邵天舒，丁銳，周長明，郭雷

北京市藥品檢驗(yàn)所國家藥品監(jiān)督管理局仿制藥研究與評價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中藥成分分析與生物評價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102206

人凝血因子Ⅷ制品是由健康人血漿經(jīng)分離、提取、純化、凍干等工藝制得的一種血液制品，是甲型血友病患者目前最有效的預(yù)防及治療出血的方法即凝血因子替代療法不可或缺的主要產(chǎn)品，患者通常需終生用藥［1-2］。鑒于該產(chǎn)品是以人血漿為原料，存在傳播人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）、乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）等病毒的重大風(fēng)險(xiǎn)，原國家食品藥品監(jiān)督管理局于2002年發(fā)布的《血液制品去除／滅活病毒技術(shù)方法及驗(yàn)證指導(dǎo)原則》提出“凝血因子類制品生產(chǎn)過程中應(yīng)有特定的去除／滅活脂包膜和非脂包膜病毒的方法”的要求［3］。目前，各生產(chǎn)企業(yè)對人凝血因子Ⅷ制品中脂包膜病毒普遍采用有機(jī)溶劑／表面活性劑（S／D）法進(jìn)行滅活，其中聚山梨酯80為該方法中常用的表面活性劑之一［4］。由于聚山梨酯80具有很強(qiáng)的破裂細(xì)胞膜的作用，特別是注射劑中的聚山梨酯80能直接進(jìn)入血液，可引起溶血、血管擴(kuò)張及血壓下降等不良反應(yīng)；此外，其在人體內(nèi)水解后釋放出的油酸還有誘發(fā)組胺釋放，發(fā)生急性超敏反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)［5］。因此，為最大限度降低血友病患者的用藥風(fēng)險(xiǎn)，《中國藥典》三部（2015版）規(guī)定，人凝血因子Ⅷ制品中聚山梨酯80殘留量應(yīng)≤100 μg／mL，測定方法（簡稱藥典方法）是利用其化學(xué)結(jié)構(gòu)中的聚乙氧基可與硫氰酸鈷銨反應(yīng)形成藍(lán)色復(fù)合物，將該復(fù)合物溶于二氯甲烷，通過測定其在波長620 nm處的吸光度測定含量［6］。該方法為經(jīng)典方法已使用多年，但需先將樣品蛋白沉淀后離心取上清液，再通過空氣吹掃濃縮后進(jìn)行顯色反應(yīng)，且顯色反應(yīng)過程需在室溫放置1.5 h，并每15 min振蕩1次，加之二氯甲烷極易揮發(fā)，不僅操作步驟繁瑣不便，難以滿足生產(chǎn)企業(yè)及藥檢機(jī)構(gòu)大批量快速測定的需求，且試驗(yàn)過程大量使用有機(jī)溶劑二氯甲烷，易造成環(huán)境污染，危害操作者健康。因此，有必要建立一種更準(zhǔn)確、便捷、環(huán)保的方法來檢測人凝血因子Ⅷ制品中的聚山梨酯80殘留量。

聚山梨酯80是由山梨醇及其失水、雙失水化合物（山梨醇酐）與油酸和環(huán)氧乙烷縮合制得的一類強(qiáng)親水性化合物。由于其化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有較多的親水性基團(tuán)，在常規(guī)C18色譜柱上幾乎無保留，難以測定，且其屬于大分子聚合物，在有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中，采用高效液相色譜（HPLC）法測定聚山梨酯80含量的大多選擇分子排阻色譜［7-8］。由于人凝血因子Ⅷ制品中含有大量蛋白類物質(zhì)，在分子排阻過程中難以與聚山梨酯80峰分離。因此，本實(shí)驗(yàn)選用一種將離子交換與反相分配相結(jié)合的色譜柱，該色譜柱由兩種混合模式的填料組成，即在聚N-乙烯基吡咯烷酮的表面鍵合N’，N’-二甲基丁胺，前者作為反相分離基質(zhì)，后者則作為離子交換分離基質(zhì)，使該色譜柱同時具備反相和離子交換雙重分離機(jī)理，可共同對聚山梨酯80產(chǎn)生保留作用，適用于人凝血因子Ⅷ等含蛋白質(zhì)量較高的生物制品中聚山梨酯80的分離。同時，由于聚山梨酯80無生色基團(tuán)，僅有末端紫外吸收，因此一般采用蒸發(fā)光散射檢測器（evaporative light scattering detector，ELSD）進(jìn)行檢測［9］，但該檢測器普遍存在重現(xiàn)性差、靈敏度低等問題。而近年來出現(xiàn)的電噴霧檢測器（charged aerosol detection，CAD）是利用電暈裝置（高壓鉑金電極）使氮?dú)庑纬蓭щ娏Ｗ?，與揮發(fā)掉溶劑的溶質(zhì)顆粒在碰撞室充分碰撞混合，使后者帶上正電，再經(jīng)高靈敏度的靜電計(jì)測量出總電信號，檢測信號與溶質(zhì)質(zhì)量呈正相關(guān)。該檢測器靈敏度高、重現(xiàn)性好，且為通用型檢測器，逐漸成為檢測無紫外吸收物質(zhì)的優(yōu)選方法［10-11］。

本研究建立了以反相-離子交換混合模式色譜柱分離、CAD檢測人凝血因子Ⅷ制品中聚山梨酯80含量的方法，并進(jìn)行驗(yàn)證，同時與ELSD方法進(jìn)行比較，旨在為人凝血因子Ⅷ制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品及標(biāo)準(zhǔn)品10批人凝血因子Ⅷ樣品（批號分別為：201908054、201909056～201909060、2019-09062、201909063、201910066、201910068，規(guī)格：200 IU／瓶）由國內(nèi)A企業(yè)生產(chǎn)，為北京市藥品檢驗(yàn)所批簽發(fā)留樣；聚山梨酯80標(biāo)準(zhǔn)品（批號：R072G0）為美國藥典USP標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2 主要試劑及儀器 異丙醇（色譜級）購自德國Merck公司；無水甲酸（優(yōu)級醇）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；UltiMate3000高效液相色譜儀（配備Corona Ultra型CAD）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；島津20AT高效液相色譜儀購自日本島津公司；Alltech 2000ES型ELSD購自美國Alltech公司；反相-離子交換混合色譜柱Oasis MAX（2.1 mm×20 mm，30 μm）購自美國Waters公司；Milli-Q型超純水機(jī)購自美國Millipore公司；WD-A藥物穩(wěn)定性檢查儀購自天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠。

1.3 溶液的制備

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液 精密稱取聚山梨酯80標(biāo)準(zhǔn)品1.025g，用超純水定容至100 mL，配制為10.25 mg／mL的聚山梨酯80標(biāo)準(zhǔn)品溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)品貯備液0.125、0.25、0.5、1.0、2.0、

2.5 mL，加超純水定容至100 mL量瓶，搖勻，配制為12.8、25.6、51.3、102.5、205.0、256.3 μg／mL聚山梨酯80的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.2 供試品溶液 取201908054、201909056～201909060、201909062、201909063、201910066、2019-10068批樣品各1瓶，分別精密加入超純水10 mL，溶解搖勻，作為供試品溶液備用。

1.4 色譜條件設(shè)置 采用色譜柱Oasis MAX；流動相A液為含2%（V／V）甲酸的異丙醇∶水（20∶80）溶液，B液為含2%（V／V）甲酸的異丙醇溶液。CAD條件：流動相流速為1.0 mL／min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為30 μL，CAD霧化氣壓力為253.4 Pa，氮?dú)饬魉贋? L／min，霧化室溫度為30℃，采樣頻率為2 Hz。ELSD條件：流動相流速、柱溫、進(jìn)樣量條件同CAD條件，ELSD漂移管溫度為105℃，空氣流速為1.6 L／min，分流模式為開。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedure

1.5 方法的驗(yàn)證

1.5.1 系統(tǒng)適用性 取濃度為102.5 μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液、加標(biāo)樣品溶液（1瓶樣品中加入25.6 μg／mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液溶解）及空白溶液（超純水），分別按1.4項(xiàng)色譜條件檢測，采集色譜圖。

1.5.2 線性范圍 取系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別按1.4項(xiàng)色譜條件檢測，以聚山梨酯80濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算相關(guān)系數(shù)（r）。

1.5.3 定量限及檢測限 精密量取12.8 μg／mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，進(jìn)行系列稀釋后分別按1.4項(xiàng)色譜條件檢測，以色譜峰信噪比（S／N）≥3確定檢測限，S／N≥10確定定量限。

1.5.4 重復(fù)性 取201910066批供試品溶液6份，按1.4項(xiàng)色譜條件檢測，計(jì)算聚山梨酯80殘留量的RSD。

1.5.5 穩(wěn)定性 取201910066批供試品溶液，于室溫分別放置0、2、4、6、8、10 h，按1.4項(xiàng)色譜條件檢測，計(jì)算聚山梨酯80殘留量的RSD。

1.5.6 準(zhǔn)確性 分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)品貯備液1.6、2.0、2.4 mL，置50 mL量瓶中，加超純水定容，搖勻。取201909059批樣品9瓶，分別加入定容后的標(biāo)準(zhǔn)品貯備液10 mL，配制低、中、高濃度（32.8、41.0、49.2 μg／mL）的加標(biāo)樣品各3份，按1.4項(xiàng)色譜條件檢測，按下式計(jì)算加標(biāo)樣品中聚山梨酯80的加標(biāo)回收率及RSD。

加標(biāo)回收率（%）＝（實(shí)測濃度-理論濃度）／加標(biāo)濃度×100%

1.6 方法的應(yīng)用 分別采用藥典方法及1.4項(xiàng)色譜條件檢測201908054、201909056～201909060、2019 09062、201909063、201910066及201910068批樣品，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算樣品中聚山梨酯80殘留量，共檢測2次。

2 結(jié)果

2.1 方法的驗(yàn)證

2.1.1 系統(tǒng)適用性 聚山梨酯80標(biāo)準(zhǔn)品、供試品及加標(biāo)樣品中聚山梨酯80色譜峰的保留時間均為5.9 min，供試品及加標(biāo)樣品在11 min可見其他色譜峰，但與聚山梨酯80色譜峰充分分離（分離度為9.0），無干擾；空白溶液未見色譜峰。見圖1～4。表明系統(tǒng)適用性良好。

2.1.2 線性范圍 采用CAD檢測，聚山梨酯80標(biāo)準(zhǔn)品在12.8~256.3 μg／mL范圍內(nèi)，回歸方程y＝121.42x＋1.321 7，r＝0.998 0，線性關(guān)系良好。采用ELSD檢測，因其中聚山梨酯80色譜峰面積與濃度不呈線性關(guān)系，以峰面積對數(shù)為縱坐標(biāo)，濃度對數(shù)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，聚山梨酯80濃度在12.8~256.3 μg／mL范圍內(nèi)，回歸方程y＝1.316 1x＋3.088 5，r＝0.998 8，線性關(guān)系良好。見圖2。

圖2 CAD（A）及ELSD檢測（B）聚山梨酯80標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve for determination of polysorbate content by CAD（A）and ELSD（B）

2.1.3 定量限及檢測限 采用CAD檢測，定量限約為3.20 μg／mL，檢測限約為1.07 μg／mL。采用ELSD檢測，定量限約為6.41 μg／mL，檢測限約為2.14 μg／mL。表明采用CAD法優(yōu)于ELSD法。

2.1.4 重復(fù)性 采用CAD檢測，6份供試品溶液中聚山梨酯80濃度分別為55.05、54.67、53.85、53.95、53.99和53.82 μg／mL，RSD為0.86%，表明方法重復(fù)性良好。采用ELSD檢測，6份供試品溶液中聚山梨酯80濃度分別為38.69、38.05、37.59、38.00、31.58和30.98 μg／mL，RSD為9.01%，表明該方法重復(fù)性較CAD法欠佳。

2.1.5 穩(wěn)定性 采用CAD檢測，室溫放置0、2、4、6、8、10 h時，供試品溶液中聚山梨酯80濃度分別為54.08、54.92、54.13、53.88、54.44和53.97 μg／mL，RSD為0.65%，表明方法穩(wěn)定性良好。因ELSD檢測檢測重復(fù)性欠佳，未對其穩(wěn)定性進(jìn)行考察。

2.1.6 準(zhǔn)確性 采用CAD檢測，低、中、高濃度的加標(biāo)樣品回收率在96.85%~101.49%之間，RSD為1.54%，見表2，表明該方法準(zhǔn)確性良好。采用ELSD檢測，低、中、高濃度的加標(biāo)樣品回收率在57.55%~63.75%之間，RSD為3.03%，見表3，表明該方法準(zhǔn)確性較CAD法欠佳。

表2 CAD檢測的加標(biāo)回收率Tab.2 Determination of spike recovery by CAD

表3 ELSD檢測的加標(biāo)回收率Tab.3 Determination of spike recovery by ELSD

2.2 方法的應(yīng)用10批樣品中聚山梨酯80殘留量經(jīng)CAD檢測，為56.09～66.75 μg／mL，RSD為4.9%；經(jīng)ELSD檢測，為40.16～50.40 μg／mL，RSD為6.9%；經(jīng)藥典方法檢測，為51～68 μg／mL，RSD為8.6%。見表4。結(jié)果均符合《中國藥典》要求。

表4 10批樣品中聚山梨酯80殘留量的藥典方法、CAD及ELSD法檢測結(jié)果（μg／mL）Tab.4 Determination results of polysorbate contents in ten batches of samples by the method in Chinese Pharmacopeia，CAD and ELSD（μg／mL）

圖1空白溶液（A）、聚山梨酯80標(biāo)準(zhǔn)品（B）、人凝血因子Ⅷ供試品（C）、加標(biāo)樣品（D）的色譜圖Fig.1 Chromatogram of blank solution（A），polysorbate 80 standard（B），human coagulation factorⅧsample（C）and spike sample（D）

3 討論

從本文方法的驗(yàn)證結(jié)果比較可看出，CAD與ELSD檢測僅在線性范圍上無差異，在定量限、檢測限、重復(fù)性及準(zhǔn)確性方面CAD均明顯優(yōu)于ELSD檢測，其原因主要有兩點(diǎn)：一是ELSD檢測在梯度洗脫的兩相轉(zhuǎn)換過程中的基線漂移較明顯，且達(dá)到平衡時間較長，而CAD檢測則相對平穩(wěn)，且達(dá)到平衡較快；二是由于目前CAD檢測本身具有流路切換功能，采用該功能可使死時間內(nèi)被沖出的蛋白質(zhì)直接進(jìn)入廢液而避免對檢測器造成污染，而常規(guī)ELSD檢測因不具備該功能，使得較高濃度的蛋白質(zhì)進(jìn)入檢測器，在0~1 min被洗脫，出現(xiàn)1個極大的蛋白峰，對后續(xù)基線平衡造成影響，同時由于大量蛋白質(zhì)在漂移管中，致使在連續(xù)進(jìn)樣多針后其基線噪音升高，峰面積下降，造成重復(fù)性、準(zhǔn)確性均較差。

10批樣品按藥典方法檢測聚山梨酯80殘留量的RSD為8.6%，高于CAD檢測的RSD（4.9%），主要原因是藥典方法操作步驟復(fù)雜，特別是在乙醇-氯化鈉飽和溶液洗滌及空氣吹掃濃縮的步驟，不同樣品之間的操作極易產(chǎn)生差異，加之溶劑二氯甲烷易揮發(fā)，上述問題均有可能導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)較大偏差。

本實(shí)驗(yàn)測定的10批人凝血因子Ⅷ制品均為同一企業(yè)2019年下半年生產(chǎn)，10批樣品中聚山梨酯80殘留量最高值與最低值的差為10.66 μg／mL，RSD為4.9%。采用S／D滅活的聚山梨酯80通常于病毒滅活工藝完成后，在后續(xù)的超濾層析等步驟中除去。盡管10批產(chǎn)品的聚山梨酯80殘留量均未超出《中國藥典》三部（2015版）規(guī)定的限值，但鑒于聚山梨酯80有引起不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，仍建議生產(chǎn)企業(yè)通過不斷改進(jìn)工藝等措施對產(chǎn)品中聚山梨酯80殘留量進(jìn)行更為有效的控制。

綜述所述，本研究成功建立了檢測人凝血因子Ⅷ制品中聚山梨酯80殘留量的HPLC-CAD法，該方法在重復(fù)性、準(zhǔn)確性及靈敏度方面均優(yōu)于ELSD，為人凝血因子Ⅷ制品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升提供了參考。