郭寧杰，李揚揚，賈真真，崔忠澤，路麗禎，吳淑華

目前，化療仍然是腫瘤患者術(shù)后輔助治療或姑息治療的主要方式之一，然而多藥耐藥性的產(chǎn)生嚴(yán)重影響患者生存期。腫瘤產(chǎn)生耐藥性的因素眾多，其中最經(jīng)典的分子機制是7號染色體上多藥耐藥基因MDR1的過表達，其編碼的跨膜糖蛋白(P-gp)可將抗腫瘤藥物泵出細胞外，使細胞內(nèi)藥物濃度降低，進而介導(dǎo)腫瘤多藥耐藥，嚴(yán)重影響臨床化療效果。因此，抑制MDR1蛋白的過表達，有可能成為逆轉(zhuǎn)耐藥的新途徑。新近研究發(fā)現(xiàn)，熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(heat shock factor 1, HSF1)在多種惡性腫瘤中高表達，可促進腫瘤細胞的存活和增殖[1-4]。HSF1可通過結(jié)合下游靶基因啟動子區(qū)的熱休克元件，進而促進下游基因的轉(zhuǎn)錄，并調(diào)控蛋白表達。近年，腫瘤中HSF1與非熱休克蛋白表達的關(guān)系受到關(guān)注[5]。本課題組前期實驗結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌中HSF1和MDR1具有相關(guān)性[6]。本實驗采用RNA干擾(RNA interference, RNAi)技術(shù)，通過抑制或過表達HSF1，觀察HSF1表達差異對HCT-8/FU細胞株增殖、克隆、侵襲能力及常用化療藥物5-FU、伊立替康耐藥性的影響，為抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展并逆轉(zhuǎn)耐藥提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料人回盲部結(jié)腸腺癌細胞株HCT-8及其耐藥細胞株HCT-8/FU購自中國科學(xué)院細胞庫；胎牛血清和PRMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；靶向HSF1基因的特異性慢病毒序列、無義序列組慢病毒及轉(zhuǎn)染增強試劑，均由上海吉凱公司設(shè)計提供；HSF1、MDR1、Cyclin D1、MMP-2與BCL-2抗體，均購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔多克隆IgG抗體II抗購自福州邁新公司；CCK-8購自日本同仁研究所；吉姆薩染液購自北京索萊寶公司；Transwell雙層細胞培養(yǎng)板購自美國Corning公司；Western blot實驗中凝膠試劑盒、RIPA細胞裂解液等試劑盒，均購自江蘇碧云天公司；RT-PCR實驗中RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒等，均購自日本Takara公司；HSF1及MDR1、GAPDH特異性引物序列由Takara公司合成。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人回盲部結(jié)腸腺癌細胞株HCT-8及其耐藥細胞株HCT-8/FU在RPMI 1640培養(yǎng)基和5%胎牛血清培養(yǎng)基中于37 ℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將HCT-8/FU細胞接種于含有5 μmol/L的5-FU培養(yǎng)基中培養(yǎng)1周，以維持其耐藥性表型，每隔2天換液1次，每3天用0.25%的胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染 設(shè)計并合成2條靶向HSF1基因特異性序列，其中1條為抑制HSF1的序列，命名為HSF1-RNAi，另一條為過表達HSF1的序列，命名為LV-HSF1，同時設(shè)計1條無義干擾組序列，命名為無義序列組，轉(zhuǎn)染實驗參照RNAi-mate產(chǎn)品說明書進行操作，優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。轉(zhuǎn)染前一天將HCT-8/FU細胞接種于6孔板中，共設(shè)置4組，分別為空白對照組(未行任何干預(yù)的HCT-8/FU細胞)、無義序列組(轉(zhuǎn)染無義序列組慢病毒的HCT-8/FU細胞)、HSF1-RNAi組(轉(zhuǎn)染抑制HSF1基因組慢病毒的HCT-8/FU細胞)、LV-HSF1組(轉(zhuǎn)染過表達HSF1基因組慢病毒的HCT-8/FU細胞)。利用Hitrans G感染增強液輔助轉(zhuǎn)染，將配比好的siRNA和增強液及培養(yǎng)基混勻后加入6孔板中，使試劑均勻覆蓋細胞。8 h后更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)細胞48 h觀察熒光的表達。連續(xù)培養(yǎng)72 h后將轉(zhuǎn)染的細胞在8 μg/mL的嘌呤霉素中培養(yǎng)4周，選擇并擴增具有嘌呤霉素抗性和熒光標(biāo)記的細胞，細胞經(jīng)RT-PCR檢測確定轉(zhuǎn)染成功后，用于后續(xù)實驗。

1.2.3RT-PCR法 使用TB Green嵌合熒光染料法進行相對定量PCR檢測。HSF1、MDR1、GAPDH的轉(zhuǎn)錄物通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測4個細胞組分離的總核糖核酸的相對定量。使用RNA提取試劑盒提取待測細胞的總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA鏈，以cDNA為模板加入引物(表1)，使用CFX96逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測系統(tǒng)進行聚合酶鏈反應(yīng)擴增。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s、GOTO 95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，合計40個循環(huán)。RT-PCR結(jié)果由系統(tǒng)軟件自動分析而成，采用ΔΔCT法，各組樣品的相對表達量=2-ΔΔCT，ΔΔCT=實驗組ΔCT-空白對照組ΔCT，ΔCT=目的基因CT值-GAPDH CT值。實驗重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

表1 RT-PCR引物序列

1.2.4Western blot法 收集各組細胞，并將細胞在含有新添加的蛋白酶抑制劑PMSF的RIPA裂解緩沖液中裂解。將蛋白質(zhì)裂解物與5×上樣緩沖液按比例混合后，沸水浴煮樣5 min，取10 μL蛋白加載到聚丙烯酰胺凝膠上，用SDS-PAGE分離，電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%奶粉在TBST緩沖液中置于搖床上封閉1.5 h，加入一抗HSF1(稀釋度1 ∶50 000)、P-gp(稀釋度1 ∶2 000)、Cyclin D1(稀釋度1 ∶10 000)、BCL-2(稀釋度1 ∶2 000)、MMP-2(稀釋度1 ∶3 000)及β-actin(稀釋度 1 ∶3 000)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜，與相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗在室溫下孵育1 h(稀釋度1 ∶10 000)，TBST洗膜，使用凝膠成像系統(tǒng)ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，曝光成像。Image J軟件掃描灰度值，以β-actin內(nèi)參灰度值為對照，目的基因蛋白相對表達量=目的基因灰度值/β-actin灰度值×100%，用其比值作圖，實驗重復(fù)3次。

1.2.5CCK-8實驗 細胞增殖測定使用細胞計數(shù)試劑盒CCK-8。取未轉(zhuǎn)染的細胞為空白對照組及實驗組(無義序列組、HSF1-RNAi組、LV-HSF1組)接種細胞于96孔板中，每組設(shè)5個復(fù)孔。在未接種細胞的孔中加入不含血清的培養(yǎng)基作為調(diào)零孔，培養(yǎng)24 h后吸去培養(yǎng)基，并將完整培養(yǎng)基(200 μL)添加到每個孔中(伊立替康濃度分別為10、50、100、150、200 μmol/L；5-FU濃度分別為5、10、50、100和200 μmol/L)。48 h后，向每孔中加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h。使用酶標(biāo)儀測定450 nm處每個孔的吸光度值(OD)，實驗進行3次。根據(jù)OD值計算細胞存活率，細胞存活率=OD實驗組/OD對照組×100%。根據(jù)細胞活力和藥物濃度繪制The dose反應(yīng)曲線。

1.2.6細胞侵襲試驗 將Matrigel基質(zhì)膠按1 ∶6與RPMI 1640培養(yǎng)基混合，取60 μL鋪入Transwell室的上部，37 ℃孵育3 h。在24孔板內(nèi)每孔加入600 μL含有20%的FBS RPMI 1640培養(yǎng)基，將小室置于孔內(nèi)，調(diào)整細胞數(shù)至每毫升1×105個，取100 μL細胞溶液加入Transwell小室，封閉24 h。用棉簽將膜頂部的非遷移性細胞清除，甲醇固定，吉姆薩染色，倒置顯微鏡下觀察。隨機分析每個腔室的3個視野，計算每個視野的平均穿膜細胞數(shù)，實驗進行3次。

1.2.7平板克隆實驗 分別取對數(shù)生長期每孔1×103個細胞接種于6孔板中，并加入2 mL 10% FBS RPMI 1640。細胞在37 ℃ 5%CO2中孵育1～2周。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的細胞克隆球時，培養(yǎng)終止。采用吉姆薩染色，在100×視野下計數(shù)并拍照。分析每個培養(yǎng)皿中的3個隨機區(qū)域，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌耐藥細胞株中HSF1、MDR1的表達采用Western blot法檢測HCT-8/FU細胞與其親本細胞系(HCT-8)中HSF1、MDR1的表達。結(jié)果顯示，HCT-8/FU細胞中HSF1蛋白表達明顯高于HCT-8細胞株；與HCT-8細胞株相比，HCT-8/FU細胞中MDR1的蛋白表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖1)。

圖1 Western blot法檢測HCT-8及HCT-8/FU細胞株中HSF1、MDR1(P-gp)的表達

2.2 各組中HSF1 mRNA、蛋白的表達通過攜帶特定上調(diào)或下調(diào)HSF1序列的慢病毒分別轉(zhuǎn)染HCT-8/FU，嘌呤霉素篩選以獲得穩(wěn)定敲除HSF1及過表達HSF1細胞株，以轉(zhuǎn)染無義序列組的穩(wěn)定細胞株作為無義序列組。通過倒置熒光顯微鏡觀察各組細胞株中慢病毒的熒光蛋白表達，各組間的細胞形態(tài)無明顯變化(圖2)。

圖2 各組轉(zhuǎn)染慢病毒的熒光表達：A.無義序列組熒光圖；B.HSF1-RNAi組熒光圖；C.LV-HSF1組熒光圖；D.無義序列組白光圖；E.HSF1-RNAi組白光圖；F.LV-HSF1組白光圖

本實驗結(jié)果顯示，HSF1-RNAi組中HSF1 mRNA及蛋白表達水平明顯低于空白對照組及無義序列組，而LV-HSF1組中HSF1的mRNA、蛋白表達水平明顯高于空白對照組及無義序列組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3)。無義序列組中HSF1的mRNA、蛋白水平與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖3)；提示已獲得穩(wěn)定敲除HSF1及過表達HSF1細胞株。

圖3 各組中HSF1 mRNA及蛋白的表達：A.HSF1 mRNA的表達量；B.HSF1蛋白的表達量及柱狀統(tǒng)計圖

2.3 不同HSF1表達對MDR1 mRNA、蛋白的影響實驗結(jié)果顯示，HSF1-RNAi組中MDR1 mRNA及蛋白表達水平明顯低于空白對照組及無義序列組，而LV-HSF1組中MDR1的mRNA及蛋白表達水平明顯高于空白對照組及無義序列組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖4)。無義序列組中MDR1的mRNA及蛋白水平與空白對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖4)。

圖4 各組中MDR1的mRNA及蛋白表達: A.P-gp mRNA的表達量；B.P-gp蛋白的表達量及柱狀統(tǒng)計圖

2.4 不同HSF1表達對Cyclin D1、MMP-2與BCL-2的影響實驗結(jié)果顯示，HSF1-RNAi組中Cyclin D1、MMP-2與BCL-2的蛋白表達水平明顯低于空白對照組及無義序列組，而LV-HSF1組中Cyclin D1、MMP-2與BCL-2的蛋白表達水平明顯高于空白對照組及無義序列組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖5)，而Cyclin D1、MMP-2與BCL-2蛋白在空白對照組與無義序列組中的表達差異無顯著性(P>0.05，圖5)。

圖5 Western blot法檢測不同因子在各組間的表達量：A.Western blot法檢測各因子蛋白表達量；B.BCL-2蛋白表達柱狀統(tǒng)計圖；C.Cyclin D1蛋白表達柱狀統(tǒng)計圖；D.MMP-2蛋白表達柱狀統(tǒng)計圖

2.5 HSF1表達差異對細胞株的克隆能力及侵襲能力的影響平板克隆實驗結(jié)果顯示，HSF1-RNAi組與空白對照組比較，其HCT-8/FU細胞的群體依賴性及增殖能力明顯下降，而LV-HSF1組中細胞表現(xiàn)出群體依賴性和增殖能力的增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。無義序列組與空白對照組增殖能力差異無顯著性(P>0.05，圖6A)。

Transwell實驗結(jié)果顯示，HSF1-RNAi組與空白對照組相比，其穿過具有基質(zhì)凝膠透孔的細胞數(shù)量顯著減少，而LV-HSF1組穿孔細胞明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，無義序列組與空白對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖6B)。

圖6 平板克隆實驗(A)及Transwell實驗(B)檢測HSF1的表達差異對細胞株的克隆及侵襲能力的影響

2.6 HSF1表達差異細胞株對伊立替康和5-FU化學(xué)的敏感性采用CCK-8實驗檢測各組細胞株的增殖活性，觀察不同HSF1表達細胞株對不同濃度的伊立替康和5-FU的化學(xué)敏感性。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，HSF1-RNAi組分別對伊立替康和5-FU的化學(xué)敏感性呈濃度依賴性增強，細胞活性明顯降低；而LV-HSF1組細胞則表現(xiàn)對伊立替康和5-FU的耐藥性增強，細胞活性明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖7)，空白對照組與無義序列組細胞對藥物敏感性差異無顯著性(P>0.05，圖7)。

圖7 各組細胞株對5-FU及伊立替康的敏感性：A.5-FU劑量反應(yīng)曲線；B.伊立替康劑量反應(yīng)曲線

3 討論

HSF1是真核生物熱休克反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子。HSF1以未活化的單體形式存在于細胞質(zhì)中，當(dāng)受到外界刺激時，如生物、化學(xué)(化療藥物)、物理(熱應(yīng)激)等有害條件的刺激時，活化為三聚體進入細胞核，進入胞核的HSF1可結(jié)合下游目的基因，從而調(diào)控相關(guān)基因的表達[7]。HSF1活化是瞬時的，并隨著應(yīng)激緩和而減弱。但腫瘤細胞中HSF1通常表現(xiàn)出持續(xù)活化狀態(tài)，即HSF1在長期蛋白毒性壓力下，其介導(dǎo)的蛋白毒性應(yīng)激反應(yīng)可維持腫瘤細胞穩(wěn)態(tài)，促進腫瘤細胞存活[8]。新近研究顯示，多種類型的人類惡性腫瘤中HSF1均呈高表達，其可形成一種腫瘤細胞保護性機制以促進細胞存活增殖和侵襲轉(zhuǎn)移，從而影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9-15]。HSF1促癌作用是復(fù)雜的，其可以參與多種信號通路誘導(dǎo)癌細胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，膽囊癌中活化的HSF1信號增加TGF-β1的表達和旁分泌信號，誘導(dǎo)癌旁成纖維細胞向腫瘤相關(guān)成纖維細胞的轉(zhuǎn)分化，導(dǎo)致癌旁成纖維細胞向膽囊癌募集，并增加腫瘤相關(guān)成纖維細胞中血小板反應(yīng)蛋白的表達，從而促進膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展[16]。研究表明，HSF1通過調(diào)節(jié)干細胞標(biāo)記SOX2的表達，激活MMP-2，增強癌干細胞特性[17]。同時HSF1可抑制E-cadherin的表達，促進β-catenin及MMP-2的表達，從而促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。本課題組前期實驗結(jié)果顯示，HSF1在結(jié)直腸癌中表達增高，并與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)[18]，但其分子機制尚不明確。本實驗通過體外細胞培養(yǎng)，采用RNAi技術(shù)觀察HSF1對結(jié)直腸癌細胞的影響。實驗結(jié)果顯示，LV-HSF1細胞株中細胞周期素Cyclin D1與抗細胞凋亡因子BCL-2的表達均升高，并且與腫瘤細胞侵襲相關(guān)的因子MMP-2表達亦同時升高；細胞生物學(xué)行為顯示腫瘤細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力及細胞群體依賴性、增殖能力均明顯增強；而HSF1-RNAi細胞株中則表現(xiàn)為Cyclin D1、MMP-2與BCL-2的表達降低，腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移及增殖能力下降。即高表達HSF1的結(jié)直腸癌細胞具有更強的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力。實驗推測，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中HSF1作為轉(zhuǎn)錄因子，可不依賴熱休克反應(yīng)，而啟動調(diào)控下游多種靶基因，促進腫瘤增殖、抗凋亡，進而發(fā)生侵襲及轉(zhuǎn)移。HSF1在多種信號通路中的交互作用使其成為癌癥發(fā)展過程中至關(guān)重要的分子，有可能成為潛在的靶點。

在熱休克反應(yīng)中，活化后的HSF1以三聚體形式進入胞核，可特異性結(jié)合下游靶基因啟動子區(qū)5′端的熱休克元件(heat shock element, HSE)，啟動靶基因的轉(zhuǎn)錄翻譯，從而調(diào)控目的基因的表達[19]。有研究發(fā)現(xiàn)，HSF1不僅可與熱休克蛋白基因啟動子區(qū)的HSE結(jié)合，啟動熱休克蛋白的轉(zhuǎn)錄，同時也可啟動非熱休克蛋白家族基因的轉(zhuǎn)錄[20-21]。HSF1可與Snail的熱休克元件區(qū)結(jié)合以促進其表達，進而通過調(diào)控上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化促進遷移[22]。新近研究顯示[23]，多藥耐藥基因MDR1基因啟動子區(qū)域中存在熱休克元件。在小鼠的心肌細胞和肝細胞中，沉默HSF1可增強MDR1蛋白(P-gp)的表達[24]。在小鼠和人類肺癌A549細胞以及人類乳腺癌T47D細胞、MCF7細胞中，MDR1的表達與HSF1的表達呈正相關(guān)[25]。由此可見，HSF1與MDR1的表達有關(guān)，但兩者的調(diào)控關(guān)系尚存在爭議。本課題組前期實驗結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌中HSF1高表達組中MDR1的表達明顯高于HSF1陰性組，兩者呈正相關(guān)，但未對其調(diào)控機制進行深入分析。本實驗結(jié)果顯示，通過沉默結(jié)直腸癌耐藥細胞株中的HSF1，發(fā)現(xiàn)MDR1的mRNA及蛋白水平均明顯下降，而上調(diào)HSF1后，MDR1的表達明顯增高；提示HSF1可調(diào)控MDR1的轉(zhuǎn)錄及翻譯。作者認(rèn)為HSF1有可能是通過與MDR1啟動子區(qū)的HSE結(jié)合，啟動MDR1的轉(zhuǎn)錄，進而調(diào)控MDR1蛋白的表達，誘導(dǎo)腫瘤耐藥。

研究發(fā)現(xiàn)，HSF1與乳腺癌細胞的雌激素抵抗有關(guān)，HSF1的過表達導(dǎo)致了雌激素α降解，雌激素受體α激活基因表達減少，降低HSF1水平則恢復(fù)雌激素受體α的表達并恢復(fù)對抗雌激素的反應(yīng)[26]。在結(jié)直腸癌中，有關(guān)HSF1誘導(dǎo)5-FU和伊立替康耐藥的發(fā)生機制鮮見報道。本實驗結(jié)果顯示，人結(jié)腸腺癌5-FU耐藥細胞株中HSF1 mRNA及蛋白表達水平均明顯高于親本細胞株。應(yīng)用RNAi技術(shù)后，同一藥物濃度梯度下，沉默HSF1的腫瘤細胞對伊立替康和5-FU的化學(xué)敏感性增強，而過表達HSF1的細胞對伊立替康和5-FU耐藥性明顯增強。我們認(rèn)為過表達HSF1后可增強MDR1轉(zhuǎn)錄及翻譯，以促進MDR1蛋白(P-gp)的表達，進而使腫瘤細胞將藥物逆濃度梯度轉(zhuǎn)運出細胞外，使腫瘤細胞內(nèi)活性藥物減少，減少了對腫瘤的殺傷作用，并介導(dǎo)腫瘤的多藥耐藥性。同時，HSF1過表達導(dǎo)致的腫瘤細胞增殖活性、抗凋亡能力及侵襲能力的增強，也在一定程度上增加了腫瘤細胞對化療藥物的抵抗力。

綜上所述，HSF1不但可增強腫瘤細胞克隆及侵襲能力，促進腫瘤細胞增殖，同時可啟動MDR1轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致MDR1蛋白(P-gp)高表達，從而增加化療藥物的外排，削弱化療藥物的殺傷作用，導(dǎo)致腫瘤細胞耐藥。本實驗僅通過RNAi技術(shù)對HSF1與MDR1的相互作用及其分子機制進行初步分析，兩者是否可通過HSE結(jié)合而直接作用，并發(fā)揮生物學(xué)功能尚未驗證，以及體外實驗中HSF1表達的改變能否影響腫瘤的致瘤性，仍有待進一步分析。因此，深入探討HSF1及MDR1相互作用的分子機制，對尋找新的個性化分子靶向治療方案、抑制腫瘤生長及逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥具有重要意義。