李欽麗，張繼偉

我國肺癌的發(fā)病率和病死率呈逐年增加趨勢(shì)，已位居各類癌癥的首位[1]。隨著靶向治療的發(fā)展，EGFR突變狀態(tài)已成為指導(dǎo)晚期肺腺癌治療的重要指標(biāo)[2]，其基因狀態(tài)的檢測(cè)對(duì)靶向藥物的選擇起到至關(guān)重要的作用。但肺癌晚期患者已失去手術(shù)機(jī)會(huì)，只能獲取活檢樣本或胸腹水樣本，經(jīng)常規(guī)HE及免疫組化染色，剩余腫瘤組織不足以進(jìn)行EGFR檢測(cè)，直接影響患者的后續(xù)治療。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)HE切片經(jīng)高錳酸鉀草酸和鹽酸乙醇兩種方法褪色后行EGFR基因突變的檢測(cè)進(jìn)行對(duì)比，探討兩種方法對(duì)HE切片褪色后行EGFR檢測(cè)的影響，為腫瘤組織不足的肺癌患者后續(xù)治療提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料選取EGFR 21號(hào)外顯子L858R突變陽性的肺腺癌標(biāo)本3例，每例標(biāo)本各選取1個(gè)蠟塊，4 μm厚連續(xù)切片6張，分為白片組、高錳酸鉀草酸褪色組和鹽酸乙醇褪色組，每組切片2張。

1.2 主要試劑及儀器核酸提取試劑盒(FFPE DNA)、人類EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒、SMA4000超微量紫外可見核酸蛋白分析儀，購自廈門艾德公司；Quant Studio 3D Digital PCR Master Mix v2、EGFR Custom TaqMan SNP Genotyping Assays、Quant Studio 3D Digital PCR System，購自賽默飛公司；Mx3000P型熒光定量PCR儀，購自安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1HE染色與褪色 經(jīng)常規(guī)HE染色后，HE切片用烤片機(jī)加熱，當(dāng)蓋玻片內(nèi)的中性樹膠產(chǎn)生氣泡時(shí)，將切片置入康萊中浸泡至蓋玻片自行脫落。將切片置于新鮮康萊2次，每次5 min，保證洗凈中性樹膠，梯度乙醇(100%、95%、85%、75%)脫去康萊，用蒸餾水沖洗。(1)將切片放入0.5%高錳酸鉀氧化5 min，蒸餾水沖洗干凈，2%草酸溶液漂白，待組織完全變白后用蒸餾水沖洗干凈，顯微鏡下觀察褪色效果；(2)將切片放入新鮮配置的1%鹽酸乙醇15 min，待組織完全變白后用蒸餾水沖洗干凈，顯微鏡下觀察褪色效果。

1.3.2DNA提取和定量 按照核酸提取試劑盒的操作方法，提取上述3組樣本DNA，并用SMA4000超微量紫外可見核酸蛋白分析儀測(cè)量DNA的濃度及純度。

1.3.3ARMS-PCR擴(kuò)增和結(jié)果判讀 取出預(yù)分裝的PCR反應(yīng)試劑，按照EGFR檢測(cè)試劑盒的要求分別加入陰性對(duì)照、樣本和陽性對(duì)照，放入熒光定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，合計(jì)15個(gè)循環(huán)；93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，合計(jì)31個(gè)循環(huán)。60 ℃時(shí)收集FAM和HEX信號(hào)。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，嚴(yán)格按EGFR檢測(cè)試劑盒的判讀要求進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.3.43D Digital PCR擴(kuò)增和結(jié)果判讀 將配制好的反應(yīng)液裝載到芯片上后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。3D Digital PCR擴(kuò)增條件：96 ℃ 10 min，1個(gè)循環(huán)；60 ℃ 2 min，98 ℃ 30 s，合計(jì)39個(gè)循環(huán)；60 ℃ 2 min，10 ℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后，讀取芯片分析結(jié)果，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 DNA的濃度和純度按核酸提取試劑盒的要求提取DNA，各組樣本的DNA最后均用50 μL洗脫液進(jìn)行洗脫。三組樣本DNA的純度均為1.8～2.0，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；高錳酸鉀草酸褪色組和鹽酸乙醇褪色組的DNA濃度均高于白片組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 DNA濃度和純度比較

與白片組相比，*P<0.05

2.2 ARMS-PCR檢測(cè)按照EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒的要求，各組樣本DNA濃度均為1.5 ng/μL。白片組的外控和L858R的Ct值分別為18.77±0.14、22.83±0.05，鹽酸乙醇褪色組的外控和L858R的Ct值分別為18.39±0.23、21.96±0.07，兩者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)，符合試劑盒的結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)，L858R突變陽性。高錳酸鉀草酸褪色組的外控和L858R的Ct值分別為23.94±0.38和27.25±0.64，均高于白片組和鹽酸乙醇褪色組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)，不符合試劑盒的結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)，無法進(jìn)行結(jié)果判讀。

圖1 ARMS-PCR檢測(cè)：A.外控?cái)U(kuò)增曲線；B. EGFR基因L858R突變擴(kuò)增曲線；黃色.陽性對(duì)照；灰色.陰性對(duì)照；藍(lán)色.白片組；綠色.鹽酸乙醇褪色組；紅色.高錳酸鉀草酸褪色組

2.3 3D Digital PCR檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)用高靈敏度的3D Digital PCR技術(shù)進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)，在樣本DNA均為10 ng的條件下，高錳酸鉀草酸褪色組L858R的突變豐度為(16.28±0.50)% 明顯低于白片組(19.93±0.50)%和鹽酸乙醇褪色組(19.41±0.36)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖2 3D Digital PCR檢測(cè)：A.陰性對(duì)照組；B.白片組；C.高錳酸鉀草酸褪色組；D.鹽酸乙醇褪色組；黃色.空白；藍(lán)色.EGFR基因L858R突變型；綠色.EGFR基因L858R突變型+EGFR基因野生型；紅色.EGFR野生型

2.4 DNA片段化比較為明確HE切片經(jīng)高錳酸鉀草酸褪色組樣本DNA不滿足ARMS-PCR檢測(cè)的需要，本實(shí)驗(yàn)利用美國Invivosribe淋巴瘤基因重排檢測(cè)試劑盒中的size ladder檢測(cè)各組樣本DNA的片段長度，白片組和鹽酸乙醇褪色組DNA片段長度主要為100、200、300 bp，而高錳酸鉀草酸褪色組DNA片段長度則主要為100 bp(圖3)。

圖3 DNA片段化檢測(cè)：M. Marker；S1.白片組；S2.高錳酸鉀草酸褪色組；S3.鹽酸乙醇褪色組

3 討論

研究證實(shí)，HE切片褪色后除可重新進(jìn)行HE染色外[3]，還可進(jìn)行免疫組化[4]、原位雜交[5]、免疫熒光[6]和特殊染色[7]檢測(cè)。常用的HE切片褪色方法包括高錳酸鉀草酸氧化漂白法和鹽酸乙醇褪色法[3]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)HE切片經(jīng)上述兩種方法褪色提取DNA的濃度和純度進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩組DNA的純度與白片組相比差異無顯著性，但濃度卻顯著增加，原因可能是兩種方法行HE切片褪色時(shí)，在導(dǎo)致蘇木精和伊紅與細(xì)胞分離的同時(shí)，也改善DNA與蛋白的交聯(lián)，促進(jìn)DNA的暴露，進(jìn)而引起DNA濃度的增加。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)HE切片分別經(jīng)高錳酸鉀草酸和鹽酸乙醇兩種方法褪色后，通過ARMS-PCR和3D Digital PCR兩個(gè)平臺(tái)行EGFR檢測(cè)。在模板量相同的情況下，與白片組相比高錳酸鉀草酸褪色組外控Ct值和L858R突變的Ct值均顯著增大，超出結(jié)果的判讀標(biāo)準(zhǔn)；而鹽酸乙醇褪色組外控Ct值和L858R突變的Ct值與白片組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，明確EGFR基因L858R陽性突變。3D Digital PCR結(jié)果顯示高錳酸鉀草酸褪色組EGFR基因L858R突變豐度明顯低于白片組和鹽酸乙醇褪色組，差異有顯著性，而后兩組之間差異無顯著性。以上結(jié)果表明，HE切片經(jīng)高錳酸鉀草酸褪色時(shí)，盡管獲取的DNA濃度有所增加，但由于高錳酸鉀為強(qiáng)氧化劑，在處理過程中可能導(dǎo)致有效DNA含量降低。本實(shí)驗(yàn)對(duì)三組樣本DNA進(jìn)行片段分析，在PCR擴(kuò)增模板量均為50 ng的條件下，聚丙烯酰氨凝膠電泳結(jié)果顯示，高錳酸鉀草酸褪色組DNA片段化比較嚴(yán)重，最長片段主要為100 bp，而白片組和鹽酸乙醇褪色組最長片段為300 bp以上。以上結(jié)果表明，HE切片經(jīng)高錳酸鉀草酸褪色時(shí)可加重DNA片段化，最終影響EGFR基因突變的檢測(cè)，但鹽酸乙醇褪色法卻不會(huì)導(dǎo)致該結(jié)果的發(fā)生。

綜上所述，在樣本量不足或進(jìn)一步獲取組織樣本受限時(shí)，可以用HE切片褪色后行EGFR突變檢測(cè)，但褪色方法以1%鹽酸乙醇褪色法最佳，其與高錳酸鉀草酸氧化漂白法相比，在增加樣本DNA質(zhì)量的同時(shí)，仍可保持DNA片段的完整性，保證EGFR檢測(cè)結(jié)果的可靠性，有利于非小細(xì)胞肺癌患者個(gè)體化治療方案的實(shí)施。