李素芬，李 彬，普元倩，楊 娜，王唯斯，自加吉，余 敏，熊 偉

肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見的原發(fā)性肝癌，發(fā)病率和病死率均較高[1]。肝癌可以通過手術切除、肝移植、肝定向療法和全身療法進行治療，但肝癌的3年生存率僅為12.7%，中位生存期為9個月[2]。線粒體轉錄延伸因子(mitochondrial transcription elongation factor, TEFM)基因又被命名為C17orf42，定位于人的17q11.2，含有4個外顯子，mRNA全長為1 357 bp，編碼1個由360個氨基酸殘基組成的蛋白質[3]。Agaronyan等[4]首次報道，TEFM是調控線粒體基因組轉錄與復制相互轉換的關鍵分子。研究證實，TEFM具有調控線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)轉錄延伸和抗轉錄終止的功能[5]，并且參與線粒體RNA的轉錄后加工[6]，與線粒體能量產(chǎn)生及線粒體疾病的發(fā)生密切相關[7]。隨著對TEFM的深入研究發(fā)現(xiàn)，TEFM基因缺失或表達異?？赡軐е乱认侔8]、I型神經(jīng)纖維瘤[9]和腦膠質瘤[10]等惡性腫瘤的發(fā)生，但TEFM蛋白在HCC組織中的表達及與臨床病理學特征的相關性尚未見報道。本文采用免疫組化法檢測70例HCC組織中TEFM蛋白的表達，分析其表達與臨床病理學特征的關系及對預后的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集70例HCC患者的組織標本，將HCC確診病例組織(70例及復孔)和配對的癌旁組織標本(70例)制成組織芯片，HCC組織芯片樣本購自武漢賽維爾公司。70例HCC患者中男性66例，女性4例，年齡14.0～69.0歲，中位年齡47.5歲；患者均首次確診為HCC，未行放、化療。HCC患者的組織標本根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)/國際抗癌聯(lián)盟(UICC)的TNM分期系統(tǒng)進行分期，其中Ⅰ期25例，Ⅱ期5例，Ⅲ期33例，Ⅳ期7例。本實驗經(jīng)大理大學醫(yī)學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書。

1.2 細胞培養(yǎng)6種人類HCC細胞系(SMMC-7721、BEL-7402、Hep3B、HepG2、QGY-7701、SK-Hep1)和人類正常肝細胞(THLE-2)購自中國科學院上海細胞庫。將細胞用含10%胎牛血清(FBS)和1%抗生素(100 U / mL青霉素、100 mg / L鏈霉素)的高糖DMEM培養(yǎng)基進行體外培養(yǎng)。將所有細胞置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。所有細胞系均通過短串聯(lián)重復序列(short tandem repeat, STR)分析進行鑒定，并使用TransDetect熒光素酶支原體試劑盒檢測是否存在支原體的污染。

1.3 Western blot法從RIPA細胞裂解液中收集蛋白質樣品，并使用二辛可寧酸(bicinchoninic acid, BCA)試劑盒測定總蛋白質濃度。用10%SDS-PAGE凝膠分離50 mg總蛋白的樣品，電轉移置聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。將PVDF膜在TBS中的5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，在4 ℃與兔抗TEFM單克隆抗體(1 ∶1 000, GeneTex, USA)孵育過夜。用TBST洗滌后，將PVDF膜用辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)偶聯(lián)的山羊抗兔IgG(1 ∶5 000, Abcam, USA)在4 ℃下孵育2 h。采用Western blot發(fā)光液檢測蛋白質信號，并用Image Lab 5.2.1軟件進行半定量分析。TEFM蛋白的相對表達水平用目的條帶與內參條帶之間的累積光密度(accumulated optical density, AOD)之比表示，實驗重復3次。

1.4 組織芯片制作HCC組織芯片由武漢賽維爾生物公司制作，70例配對的HCC組織和癌旁組織用4%多聚甲醛固定24 h后，將組織從固定液取出在通風櫥內用手術刀將目的部位組織修平整，將修切好的組織和對應的標簽置于脫水盒內。將脫水盒放進脫水機內依次梯度乙醇進行脫水，將浸好蠟的組織于包埋機內進行包埋、凍臺冷卻，蠟凝固后將蠟塊從包埋框中取出并修整。將修整好的蠟塊置于石蠟切片機，4 μm厚切片，切片漂浮于攤片機40 ℃溫水將組織展平，載玻片將組織撈起，60 ℃烘箱內烤片，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 免疫組化采用免疫組化SP法染色，標本均經(jīng)修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片。石蠟切片脫蠟至水洗，將組織切片置于檸檬酸抗原修復緩沖液(pH 6.0)的修復盒中，于微波爐內進行抗原修復。自然冷卻后將玻片置于PBS(pH 7.4)中洗滌，放入3%雙氧水溶液，阻斷內源性過氧化物酶。滴加3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30 min。在切片上滴加用兔抗人TEFM抗體(1 ∶100)，4 ℃孵育過夜。滴加HRP標記的山羊抗兔IgG二抗覆蓋組織，室溫孵育50 min。滴加新鮮配制的DAB顯色液，蘇木精復染細胞核3 min，中性樹膠封固。使用倒置顯微鏡檢查，圖像采集分析，蘇木精染細胞核為藍色，陽性為棕黃色。

1.6 細胞陽性率判斷使用PANNORAMIC全景切片掃描儀將組織切片上機后，切片會在掃描儀的鏡頭下逐步移動，一邊移動、一邊成像將組織切片的信息均掃描成像形成文件夾。文件夾用CaseViewer 2.2軟件打開，可以1～400倍放大進行觀察。使用Halo v3.0.311.314分析軟件中TMA插件設置芯片組織點直徑大小和行列數(shù)，軟件自動生成編號。使用Indica Labs-Multiplex IHC v2.2.0模塊，分別定量每張芯片每個點的目的區(qū)域陽性細胞數(shù)、總細胞數(shù)，并計算細胞陽性率。

1.7 組織芯片H-score評分將每張切片內陽性的細胞數(shù)及其染色強度以特定的公式轉化成相應的數(shù)值，達到對組織染色目的蛋白質半定量的目的。H-score=∑(陽性細胞數(shù)量×代表著色強度)=(弱陽性細胞的百分比×1)+(中度陽性細胞的百分比×2)+(強陽性細胞的百分比×3)。

2 結果

2.1 TEFM蛋白在6種人類HCC細胞中的表達Western blot實驗結果表明，TEFM蛋白的表達量在BEL-7402細胞中最低(1.412±0.007)，在Hep3B細胞中最高(2.210±0.008) 。與體外培養(yǎng)的人類正常肝細胞(THLE-2)相比，TEFM蛋白的表達量在6種人類HCC細胞系(SMMC-7721、BEL-7402、Hep3B、HepG2、QGY-7701和SK-Hep1)中均顯著上調[(1.803±0.275)倍](P<0.05，圖1)。

圖1 Western blot法檢測TEFM蛋白在正常肝細胞(THLE-3)和6種肝細胞性肝癌細胞中的表達：A.電泳圖；B.直方圖

2.2 HCC、癌旁組織中細胞陽性率和TEFM蛋白的相對表達量HCC組織芯片中收集70例HCC患者的組織標本，該芯片結果包括HCC確診病例組織及復孔和配對的癌旁組織。使用Halo v3.0.311.314分析軟件中TMA插件設置芯片組織點直徑大小和行列數(shù)，軟件自動生成編號(圖2)。本組根據(jù)HCC組織及其癌旁組織的細胞陽性率進行定量分析，結果顯示：HCC組織的細胞陽性率高于其配對癌旁組織(t=2.235，P=0.041，圖3A)。

圖2 肝細胞性肝癌和對應癌旁組織的全芯片組織掃描：其中第1、4、7、10、13、16列為癌旁組織；其余列為肝細胞性肝癌組織

根據(jù)H-score評分比較HCC組織及其配對癌旁組織的TEFM相對表達量，結果發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，HCC組織的TEFM相對表達量增高(t=2.569，P=0.038，圖3B)。

圖3 肝細胞性肝癌和癌旁組織中的細胞陽性率及TEFM相對表達量：A.肝細胞性肝癌組織與癌旁組織的細胞陽性率；B.肝細胞性肝癌組織與癌旁組織的TEFM相對表達量

2.3 不同TNM分期的HCC和癌旁組織中的TEFM相對表達量本組HCC組織芯片結果顯示，TEFM蛋白陽性染色定位于細胞質，呈棕黃色。本組結果顯示，相同TNM分期的TEFM蛋白表達量在

HCC組織中比對應的癌旁組織高，但HCC的TNM分期與TEFM蛋白表達量高低之間并無明顯關聯(lián)(圖4)。

圖4 TEFM蛋白在不同病理分期的肝細胞性肝癌和癌旁組織中的表達：A.Ⅰ期肝細胞性肝癌的癌旁組織；B.Ⅰ期肝細胞性肝癌組織；C.Ⅱ期肝細胞性肝癌的癌旁組織；D.Ⅱ期肝細胞性肝癌組織；E.Ⅲ期肝細胞性肝癌的癌旁組織；F.Ⅲ期肝細胞性肝癌組織；G.Ⅳ期肝細胞性肝癌的癌旁組織；H.Ⅳ期肝細胞性肝癌組織，SP法

2.4 不同分化程度的HCC組織與癌旁組織中TEFM相對表達量根據(jù)HCC的臨床病理結果將HCC組織劃分為高、中和低分化組，HCC細胞分化程度越低，則HCC的惡性程度越高。本組結果顯示，無論高、中分化或者低分化HCC組織中的TEFM蛋白表達水平均高于癌旁組織(圖5)。

圖5 TEFM蛋白在不同分化程度的HCC組織及癌旁組織中的表達：A.高分化肝細胞性肝癌的癌旁組織；B.高分化肝細胞性肝癌組織；C.中分化肝細胞性肝癌的癌旁組織；D.中分化肝細胞性肝癌組織；E.低分化肝細胞性肝癌的癌旁組織；F.低分化肝細胞性肝癌組織，SP法

2.5 HCC組織中TEFM的表達與臨床病理特征的關系根據(jù)H-score評分得出本組TEFM相對表達水平由低到高排列。將TEFM相對表達量按中位表達量進行分組，低于中位表達量的標本為低表達組，高于中位表達量的標本為高表達組。本組TEFM低表達組35例，高表達組35例。統(tǒng)計學分析結果顯示：TEFM相對表達量與AFP差異有統(tǒng)計學意義(P=0.001)；其與患者年齡、性別、腫瘤分期、淋巴結轉移、分化程度、HBV感染、肝硬化、血管侵犯、腫瘤數(shù)量、腫瘤大小、腫瘤包膜完整性和腫瘤復發(fā)均無相關性(P均>0.05，表1)。

表1 肝細胞性肝癌中TEFM蛋白表達與臨床病理特征的關系

2.6 HCC組織中TEFM表達與預后的關系本組應用Kaplan-Meier和Log-rank檢驗HCC患者預后與TEFM表達的關系，繪制總生存期(overall survival, OS)和無瘤生存期(disease-free survival, DFS)生存曲線。結果發(fā)現(xiàn)，TEFM蛋白的表達與HCC患者的OS(P=0.539，圖6A)以及DFS(P=0.994，圖6B)均無相關性。

圖6 TEFM蛋白表達與肝細胞性肝癌預后的關系：A.總生存期；B.無瘤生存期

3 討論

HCC是我國常見惡性腫瘤之一，每年全球有近100萬新的HCC確診病例，中國占病例總數(shù)的50%以上[11]。盡管HCC的早期診斷和HCC的治療取得一定程度進展，但HCC患者的預后仍然較差，復發(fā)率較高[12]。因此，分析HCC發(fā)生、發(fā)展的病理、生理機制，以尋求新的診斷方法，改善HCC患者的預后水平至關重要。TEFM在哺乳動物胚胎發(fā)育、細胞增殖、維持細胞呼吸鏈功能和能量代謝等具有重要作用[13]。目前，TEFM蛋白與HCC的發(fā)生、發(fā)展、臨床病理特征及預后關系尚不明確。

本組首先通過Western blot法檢測人類正常肝細胞(THLE-2)和6種HCC細胞(SMMC-7721、BEL-7402、Hep3B、HepG2、QGY-7701和SK-Hep1)中TEFM蛋白的表達差異。TEFM蛋白在6種人類HCC中的表達與THLE-2相比，其表達均上調。采用組織芯片技術結合免疫組化檢測HCC組織和對應的癌旁組織中細胞陽性率和TEFM蛋白的表達。結果表明：與癌旁組織相比，HCC組織細胞陽性率增高，且TEFM蛋白在HCC組織中表達量增高；提示TEFM基因的作用可能類似于細胞癌基因，參與HCC的發(fā)生。免疫組化結果還顯示，TEFM蛋白僅在HCC組織的細胞質中呈陽性。已有研究表明，HCC的發(fā)生不僅與細胞核內的DNA相關，也與細胞質中的mtDNA密切相關[14]。Qiao等[15]發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，HCC組織中mtDNA拷貝數(shù)降低、突變率增加，通過線粒體轉錄因子A(mitochondrial transcription factor A, TFAM)蛋白過表達促進mtDNA轉錄，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本實驗結果表明，TEFM蛋白也在HCC組織中高表達，提示TEFM蛋白可能與TFAM蛋白協(xié)同作用，促進mtDNA的轉錄，進而調控細胞能量代謝促進HCC發(fā)生。此外，本組還對TEFM蛋白的相對表達量與HCC臨床病理特征的相關性進行分析，結果發(fā)現(xiàn)：TEFM相對表達量與HCC患者的血清AFP有相關性(P<0.01)。由于臨床上僅有血清AFP 的升高并不能直接確診肝癌，單項腫瘤標志物的指標敏感性和特異性有一定的局限，聯(lián)合診斷是提高診斷效能的重要方法之一。TEFM蛋白檢測與血清AFP的檢測聯(lián)合使用，可能成為HCC診斷的輔助手段。本組使用Kaplan-Meier生存模型對TEFM相對表達量和HCC患者預后的關聯(lián)進行分析。結果發(fā)現(xiàn)，TEFM相對表達量與HCC患者OS和DFS均無相關性(P>0.05)，提示TEFM蛋白表達量不能作為HCC患者預后的有效指標。由于本組收集的HCC樣本量較小、人群異質性和缺乏隨機性，導致分析結果可能存在一定的誤差，需擴大樣本的數(shù)量進一步分析。

總之，本組發(fā)現(xiàn)TEFM蛋白在HCC細胞和組織中表達增高，反映TEFM可能為HCC診斷的潛在腫瘤標志物之一。同時，TEFM蛋白檢測可與血清AFP檢測聯(lián)合作為HCC的輔助診斷手段。未來可進一步探索TEFM蛋白在HCC發(fā)生、發(fā)展中的功能，進而尋找有效抑制TEFM過表達的siRNA或小分子抑制劑，有助于HCC的臨床治療。