李 妍，陸倫根，蔡曉波

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是除外酒精和其它明確肝損因素所致的、以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯囊唤M臨床病理綜合癥，包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)以及進(jìn)展而來的肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌(hepatocellular caicinoma，HCC)等一系列疾病譜[1-4]。腸道微生態(tài)失衡導(dǎo)致腸粘膜屏障功能減弱、通透性增加，腸源性細(xì)菌及細(xì)菌產(chǎn)物經(jīng)門靜脈入肝，激活肝臟炎癥反應(yīng)[5-8]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)長期高脂飲食影響肝臟線粒體能量代謝，導(dǎo)致缺氧應(yīng)激[9]。缺氧是脂肪組織功能障礙的關(guān)鍵影響因素，可能導(dǎo)致脂肪纖維化和炎癥、IR、肝臟脂肪代謝異常等病理情況[10]。慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease ，COPD)患者往往長期處于缺氧狀態(tài)，因此COPD患者合并單純性脂肪肝和非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的發(fā)病率分別高達(dá)41.4%和36.9%，顯著高于未罹患COPD者[11]。此外，有研究顯示阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征引起的間歇性缺氧可導(dǎo)致氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、炎癥和交感神經(jīng)系統(tǒng)過度激活，是NAFLD發(fā)病和進(jìn)展[12-14]的風(fēng)險(xiǎn)因素之一。上述發(fā)現(xiàn)提示我們，缺氧狀態(tài)是NAFLD發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)因素之一。缺氧誘導(dǎo)因子1 (hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子中的PER-ARNT-SIM(PAS)亞家族，是細(xì)胞和組織對(duì)缺氧應(yīng)激反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子[15]。HIF-1的靶基因包括血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和促紅細(xì)胞生成素等。HIF-1通過與靶基因啟動(dòng)子內(nèi)的缺氧應(yīng)答元件結(jié)合調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，增加組織供氧、減少氧耗，以便機(jī)體和組織適應(yīng)缺氧狀態(tài)[16]。HIF-1是由缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α)和缺氧誘導(dǎo)因子1β(hypoxia-inducible factor 1β，HIF-1β)兩個(gè)亞基組成的異源二聚體，其中HIF-1α亞基的穩(wěn)定性受到細(xì)胞內(nèi)氧濃度的調(diào)節(jié)，HIF-1β則不受氧濃度調(diào)節(jié)能夠恒定表達(dá)。在常氧條件下，HIF-1α在脯氨酰羥化酶作用下特定脯氨酸殘基位點(diǎn)發(fā)生羥基化反應(yīng)。羥基化的HIF-1α能夠被von hippel-lindau(VHL)腫瘤抑制基因識(shí)別，作為泛素連接酶E3復(fù)合體的底物發(fā)生多聚泛素化，進(jìn)而被蛋白酶復(fù)合體降解。在缺氧條件下，脯氨酰羥化酶活性受到抑制，HIF-1α轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，與HIF-1β亞基聚合生成具有轉(zhuǎn)錄因子活性的HIF-1[17]。因此，HIF-1α是一種缺氧誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，是細(xì)胞和組織缺氧的標(biāo)志。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí),短期高脂飲食后，早在炎癥反應(yīng)和IR尚未發(fā)生之前，即可出現(xiàn)白色脂肪缺氧和HIF-1α表達(dá)上調(diào)[18]。研究顯示兒童NAFLD患者往往伴有組織缺氧和HIF-1α表達(dá)上調(diào)[19]，提示缺氧是早期炎癥反應(yīng)和脂肪組織功能紊亂的重要特征，HIF-1α在這一過程中可能有重要的調(diào)節(jié)作用。本研究通過飼喂高脂飲食和蛋氨酸-膽堿缺乏飲食(methione-choline deficient，MCD)飲食構(gòu)建兩種不同的NAFLD小鼠模型，分別檢測(cè)其肝組織缺氧程度、HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)水平，并采用HIF-1α ShRNA腺病毒載體感染小鼠肝星狀細(xì)胞JS-1細(xì)胞，檢測(cè)其細(xì)胞活性并提取細(xì)胞總RNA，行逆轉(zhuǎn)錄后采用Real-time PCR法檢測(cè)細(xì)胞1型膠原(COL1)和3型膠原(COL3)、TNF-α、IL-1β和TGF-β1等基因mRNA水平，以進(jìn)一步探討HIF-1α對(duì)NAFLD發(fā)病的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、細(xì)胞和試劑 雄性C57BL/6J小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。JS-1細(xì)胞株購自雅吉生物有限公司。HIF-1α ShRNA腺病毒載體購自吉?jiǎng)P基因?；A(chǔ)飼料和MCD飼料均購自美迪森生物有限公司。胎牛血清和DMEM培養(yǎng)基購自Gibco。麻醉藥物、甲醛固定液、HE染色液、TRIzol RNA抽提試劑、MTT試劑盒等購自碧云天生物技術(shù)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Real-time SYBR Green試劑購自大連Takara公司，所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。缺氧探針檢測(cè)試劑盒購自北京博蕾德科技發(fā)展有限公司。

1.2 NAFLD模型的制備 給予30只小鼠飼喂基礎(chǔ)飼料1 w后，隨機(jī)分為3組，每組10只，其中正常飲食對(duì)照組10只，飼喂基礎(chǔ)飼料；高脂飲食模型組10只，飼喂高脂飼料，自由攝食飲水，高脂飼料配比如下：基礎(chǔ)飼料88%、豬油10%、膽固醇2%；MCD模型組10只，飼喂MCD飼料，自由攝食飲水。在實(shí)驗(yàn)第12 w末，將小鼠禁食12 h后測(cè)量體質(zhì)量，給予氯胺酮0.2 g.kg-1腹腔注射麻醉，分離肝臟組織，切取0.5 cm× 0.5 cm× 0.5 cm大小肝組織經(jīng)甲醛固定液固定，行石蠟包埋切片，將剩余的肝臟組織儲(chǔ)存于液氮中，用于RNA和蛋白抽提。根據(jù)NAFLD活動(dòng)度積分(NAFLD activity score，NAS)標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算肝組織NAS積分[20]，評(píng)估各組脂肪肝程度。NAS積分評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為0～8分：①肝細(xì)胞脂肪變：0分(<5%)，1分(5%～33%)，2分(34%～66%)，3分(>66%)；②小葉內(nèi)炎癥(20倍鏡計(jì)數(shù)壞死灶)：0分為無壞死灶，1分(<2個(gè))，2分(2～4個(gè))，3分(>4個(gè))；③肝細(xì)胞氣球樣變：0分為無，1分，少見，2分，多見。其中，對(duì)NAS<3分者，排除NASH診斷，NAS=3分或4分者為臨界NASH，NAS≥5分者為確診NASH。

1.3 肝組織缺氧程度的評(píng)估 在處死動(dòng)物前6 h，經(jīng)尾靜脈注射派諾硝唑探針溶液60 mg.kg-1，分離部分肝臟組織，經(jīng)甲醛固定，行石蠟包埋切片，用于后續(xù)染色以評(píng)估缺氧程度。

1.4 HIF-1α低表達(dá)JS-1細(xì)胞株的構(gòu)建 將細(xì)胞凍存管在37 ℃水浴中快速搖晃融化，加入5 ml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基混勻，1000 r/m離心4 min，棄上清，加上述培養(yǎng)基2 ml，吹勻后將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱(溫度37 ℃，濕度95%，CO25%)。待細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)傳代，待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為3組，即對(duì)照組、腺病毒載體組和HIF-1α ShRNA腺病毒載體感染組。傳代接種密度為8×104個(gè)細(xì)胞/孔(6孔板)或2500個(gè)細(xì)胞/孔(96孔板)，接種后22～24 h換液，在實(shí)驗(yàn)組分別同時(shí)加入腺病毒載體或HIF-1α ShRNA腺病毒載體：1×108/孔(6孔板)或3×106/孔(96孔板)。輕柔搖晃培養(yǎng)板。繼續(xù)培養(yǎng)24 h換液。接種于6孔板的細(xì)胞于傳代后48 h收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA和蛋白，分別采用Real-time PCR和Western blotting法檢測(cè)證實(shí)HIF-1α ShRNA腺病毒載體感染組細(xì)胞HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組和腺病毒載體組明顯下降(P<0.05，圖1)。經(jīng)Real-time PCR檢測(cè)各組細(xì)胞COL1、COL3、TNF-α、IL-1β和TGF-β1 mRNA水平。接種于96孔板的細(xì)胞于傳代后48 h更換含0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，采用MTT試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞活性。

圖1 HIF-1α低表達(dá)JS-1細(xì)胞株的構(gòu)建 a： HIF-1α ShRNA腺病毒載體感染組JS-1細(xì)胞HIF-1α mRNA水平較對(duì)照組和腺病毒載體組顯著下降(P<0.05)；b和c：HIF-1α ShRNA腺病毒載體感染組JS-1細(xì)胞HIF-1α 蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組和腺病毒載體組顯著下降

2 結(jié)果

2.1 小鼠脂肪肝模型建立成功 在光鏡下，正常組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則；高脂飲食模型組和MCD模型組小鼠肝組織可見明顯的肝細(xì)胞脂肪變和肝細(xì)胞氣球樣變，間質(zhì)可見炎性細(xì)胞浸潤(圖2)。在第12 w末，高脂飲食模型組NAS積分為6.170±0.302，顯著高于對(duì)照組(0.020±0.042，P<0.05)，MCD模型組NAS積分為5.940±0.241，也顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，證實(shí)高脂飲食和MCD模型組小鼠肝組織符合NASH診斷。

圖2 小鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn) (HE，200×) 高脂飲食模型組：小鼠肝組織可見大面積肝脂肪變性和肝細(xì)胞氣球樣變，間質(zhì)可見炎性細(xì)胞浸潤，可見少量點(diǎn)狀壞死灶和Mallory小體；MCD模型組：小鼠肝組織可見中到重度肝脂肪變性，可見肝細(xì)胞氣球樣變，間質(zhì)可見炎性細(xì)胞浸潤，壞死灶和Mallory小體罕見

2.2 小鼠肝組織缺氧情況 見圖3。

圖3 小鼠肝組織缺氧探針染色表現(xiàn)(派諾硝唑探針，200×) 缺氧探針試劑盒染色顯示高脂飲食模型組和MCD模型組小鼠肝組織染色陽性率分別為85%和78%，顯著高于對(duì)照組的7%(P<0.05)

2.3 三組肝組織HIF-1αmRNA及其蛋白表達(dá)比較 見圖4。

圖4 三組肝組織HIF-1αmRNA及其蛋白表達(dá)比較 左圖：高脂飲食模型組和MCD模型組小鼠肝臟HIF-1α mRNA水平分別為對(duì)照組小鼠的2.1倍和1.6倍(P<0.05)；右圖：高脂飲食組和MCD組小鼠肝臟HIF-1α蛋白表達(dá)水平明顯增強(qiáng)

2.4 HIF-1α ShRNA抑制小鼠肝星狀細(xì)胞HIF-1α表達(dá)后細(xì)胞活力情況 見圖5。

圖5 三組活力變化 HIF-1α ShRNA腺病毒載體感染組細(xì)胞活力較對(duì)照組或空載體組明顯下降，僅為對(duì)照組的37%(P<0.05)

2.5 三組細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子mRNA水平比較 見圖6。

圖6 三組細(xì)胞相關(guān)因子mRNA水平變化 a： HIF-1α ShRNA腺病毒載體感染組細(xì)胞COL1和COL3 mRNA水平較對(duì)照組或腺病毒載體組明顯下降(P<0.05)；b：HIF-1α ShRNA腺病毒載體感染組細(xì)胞TNF-α、IL-1β、TGF-β1 mRNA較對(duì)照組或腺病毒載體組均明顯下降(P<0.05)

3 討論

NAFLD的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜。缺氧是脂肪組織功能障礙的關(guān)鍵影響因素。大量研究證實(shí)缺氧狀態(tài)是早期炎癥反應(yīng)和脂肪組織功能紊亂的重要特征，也是NAFLD發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)因素之一。HIF-1α受缺氧的誘導(dǎo)，是細(xì)胞和組織缺氧的標(biāo)志。本研究分別通過飼喂高脂飲食和MCD飲食構(gòu)建兩種不同的NAFLD小鼠模型，檢測(cè)肝組織缺氧程度、HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)水平或采用HIF-1α ShRNA腺病毒載體感染小鼠肝星狀細(xì)胞JS-1細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞活性并檢測(cè)COL1、COL3、TNF-α、IL-1β、TGF-β1等基因mRNA水平，以進(jìn)一步探討HIF-1α對(duì)NAFLD發(fā)病的影響。結(jié)果顯示，高脂飲食模型組和MCD模型組小鼠肝組織明顯缺氧，且HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯增強(qiáng)，提示缺氧在NAFLD發(fā)生和進(jìn)展過程中有重要作用，HIF-1α可能參與調(diào)節(jié)這一過程。我們進(jìn)一步采用HIF-1α ShRNA腺病毒載體感染JS-1細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞活力明顯下降，COL1、COL3、TNF-α、IL-1β、TGF-β1 等相關(guān)基因mRNA水平也明顯下降，提示抑制HIF-1α表達(dá)能夠抑制肝星狀細(xì)胞活化、膠原合成和炎性細(xì)胞介質(zhì)的分泌，意味著抑制HIF-1α表達(dá)可能延緩NAFLD進(jìn)展，為NAFLD治療提供新的靶點(diǎn)和研究方向。