劉麗，郭騏源，郝建麗，郭丹丹，張雪梅，吳業(yè)紅

長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林 長(zhǎng)春130012

每年全球因季節(jié)性流感病毒感染會(huì)導(dǎo)致300萬(wàn)~500萬(wàn)嚴(yán)重的感染病例，死亡病例高達(dá)29萬(wàn)~65萬(wàn)例［1-2］。接種流感疫苗是預(yù)防流感最有效的措施［3］。傳統(tǒng)雞胚生產(chǎn)的流感疫苗，生產(chǎn)過(guò)程繁瑣，培養(yǎng)的流感病毒抗原易突變，特別是當(dāng)禽流感病毒引起流感大流行時(shí)，雞胚的供應(yīng)受到限制難以滿足疫苗大量、快速生產(chǎn)的需求，應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可克服上述困難。雞胚生產(chǎn)流感疫苗的的下游工藝通常包括澄清、超濾和蔗糖區(qū)帶離心［4］，此工藝對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵雜質(zhì)宿主細(xì)胞殘留蛋白和宿主細(xì)胞殘留DNA去除效果不理想。因此亟待開(kāi)發(fā)出滿足嚴(yán)格監(jiān)管要求的細(xì)胞基質(zhì)流感疫苗下游純化工藝，以確保細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)流感疫苗的安全性和有效性［5］。層析分離通常被認(rèn)為是大規(guī)模生產(chǎn)中最通用，最有效的一種方法。不斷發(fā)展用于層析的材料能滿足從實(shí)驗(yàn)室到商業(yè)規(guī)模的高容量和高擴(kuò)展性的要求［6］，因此層析技術(shù)被廣泛用于病毒的純化［7］。由于傳代細(xì)胞系的潛在致瘤風(fēng)險(xiǎn)，宿主細(xì)胞殘留DNA通常選擇核酸酶消化、離子交換層析等方法來(lái)進(jìn)行有效去除［8］。新型復(fù)合填料Capto Core700具有未官能化的惰性外殼和位于核心的辛胺配基，使其具有分子排阻和離子吸附的雙重功能［9］，非常適合宿主細(xì)胞蛋白與核酸酶的去除［10］。

本研究通過(guò)優(yōu)化核酸酶處理?xiàng)l件、復(fù)合介質(zhì)Capto Core700與強(qiáng)陰離子介質(zhì)Capto Q的純化條件，建立適于無(wú)血清懸浮MDCK細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒的下游純化工藝，為后續(xù)MDCK細(xì)胞流感疫苗的生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及毒株 無(wú)血清懸浮犬腎上皮MDCK細(xì)胞株由長(zhǎng)春生物制品研究所責(zé)任有限公司疫苗六室制備；流感毒株B／Brisbane／60／2008（NYMC BX-35）由NIBSC提供。

1.2 主要試劑及儀器Benzonase?核酸酶（純度≥90%）購(gòu)自德國(guó)Merck公司；牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；CD MDCK 244培養(yǎng)基購(gòu)自甘肅健順生物科技有限公司；DMEM購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；宿主細(xì)胞殘留DNA樣本前處理試劑盒（磁珠法）和MDCK細(xì)胞殘留DNA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自湖州申科生物技術(shù)有限公司；MDCK細(xì)胞殘留蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)CYGNUS公司；血凝素檢測(cè)用標(biāo)準(zhǔn)血清與標(biāo)準(zhǔn)抗原均購(gòu)自NIBSC；Capto Core 700、Capto Q和AKTA pure150層析系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)GE Healthcare公司。

1.3 病毒液制備 將無(wú)血清懸浮MDCK細(xì)胞在CD MDCK 244培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h；補(bǔ)加DMEM病毒維持液，加入流感病毒繼續(xù)培養(yǎng)48~60 h；收獲病毒液，經(jīng)澄清后超濾濃縮，濃縮液中加入2 mmol／L MgCl2與Benzonase?核酸酶37℃消化后，進(jìn)行蔗糖區(qū)帶離心及滅活。上柱前所有病毒樣品均8 169×g離心30 min。

1.4 核酸酶處理?xiàng)l件的優(yōu)化 向病毒超濾濃縮液中加入不同終濃度（1、10、30、50 U／mL）的Benzonase?核酸酶，置37℃振蕩孵育，每間隔2 h（0、2、4、6、8 h）取樣，檢測(cè)殘留DNA。

1.5 Capto Core 700層析條件的優(yōu)化

1.5.1 上樣緩沖液鹽離子濃度 采用50 mmol／L Tris pH 7.4的緩沖體系，分別加入不同鹽離子濃度（150、500、1 000 mmol／L NaCl），分別平衡柱子后上樣，收集流穿峰，全程流速為150 cm／h，每個(gè)條件重復(fù)3次。檢測(cè)總蛋白含量、血凝素含量、宿主細(xì)胞殘留蛋白和殘留DNA。

1.5.2 線性流速的優(yōu)化 設(shè)3個(gè)線性流速分別為60、150和300 cm／h，緩沖體系為150 mmol／L NaCl+50 mmol／L Tris，pH 7.4。用上述3個(gè)線性流速分別過(guò)柱，收集流穿峰，每個(gè)條件重復(fù)3次。檢測(cè)總蛋白含量、血凝素含量、宿主細(xì)胞殘留蛋白和殘留DNA。

1.6 Capto Q線性流速的優(yōu)化 采用的緩沖體系為500 mmol／L NaCl+50 mmol／L Tris，pH 7.4［11］，設(shè)3個(gè)線性流速分別為60、150和300 cm／h。用上述3個(gè)線性流速分別過(guò)柱，收集流穿峰，每個(gè)條件重復(fù)3次。檢測(cè)血凝素含量和宿主細(xì)胞殘留DNA。

1.7 病毒純化 按1.3項(xiàng)制備病毒液后，經(jīng)復(fù)合介質(zhì)和離子交換2步層析，加入裂解劑室溫裂解2 h，超濾去除裂解劑，除菌獲得單價(jià)原液。共純化3批40 L病毒收獲液。檢測(cè)從病毒收獲液、核酸酶處理、復(fù)合介質(zhì)與離子交換層析液至單價(jià)原液中的總蛋白含量、血凝素含量、宿主細(xì)胞殘留蛋白和殘留DNA含量。

1.8 總蛋白含量檢測(cè) 采用lowry法。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)品，按照《中國(guó)藥典》三部（2015版）要求［12］進(jìn)行操作。

1.9 宿主細(xì)胞殘留DNA檢測(cè) 采用宿主細(xì)胞殘留DNA樣本前處理試劑盒（磁珠法）提取樣品殘留宿主DNA，qPCR熒光探針?lè)z測(cè)殘留DNA含量，具體操作按照MDCK殘留DNA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.10 宿主細(xì)胞殘留蛋白檢測(cè) 采用MDCK細(xì)胞殘留蛋白檢測(cè)試劑盒，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.11 血凝素含量檢測(cè) 采用單向免疫擴(kuò)散（single radial immunodiffusion，SRID）法［12］。

1.12統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，實(shí)驗(yàn)組各實(shí)驗(yàn)條件間的顯著性分析采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 核酸酶處理?xiàng)l件 結(jié)果顯示，當(dāng)DNA起始濃度較高時(shí)（258 600 ng／mL），1 U／mL核酸酶酶解8 h后殘留DNA去除率為（98.96±0.26）%，殘留2 701 ng／mL，50 U／mL核酸酶殘留DNA去除率為（99.96±0.02）%，殘留103.8 ng／mL，兩者消化能力相差26倍；而10 U／mL核酸酶殘留DNA去除率為（99.92±0.06）%，殘留207.2 ng／mL，30 U／mL核酸酶殘留DNA去除率為（99.96±0.01）%，殘留

108.9 ng／mL，均與50 U／mL核酸酶消化能力相當(dāng)。見(jiàn)表1。

表1 高DNA起始濃度時(shí)不同酶解時(shí)間及核酸酶添加濃度對(duì)殘留DNA的去除率（%，±s，n=3）Tab.1 Removal rate of residual DNA at a high original concentration by nuclease at various concentrations for addition for various time durations（%，±s，n=3）

表1 高DNA起始濃度時(shí)不同酶解時(shí)間及核酸酶添加濃度對(duì)殘留DNA的去除率（%，±s，n=3）Tab.1 Removal rate of residual DNA at a high original concentration by nuclease at various concentrations for addition for various time durations（%，±s，n=3）

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當(dāng)DNA起始濃度較低時(shí)（5 634 ng／mL），1 U／mL核酸酶酶解8 h后殘留DNA去除率為（99.04±0.59）%，殘留54 ng／mL，50 U／mL核酸酶酶去除率為（99.57±0.32）%，殘留24.3 ng／mL，兩者消化能力僅差2.2倍。見(jiàn)表2。

表2 低DNA起始濃度時(shí)不同酶解時(shí)間及核酸酶添加濃度對(duì)殘留DNA的去除率（%，±s，n=3）Tab.2 Removal rate of residual DNA at a low original concentration by nuclease at various concentrations for addition for various time durations（%，±s，n=3）

表2 低DNA起始濃度時(shí)不同酶解時(shí)間及核酸酶添加濃度對(duì)殘留DNA的去除率（%，±s，n=3）Tab.2 Removal rate of residual DNA at a low original concentration by nuclease at various concentrations for addition for various time durations（%，±s，n=3）

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綜合成本，根據(jù)每批病毒液的收獲情況與核酸酶添加順序，當(dāng)核酸酶在純化前期加入時(shí)殘留DNA起始濃度較高，可添加10 U／mL核酸酶酶解4～6 h，在純化后期加入時(shí)殘留DNA起始濃度較低，可添加1 U／mL核酸酶酶解6～8 h。

2.2 復(fù)合介質(zhì)層析條件

2.2.1 上樣緩沖液鹽離子濃度 隨著上樣緩沖液鹽離子濃度的增加，宿主細(xì)胞殘留蛋白的去除率略有降低，但3種上樣緩沖液鹽離子濃度下宿主細(xì)胞殘留蛋白的去除效果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.760，P=0.250）；3種上樣緩沖液鹽離子濃度下的殘留DNA、總蛋白去除率和血凝素回收率差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為0.462、0.338和0.028，P分別為0.651、0.726和0.973）。見(jiàn)表3。不同的緩沖液鹽離子濃度對(duì)于復(fù)合介質(zhì)純化效果影響不大，根據(jù)宿主細(xì)胞殘留蛋白去除效果，初步選擇上樣緩沖液為150 mmol／L NaCl+50 mmol／L Tris，pH 7.4。

表3 復(fù)合介質(zhì)Capto Core 700不同上樣緩沖液鹽離子濃度的純化效果（%，±s，n=3）Tab.3 Purification effect of samples by Capto Core 700 at various sodium chloride concentrations in loading buffer（%，±s，n=3）

表3 復(fù)合介質(zhì)Capto Core 700不同上樣緩沖液鹽離子濃度的純化效果（%，±s，n=3）Tab.3 Purification effect of samples by Capto Core 700 at various sodium chloride concentrations in loading buffer（%，±s，n=3）

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2.2.2 線性流速 隨著流速的不斷增加，雜質(zhì)的去除效果呈下降趨勢(shì)，其中3種線性流速下宿主細(xì)胞殘留蛋白去除效果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=16.949，P=0.003），而3種線性流速下血凝素回收率雖不斷增加，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.769，P=0.504），見(jiàn)表4。初步選擇線性流速為60 cm／h。

表4 復(fù)合介質(zhì)Capto Core 700不同線性流速下的純化效果（%，±s，n=3）Tab.4 Purification effect of samples by Capto Core 700 at various linear flow rates（%，±s，n=3）

表4 復(fù)合介質(zhì)Capto Core 700不同線性流速下的純化效果（%，±s，n=3）Tab.4 Purification effect of samples by Capto Core 700 at various linear flow rates（%，±s，n=3）

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2.3 Capto Q線性流速 隨著流速的不斷增加，殘留DNA去除效果減弱，血凝素回收率不斷增加，3種線性流速下殘留DNA去除效果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=33.458，P=0.001），血凝素回收率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.915，P=0.082），根據(jù)殘留DNA／血凝素的比值，比值越小說(shuō)明雜質(zhì)去除效果越好，同時(shí)血凝素回收率越高，因此選擇流速為150 cm／h。見(jiàn)表5。

表5 Capto Q不同線性流速下的純化效果（n=3）Tab.5 Purification effect of samples by Capto Q at various linear flow rates（n=3）

2.4 純化病毒的檢測(cè)結(jié)果 結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)Capto Core 700層析純化后，可去除（86.68±8.64）%的宿主細(xì)胞殘留蛋白和（54.85%±10.92）%的殘留DNA，見(jiàn)圖1。Capto Core 700的流穿液經(jīng)Capto Q后，去除了（85.75±9.39）%的殘留DNA，見(jiàn)圖2。最后獲得的單價(jià)原液血凝素含量為（528.91±25.21）μg／mL，宿主細(xì)胞殘留蛋白為（4.13±2.23）μg／mL，殘留DNA為（10.33±4.92）ng／mL。以血凝素含量15 μg／劑參考?xì)W盟對(duì)四價(jià)細(xì)胞流感疫苗中殘留DNA含量不高于10 ng／劑的標(biāo)準(zhǔn)，殘留DNA／血凝素含量比值應(yīng)不高于0.17 ng／μg，而本工藝生產(chǎn)的單價(jià)原液殘留DNA／血凝素比值平均為0.02 ng／μg，達(dá)到歐盟要求。見(jiàn)表6和表7。

圖1 Capto Core 700層析圖譜Fig.1 Capto Core 700 vhromatographic profile

圖2 Capto Q層析圖譜Fig.2 Capto Q chromatographic profile

表6 純化過(guò)程中關(guān)鍵步驟的關(guān)鍵指標(biāo)檢測(cè)（±s，n=3）Tab.6 Key indexes at major steps of purification process（±s，n=3）

表6 純化過(guò)程中關(guān)鍵步驟的關(guān)鍵指標(biāo)檢測(cè)（±s，n=3）Tab.6 Key indexes at major steps of purification process（±s，n=3）

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表7 MDCK細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒純化工藝的得率及雜質(zhì)去除率（%，±s，n=3）Tab.7 Recovery and removal rate of influenza virus cultured in MDCK cells after purification by developed purification process（%，±s，n=3）

表7 MDCK細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒純化工藝的得率及雜質(zhì)去除率（%，±s，n=3）Tab.7 Recovery and removal rate of influenza virus cultured in MDCK cells after purification by developed purification process（%，±s，n=3）

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3 討論

近年來(lái)，世衛(wèi)組織積極推進(jìn)使用細(xì)胞培養(yǎng)替代雞胚培養(yǎng)生產(chǎn)流感疫苗。細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)流感疫苗能在較短時(shí)間內(nèi)制備足夠的劑量幫助人類應(yīng)對(duì)大規(guī)模暴發(fā)的流感。國(guó)內(nèi)尚無(wú)細(xì)胞流感疫苗上市，國(guó)外有Solvay Pharmaceuticals、Novartis、MedImmune［13］、SK［14］四家制造商以MDCK細(xì)胞為基質(zhì)生產(chǎn)流感疫苗獲批上市。其中Novartis公司和韓國(guó)SK公司生產(chǎn)的流感疫苗采用懸浮MDCK細(xì)胞培養(yǎng)流感病毒生產(chǎn)疫苗。臨床數(shù)據(jù)顯示，Novartis公司的懸浮MDCK細(xì)胞流感疫苗Optaflu在免疫原性、安全性及耐受性方面均優(yōu)于雞胚疫苗［15］。本研究使用的無(wú)血清懸浮MDCK細(xì)胞，不添加血清無(wú)外源因子污染，更易于規(guī)模化生產(chǎn)。

本研究對(duì)使用的Benzonase?核酸酶的添加順序、作用濃度及時(shí)間進(jìn)行了初步摸索?？紤]到核酸酶的作用不僅能把DNA消化成3~5 bp的小片段，同時(shí)還能降低樣品黏度促進(jìn)后續(xù)過(guò)濾操作，因此考慮在純化前期加入核酸酶，為后續(xù)精細(xì)純化進(jìn)一步去除宿主殘留DNA減小壓力。同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果顯示，核酸酶添加濃度最大50 U／mL、作用8 h，在DNA起始濃度較低（5 634 ng／mL）時(shí)也無(wú)法完全消化DNA（殘留24.3 ng／mL）。有研究添加了300 U／mL核酸酶，酶解26 h后仍有0.9% DNA殘留［4］。表明在病毒樣品的下游純化工藝中添加核酸酶后仍會(huì)殘留少量DNA，可能是DNA與蛋白質(zhì)或病毒顆粒結(jié)合纏繞，核酸酶無(wú)法作用到DNA。經(jīng)過(guò)Benzonase?核酸酶處理后的血凝素含量酶解前后變化不大，表明核酸酶對(duì)流感病毒的活性影響不大，這與報(bào)道的結(jié)論一致［16］。

有研究使用尺寸排阻與離子交換的兩步層析組合法可避免病毒的特異性結(jié)合，但最后殘留DNA約500 ng／劑，遠(yuǎn)未達(dá)到歐盟標(biāo)準(zhǔn)［17］。另有研究采用弱陰離子、親和層析與尺寸排阻的3步層析組合，殘留DNA水平可達(dá)0.3 ng／劑，但未提供完整的血凝素回收率數(shù)據(jù)，難以評(píng)估其工藝應(yīng)用于生產(chǎn)的可行性［4］。本研究采用2步層析法，先經(jīng)復(fù)合介質(zhì)后再經(jīng)強(qiáng)陰離子交換，此過(guò)程均采用流穿模式收集目的蛋白，避免了任何病毒特異性捕獲步驟。經(jīng)過(guò)兩步層析后最終去除了99.94%的宿主細(xì)胞殘留蛋白和99.99%的殘留DNA，其中殘留DNA為2.35 ng／劑。因此，應(yīng)注意通過(guò)選擇適當(dāng)培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和收獲時(shí)間點(diǎn)來(lái)最大程度地減少細(xì)胞DNA釋放水平從而進(jìn)一步降低殘留DNA。

綜上所述，本研究初步建立了采用無(wú)血清懸浮MDCK細(xì)胞為基質(zhì)培養(yǎng)流感病毒的下游純化工藝，為后續(xù)MDCK細(xì)胞流感疫苗的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。