因組序列與GenBank中已登錄的其他PIV5參考毒株進(jìn)行序列比對及分析，應(yīng)用DNAStar 6.0軟件的MegAlign程序進(jìn)行毒株的序列同源性比對，并使用MEGA 6.06軟件中的NJ法進(jìn)行PIV5全基因組序列及NP、F及HN基因進(jìn)化樹構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 PIV5-SH毒株序列的同源性 測得的PIV5-SH毒株基因組序列遞交至GenBank，命名為SH／2015／1202（GenBank登錄號：MK028670）。PIV5-SH毒株全基因組長15 246 nt，長度符合副黏病毒六堿基原則。其基因組由3′引導(dǎo)序列（55 nt）、NP基因（1530 nt）、V／P基因（669／1 177 nt）、M基因（1 134 nt）、F基因（1 656 nt）、SH基因（135 nt）、HN基因（1 698 nt）、L基因（6 768 nt）和5′尾隨序列（31 nt）組成。病毒各基因之間由一段長短不一的間隔區(qū)（1~23 nt）連接，每個(gè)基因均有獨(dú)立的轉(zhuǎn)錄起始及終止序列，彼此互不重疊，編碼相應(yīng)的蛋白質(zhì)。其編碼產(chǎn)生的蛋白分別為核衣殼蛋白（nucleocapsid protein，NP）、V蛋白（v protein，V）、磷酸化蛋白（phosphoprotein，P）、膜基質(zhì)蛋白（matrix protein，M）、融合蛋白（fusion protein，F(xiàn)）、小疏水性蛋白（small hydrophobic protein，SH）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶（hemagglutinin-neuraminidase，HN）和聚合酶蛋白（RNA polymerase large protein，L）。

將測序得到的PIV5-SH毒株全基因組序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已登錄的其他PIV5參考株進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，PIV5-SH株與傳統(tǒng)毒株P(guān)IV5-W3A的NP、P、V、M、F、SH、HN和L基因的核苷酸序列同源性分別為99.2%、98.8%、98.5%、98.2%、98.7%、97.0%、98.4%、99.1%，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分別為99.2%、98.5%、98.2%、97.6%、98.3%、93.2%、97.5%、99.3%。將PIV5-SH株全基因組序列與腮腺炎病毒屬內(nèi)5株不同宿主來源的PIV5代表毒株序列進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，其與豬源PIV5-SER株核苷酸序列同源性較高，為99.0%；與BC-14（牛源）、W3A（細(xì)胞源）、H221（犬源）和MEL（人源）的核苷酸序列同源性分別為98.9%、98.7%、98.6%和98.0%。各基因核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸比對結(jié)果（表2）顯示，不同毒株NP基因核苷酸序列同源性在98.0%~99.5%之間，氨基酸序列同源性在99.4%~98.4%之間；F及HN基因核苷酸序列同源性分別在98.1%~99.2%、97.8%~99.3%之間，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分別在98.1%~98.5%和98.1%~98.9%之間。部分豬源及犬源PIV5毒株由于SH基因易發(fā)生突變，常導(dǎo)致SH蛋白無法正常合成。同源性分析結(jié)果顯示，PIV5-SH株并不存在這種情況，與W3A、H221、MEL 3株參考株SH基因的核苷酸序列同源性分別為97.0%、97.0%、96.3%。

表2 PIV5-SH毒株與參考毒株各基因序列同源性分析結(jié)果（%）Tab.2 Homology of gene sequence of PIV5-SH to that of reference strains（%）

2.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 基于獲取的PIV5-SH毒株全基因組序列，選擇GenBank中登錄的24株P(guān)IV5參考株構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，25株毒株形成GⅠ和GⅡ兩個(gè)群，見圖1。PIV5-SH毒株與韓國1株犬源PIV5（1168-1）、中國3株分別從孟加拉虎、東北虎及小熊貓?bào)w內(nèi)分離的PIV5毒株（PIV5-HMZ、PIV5-SR、PIV5 ZJQ-221）親緣關(guān)系較近，5株毒株形成獨(dú)立分支，同屬于GⅡ群，且與位于GⅡ群第4個(gè)分支的傳統(tǒng)毒株P(guān)IV5-W3A親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。選擇較為保守的NP基因與副黏病毒主要毒力基因F和HN分別構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，NP基因的遺傳進(jìn)化樹結(jié)果顯示，PIV5-SH株位于GⅡ群第4分支，與PIV5-HMZ、PIV5 CAN、PIV5 1168-1、PIV5-SR和PIV5 ZIQ-221毒株親緣關(guān)系近，見圖2；F及HN基因遺傳進(jìn)化樹結(jié)果與NP基因基本一致，見圖3和圖4。

圖1 PIV5全基因組系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of PIV based on complete genome

圖2 PIV5 NP基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of PIV5 based on NP gene

圖3 PIV5 F基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of PIV5 based on F gene

圖4 PIV5 HN基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of PIV5 based on HN gene

3 討論

1956年，PIV5作為細(xì)胞培養(yǎng)過程中的污染物被發(fā)現(xiàn)。一直以來，PIV5因其易污染培養(yǎng)基使得大量關(guān)于PIV5分離及致病性研究的報(bào)道屢遭質(zhì)疑。隨著反向遺傳學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PIV5因其感染方式直接、宿主范圍廣、遺傳相對穩(wěn)定、致病力低等特性備受關(guān)注，先后成為流感病毒、狂犬病病毒等重要病原的重組疫苗載體［7-13］。目前，PIV5廣泛存在于自然界，可引起多種動物感染。據(jù)報(bào)道，PIV5在豬群中有較高的感染率，但相關(guān)的分子生物學(xué)及流行病學(xué)資料仍十分有限［14-15］。本研究利用RT-PCR方法，測序得到PIV5-SH毒株全基因組序列，其基因組長15 246 nt，結(jié)構(gòu)式為3′-NP-V／P-M-F-SH-HN-L-5′。毒株的核苷酸數(shù)目、基因組結(jié)構(gòu)均符合副流感病毒基因組結(jié)構(gòu)特征。將PIV5-SH毒株基因組序列與其他PIV5代表毒株進(jìn)行同源性比對，結(jié)果顯示，這些PIV5毒株之間具有較高的同源性，核苷酸比對結(jié)果在98.0%~99.0%之間。且不同來源的分離株基因差異小，表現(xiàn)出一定的遺傳穩(wěn)定性。

2017年，ZHAI等［16］于廣州動物園一只臨床表現(xiàn)呼吸道癥狀的小熊貓?bào)w內(nèi)分離出PIV5 ZJQ-221毒株。隨后，PIV5-HMZ、PIV5-SR及PIV5 CAN毒株先后于該地區(qū)的孟加拉虎、東北虎及穿山甲體內(nèi)被分離?；谌蚪M構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹結(jié)果顯示，PIV5-SH毒株與PIV5 1168-1、PIV5-HMZ、PIV5-SR和PIV5 ZJQ-221毒株具有較近的親緣關(guān)系。以保守的NP基因構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，PIV5-SH與PIV5 1168-1、PIV5-HMZ、PIV5-SR、PIV5 CAN和PIV5 ZJQ-221毒株同位于GⅡ群，共同組成GⅡ群第4分支。顯示PIV5在不同動物之間存在廣泛流行傳播情況，其傳播受地理位置限制。在LEE等［15］報(bào)道，除肺臟外，PIV5于感染動物的淋巴結(jié)及小腸組織中均有存在。本研究中的PIV5-SH毒株亦分離于腹瀉豬腸組織樣品，為進(jìn)一步了解決定副黏病毒組織嗜性及致病力的毒力基因遺傳變異情況，分別以F、HN基因構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，其分析結(jié)果與NP基因基本一致，顯示PIV5在自然界中的遺傳具有高度保守性。本研究對一株豬源PIV5-SH毒株進(jìn)行病毒全基因組測序及遺傳進(jìn)化分析，序列比對及遺傳進(jìn)化樹分析結(jié)果顯示，PIV5-SH毒株與一株韓國犬源PIV5毒株1168-1及4株中國廣州地區(qū)分離的PIV5-HMZ、PIV5-SR、PIV5 CAN及PIV5 ZJQ-221毒株親緣關(guān)系近，且各毒株之間基因差異小，表現(xiàn)出一定的遺傳穩(wěn)定性。