龐麗然，賀丞，杜力，劉國芳

華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司，河北石家莊050015

藥用輔料是制劑的重要組成部分，其質(zhì)量和安全性直接影響制劑的有效性和安全性［1］。吐溫80是一種非離子型表面活性劑，可作為穩(wěn)定劑、分散劑、乳化劑或增溶劑等，多種重組蛋白藥物中均以吐溫80作為穩(wěn)定劑。國內(nèi)外均有報道吐溫80可導(dǎo)致嚴重的過敏反應(yīng)，也可產(chǎn)生呼吸困難、惡心、嘔吐、皮疹等不良反應(yīng)［2-3］。因此，測定吐溫80含量可為重組蛋白的臨床安全用藥提供參考，為其質(zhì)量評價提供依據(jù)。

吐溫80含量常用的檢測方法有硫氰酸鈷銨比色法、紫外光譜法、分子排阻-蒸發(fā)光散射法、氣相色譜法等［4］，《中國藥典》四部（2020版）收錄吐溫80含量的檢測方法為硫氰酸鈷銨比色法［5］，該方法的原理為吐溫80中的聚乙氧基可與銨鉆硫氰酸鹽反應(yīng)形成藍色復(fù)合物，溶于二氯甲烷，通過比色測定吐溫80含量。但該方法檢測范圍僅為0～100 μg／mL，單抗藥物蛋白濃度高，干擾大，吐溫含量高，因此本實驗將藥典方法中高二氯甲烷的用量調(diào)整為4.00 g，硫氰鈷銨溶液濃度提高3倍，并對改進后的方法進行驗證，以期適用于高濃度重組蛋白藥物中吐溫80含量檢測。

1 材料與方法

1.1 樣品 重組人源抗hTNF-α單克隆抗體半成品（批號為：SY20180301，簡稱半成品）及重組人源抗hTNF-α單克隆抗體注射液（批號為：20180301、2018-0302、20180401）由華北制藥集團新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司提供。

1.2 主要試劑及儀器 吐溫80標準品（批號：39H-0092）購自公司美國Sigma公司；二氯甲烷、硫氰鈷銨及無水乙醇購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司；紫外可見分光光度計購自美國Thermo公司。

1.3 檢測方法的改進 取180 μL樣品，加入5 mL乙醇飽和氯化鈉溶液，6 000×g離心10 min，取上清液。將上清液放入真空干燥旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（參數(shù)為：40℃，蒸發(fā)1 h，壓力5 mbar，安全壓力限15 mbar）干燥（吐溫80標準品檢測不進行上述操作）；用1 mL超純水溶解，準確加入4.00 g二氯甲烷及2 mL硫氰鈷銨溶液（稱取硝酸鈷24.0 g、硫氰酸銨160.0 g，加超純水溶解并稀釋至200 mL），加塞混勻1.5 h（15 min／次），靜置30 min；棄上層液，紫外可見分光光度計測定下層液A620［1］。

1.4 方法的驗證

1.4.1 專屬性 稱取100.00 mg吐溫80標準品，用超純水定容至100 mL，制成1.0 mg／mL的標準品溶液。分別取1.0 mg／mL的吐溫80標準品溶液、半成品及加入吐溫80標準品溶液的半成品（吐溫80終濃度為1.0 mg／mL），按1.3項方法進行檢測。

1.4.2 線性范圍 將1.0 mg／mL的吐溫80標準品溶液（制備方法同1.4.1項）用超純水稀釋為0、50、100、150、200、300、400 μg／mL。分別取1.0 mL標準品稀釋液，按1.3項方法進行檢測，以標準品濃度為橫坐標，A620為縱坐標，繪制標準曲線，獲得回歸方程。

1.4.3 定量限 取1 mL超純水，按1.3項方法檢測，并按下式計算定量限。

定量限=10 δ／S

式中δ為標準偏差，S為斜率。

1.4.4 精密性

1.4.4.1 重復(fù)性 稱取1.00 g吐溫80標準品，加超純水定容至100 mL，制成10.0 mg／mL的標準品溶液，加入至1 mL半成品中，充分混勻，配制成吐溫80終濃度分別為0.444、1.000、1.777 mg／mL的溶液，各濃度設(shè)3份樣品。分別取180 μL上述溶液（吐溫80標準品加入量為80、180、320 μg），按1.3項方法檢測，并計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.4.4.2 日間精密性 由2名實驗人員（A和B）分別于3個不同時間點配制10.0 mg／mL吐溫80標準品溶液（方法同1.4.4.1項），加入至1 mL半成品中，配制成吐溫80終濃度為1.000 mg／mL的溶液，取180 μL（吐溫80標準品加入量為180 μg），按1.3項方法進行檢測，并計算6次檢測結(jié)果的RSD。

1.4.5 準確性 取10.0 mg／mL吐溫80標準品溶液（方法同1.4.4.1項），加入至1 mL半成品中，充分混勻，配制成吐溫80終濃度分別為0.444、1.000、

1.777 mg／mL的溶液，每個濃度設(shè)3份樣品。分別取180 μL上述溶液（吐溫80標準品加入量為80、180、320 μg），按1.3項方法進行檢測，并按下式計算回收率。

回收率（%）=測定值／理論值×100%

1.5 方法的初步應(yīng)用 用建立的方法檢測批號為20180301、20180302、20180401的3批重組人源抗hTNF-α單克隆抗體注射液的吐溫80含量。

2 結(jié)果

2.1 方法的驗證

2.1.1 專屬性 半成品的A620＜0.006，加入吐溫80標準品溶液的半成品（吐溫80終濃度為1.0 mg／mL）及1.0 mg／mL的吐溫80標準品溶液A620分別為0.102和0.594，在620 nm處有明顯吸收，表明該方法具有良好的專屬性。

2.1.2 線性范圍 吐溫80的標準曲線見圖1。吐溫80標準品濃度在0～400 μg／mL范圍內(nèi)與A620呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.000 6x-0.0034，R2=0.999。

圖1 吐溫80的標準曲線Fig.1 Standard curve of Tween 80

2.1.3 定量限 吐溫80含量的硫氰酸銨鈷顯色檢測法的定量限為22.69 μg／mL。

2.1.4 精密性

2.1.4.1 重復(fù)性 吐溫80加入量為80、180、320 μg時，各濃度3次測定結(jié)果的RSD分別為1.20%、0.94%、0.52%，均＜3.00%，見表1。表明該方法具有良好的重復(fù)性。

表1 重復(fù)性驗證結(jié)果Tab.1 Verification for reproducibility

2.1.4.2 日間精密性 實驗人員A于3個時間點的檢測結(jié)果分別為179.44、179.11、182.22 μg／mL，實驗人員B于3個時間點的檢測結(jié)果分別為178.78、181.89、181.88 μg／mL，6次檢測結(jié)果的RSD為0.89%，＜5.00%。表明該方法具有良好的日間精密性。

2.1.5 準確性 吐溫80加入量為80、180、320 μg時的回收率分別為100.00%、98.76%、99.31%，均在80%～120%范圍內(nèi)，見表2。表明該方法具有良好的準確性。

表2 準確性驗證結(jié)果Tab.2 Verification for accuracy

2.2 方法的初步應(yīng)用 批號為20180301、20180302、20180401的重組人源抗hTNF-α單克隆抗體注射液中吐溫80的含量分別為0.95、1.00和1.02 mg／mL，分別為標示量的95%、100%和102%，表明該方法能準確測定吐溫80的含量。

3 討論

吐溫80具有良好的穩(wěn)定性及增溶性，在藥物制劑中，尤其是注射劑中得到廣泛應(yīng)用［6］。蛋白質(zhì)具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，其穩(wěn)定性高度依賴于外部（如環(huán)境和溫度）和內(nèi)部（疏水性、分子大小、pI等）因素，確保藥物制劑中蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的方法有多種，為防止聚集和變性，可在配方中加入表面活性劑，最常用的為吐溫20和吐溫80，可保護蛋白質(zhì)免受界面應(yīng)力的影響。有研究表明，與吐溫20比較，吐溫80對單克隆抗體制劑具有更好的抗聚集保護作用，引起的結(jié)構(gòu)干擾較小，具有較弱的結(jié)合親和力和較少的結(jié)合位點，是首選的表面活性劑［7］。

吐溫80是一種結(jié)構(gòu)相關(guān)成分高度非均相混合物，其結(jié)構(gòu)異質(zhì)性、存在的降解物和其他雜質(zhì)及降解趨勢將直接影響其在生物制藥產(chǎn)品中的功能特性［8］。吐溫80降解可能引起顆粒形成，是含有吐溫80的生物治療制劑質(zhì)量和潛在安全影響因素之一［9］；吐溫80水溶液易發(fā)生降解，水解釋放出游離脂肪酸、聚氧乙烯（異）山梨醇酐，酯類在光或過渡金屬的催化下發(fā)生自動氧化，生成過氧化物等氧化產(chǎn)物［10］；降解引起的吐溫80含量變化與水解或氧化產(chǎn)物的生成，將影響蛋白制劑的穩(wěn)定性、藥效與用藥安全性［11］。有研究通過高分辨率質(zhì)譜結(jié)合快速氫／氘交換法分析吐溫80［12］；WANG等［13］通過超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法對吐溫80的10種共211個組分進行了質(zhì)譜鑒定，并應(yīng)用核磁共振進行了確證。高分辨率質(zhì)譜及核磁共振技術(shù)有助于組分比的量化，對吐溫80引起的不良生物反應(yīng)進行評估［14］。

本實驗對優(yōu)化的重組蛋白中吐溫80含量的硫氰酸銨鈷顯色檢測法進行了驗證，結(jié)果表明，該方法在吐溫80標準品濃度為0～400 μg／mL范圍內(nèi)，與A620呈良好的線性關(guān)系，定量限達22.69 μg／mL，且具有良好的精密性及準確性。3批重組人源抗hTNF-α單克隆抗體注射液中吐溫80殘留量檢測結(jié)果與標示量相近。除了檢測吐溫80的含量，還應(yīng)對其穩(wěn)定性及產(chǎn)物進行監(jiān)測，有報道表明，含吐溫80的注射劑可引起血壓降低、心率加快、溶血、過敏、類過敏反應(yīng)等［15-16］。本研究建立的硫氰酸銨鈷顯色法可用于重組人源抗hTNF-α單克隆抗體注射液中吐溫80含量的檢測，也為其他重組蛋白中吐溫80含量的檢測提供了實驗依據(jù)。