龔予希，翟博雅，楊野梵，張智弘

原發(fā)性睪丸彌漫大B細胞淋巴瘤(primary testicular diffuse large B-cell lymphoma, PT-DLBCL)以睪丸腫塊為主要臨床表現(xiàn)，屬于少見的結(jié)外非霍奇金淋巴瘤，占原發(fā)性睪丸淋巴瘤(primary testicular lymphoma, PTL)的80%～90%，多見于老年男性[1]。盡管接受睪丸根治性切除術(shù)結(jié)合放、化療患者有60%～70%獲得了完全緩解(complete response, CR)，但仍有部分患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)甚至死亡。本文旨在探討PT-DLBCL的臨床表現(xiàn)、病理學(xué)特征和分子遺傳學(xué)特點及預(yù)后，以提高臨床與病理醫(yī)師的認(rèn)識水平。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2012年1月～2019年12月南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院診治的17例PT-DLBCL標(biāo)本，病理資料包括患者年齡、首發(fā)癥狀、是否伴B癥狀、睪丸外病灶受累數(shù)、Ann Arbor分期、ECOG評分、國際預(yù)后指數(shù)(international prognostic index, IPI)、LDH、β2-MG以及治療方案。其中PT-DLBCL根據(jù)國際結(jié)外淋巴瘤研究小組標(biāo)準(zhǔn)，定義為伴或不伴其他結(jié)外器官累及、以睪丸腫塊為主要臨床表現(xiàn)的DLBCL[2]。本實驗經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)(2020-SR-097)，患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1HE染色 17例PT-DLBCL均進行HE染色，觀察并記錄病灶大小、顏色、質(zhì)地、境界、浸潤范圍、腫瘤細胞形態(tài)、間質(zhì)情況。

1.2.2免疫組化 采用免疫組化MaxVision法染色，一抗包括CD3、CD5、CD10、CD20、BCL-2、BCL-6、MUM1、PLAP、PAX5及Ki-67。根據(jù)Hans分型，將PT-DLBCL分為生發(fā)中心B細胞(germinal center B, GCB)型和非生發(fā)中心B細胞(non-germinal center B, non-GCB)型。

1.2.3基因檢測 根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)挑選合適的病例進行二代測序：(1)行睪丸切除術(shù)并有大標(biāo)本存檔；(2)蠟塊存放年限不超過7年；(3)腫瘤組織占比超過50%。本組有7例患者符合納入標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用二代測序檢測淋巴瘤的112個基因熱點外顯子區(qū)域及11個基因的熱點內(nèi)含子區(qū)域(購自廣州燃石生物公司)。7例樣本均滿足DNA總量≥50 ng、純度260/280在1.8～2.0、Q30≥90%且測序深度達150×等質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。此外，本組17例樣本中隨機選取7例行熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)檢測BCL-6、BCL-2、C-MYC基及p53基因改變。其中，4例同時有二代測序及FISH檢測結(jié)果。

1.3 療效及預(yù)后評估根據(jù)患者的影像學(xué)和血清學(xué)資料評估其療效，分為CR、部分緩解(partial response, PR)、疾病穩(wěn)定(stable disease, SD)以及疾病進展(progressive disease, PD)。采用電話對患者的生存期進行隨訪。總生存期(overall survival, OS)以患者確診開始至死亡時間或隨訪截止時間；無瘤生存期(disease-free survival, DFS)以患者獲得CR至疾病復(fù)發(fā)或隨訪截止時間。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)患者中位年齡63歲，其中發(fā)病年齡<60歲者7例(41.2%)，>60歲者10例(58.8%)。17例患者均表現(xiàn)為受累睪丸腫大(右側(cè)9例、左側(cè)6例、雙側(cè)2例)(圖1)，可伴陰囊疼痛(6/17，35.3%)、皮溫增高(1/17，5.9%)；出現(xiàn)B癥狀者3例(3/17，17.6%)；1例(1/17，5.9%)患者伴患側(cè)腰背部疼痛。4例(23.5%)出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，其中3例伴BCL-6基因斷裂重組，轉(zhuǎn)移部位包括腎、腎上腺、胃、肝、胰腺及中樞神經(jīng)系統(tǒng)。Ann Arbor分期：Ⅰ+Ⅱ期者11例(64.7%)，Ⅲ+Ⅳ期者6例(35.3%)。ECOG評分：0～1分者14例(82.4%)，2～4分者3例(17.6%)。IPI評分：0～2分者13例(76.4%)，3～5分者4例(23.6%)。

圖1 盆腔MR橫軸位，雙側(cè)睪丸鞘膜腔內(nèi)可見類圓形異常信號影，大小分別為5.1 cm×3.9 cm和4.1 cm×3.4 cm，右側(cè)稍大，病灶邊界較清，病灶內(nèi)部信號較均勻

2.2 實驗室檢測7例(41.2%)初診時伴LDH水平或β2-MG水平異常增高。LDH水平異常增高者6例(35.3%，>271 U/L)，β2-MG水平異常增高者6例(35.3%，>2.53 mg/L)，其中5例患者伴這兩種指標(biāo)均異常。

2.3 病理學(xué)檢查

2.3.1眼觀 腫瘤大小2 cm×1 cm×0.5 cm～9 cm×5 cm×4 cm，切面灰白、灰黃色，質(zhì)中，均質(zhì)，魚肉樣。腫物累及精索或附睪者可見腫塊與周圍粘連。

2.3.2鏡檢 低倍鏡下見腫瘤細胞彌漫性生長，可破壞睪丸的正常結(jié)構(gòu)，且以破壞生精小管管壁并浸潤其管腔為主要特征，其中5例(29.4%)保留部分生精小管，9例(52.9%)生精小管萎縮(圖2A)，3例(17.6%)生精小管完全消失。2例(11.8%)同時伴附睪或精索受累(圖2B)?？梢娭車窘Y(jié)締組織浸潤5例(29.4%)、神經(jīng)侵犯3例(17.6%)(圖2C)、血管侵犯7例(41.2%)和白膜受累6例(35.3%)。此外，可見間質(zhì)纖維結(jié)締組織增生伴膠原化5例(29.4%)；出血壞死3例(17.6%)；厚壁血管增生1例(5.9%)。高倍鏡下腫瘤細胞通常為中-大的淋巴細胞，核卵圓形或圓形，染色質(zhì)細，可見1個或多個小核仁，病理性核分裂象易見，細胞質(zhì)通常較少，嗜雙色性或嗜堿性。腫瘤細胞呈中心母細胞樣、免疫母細胞樣或具有間變特點(圖2D)，其中8例(47.1%)以中心母細胞樣細胞為主，7例(41.2%)以免疫母細胞樣細胞為主，2例(11.8%)兩種成分均較多。3例(17.6%)中可見較多的間變細胞，該類細胞具有細胞核大、核不規(guī)則、核仁更清晰等特點。

圖2 A.腫瘤細胞彌漫浸潤，生精小管減少；B.腫瘤細胞浸潤附睪；C.腫瘤細胞侵犯神經(jīng)；D.腫瘤細胞多呈中心母細胞樣(藍色箭頭)、免疫母細胞樣(黑色箭頭)或具有間變特點(紅色箭頭) 圖3 A.CD20呈陽性，MaxVision法；B.CD5呈陽性，MaxVision法；C.BCL-2呈陽性，MaxVision法；D.Ki-67增殖指數(shù)呈陽性，MaxVision法

2.3.3免疫表型 17例PT-DLBCL腫瘤細胞B細胞標(biāo)志物CD20(圖3A)和PAX5均陽性，而T細胞標(biāo)記CD3、生殖細胞腫瘤標(biāo)記PLAP均陰性。CD5(圖3B)(2例，11.8%)、CD10(5例，29.4%)、BCL-6(15例，88.2%)和MUM1(16例，94.1%)部分病例呈陽性。根據(jù)Hans分型，non-GCB型者12例(75.6%)，GCB型者5例(24.4%)。BCL-2(圖3C)陽性率92.3%(12/13)，其中2例(11.8%)同時伴CD5陽性。Ki-67增殖指數(shù)均超過60%(圖3D)，其中陽性率≥75%者10例，占比58.8%。

2.4 分子學(xué)檢測7例行二代測序樣本中共檢測162個體細胞突變，包括132個非同義突變，覆蓋57個基因，以錯義突變?yōu)橹?。其?例(5/7, 71.4%)樣本中存在PIM1、MYD88、CD79B共突變，且這三種基因突變頻率最高。MYD88發(fā)生L265P突變，CD79B發(fā)生Y196突變(包括Y196H、Y196C、FISH結(jié)果表明5例(5/7，71.4%)有BCL-6基因斷裂重組，1例(1/7，14.3%)有p53基因缺失，BCL-2基因、C-MYC基因均未見異常。結(jié)合二代測序和FISH結(jié)果，其中6例(6/10，60%)有BCL-6基因斷裂重組。但同時有二代測序和FISH結(jié)果的4例樣本中，有1例檢測結(jié)果不一致，即FISH檢測BCL-6基因斷裂重組和p53基因缺失，而二代測序結(jié)果中未報道該突變。

Y196S、Y196N)，均為有害突變。PIM1突變類型豐富，共發(fā)現(xiàn)涵蓋錯義突變、剪切位點突變、移碼突變和內(nèi)含子突變等72種突變變體，且多為新發(fā)現(xiàn)變體、對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)無影響。其次，ITPKB、CIITA、KMT2D、DTX1、BCL-6、BCL-2的非同義突變頻率達42.9%(3/7)(圖4)。

圖4 7例原發(fā)性睪丸彌漫大B細胞淋巴瘤的高頻突變基因

2.5 治療及預(yù)后17例患者均行患側(cè)睪丸切除，術(shù)后接受不同的化療方案。聯(lián)合美羅華(Rituximab，即利妥昔單抗)治療者12例(70.6%)；聯(lián)合放療者4例(23.5%)，放療部位主要包括對側(cè)睪丸、盆腔、后腹膜及腹主動脈旁淋巴結(jié)。1例(5.9%)因高IPI評分同期接受自體干細胞移植。14例(82.3%)行腰椎穿刺聯(lián)合鞘內(nèi)注射預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累。所有患者治療時均未使用分子靶向藥物。14例(82.3%)患者治療效果達CR，2例(11.8%)達PR，1例(5.9%)出院時達SD(表1)。

17例患者有3例(17.6%)失訪，隨訪時間6.5～90個月，中位DFS為33.5個月，中位OS為39.5個月。5例攜帶PIM1、MYD88L265P和CD79B共突變的患者治療后均達CR，且均未出現(xiàn)復(fù)發(fā)。5例(35.7%)患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)，其中1例伴CD5陽性，2例伴BCL-6基因斷裂重組，復(fù)發(fā)部位包括對側(cè)睪丸(3/14，21.4%)、淋巴結(jié)(1/14，7.1%)和右側(cè)髕骨及皮下組織(1/14，7.1%)。2例(14.3%)患者分別因淋巴瘤復(fù)發(fā)、肺炎導(dǎo)致呼吸衰竭死亡(表1)。

表1 17例原發(fā)性睪丸彌漫大B細胞淋巴瘤的治療方案及療效

3 討論

PT-DLBCL是PTL最常見的組織學(xué)亞型，中位發(fā)病年齡>60歲，但近年文獻報道的發(fā)病年齡越來越小(>22歲)[3-4]。PT-DLBCL通常表現(xiàn)為單側(cè)質(zhì)硬、無痛性的睪丸腫塊，可伴睪丸腫脹和陰囊積水，嚴(yán)重時可有睪丸疼痛[5]。25%～41%的進展期患者伴發(fā)熱、乏力、盜汗、體重減輕等系統(tǒng)性B癥狀[6]。本組中睪丸腫大是患者的主要癥狀，僅2例確診時為雙側(cè)睪丸受累；伴B癥狀的患者占比為17.6%，略低于文獻報道，可能與樣本量較小有關(guān)。

本組35.3%的患者為晚期(Ⅲ+Ⅳ期)，17.6%的患者體能狀態(tài)較差，IPI評分為3～5分者占23.6%，結(jié)果均與既往報道一致[1,7]?；颊吒啐g、體能狀態(tài)差、Ⅲ+Ⅳ期和高IPI評分是PT-DLBCL預(yù)后差的重要因素。此外，血清學(xué)指標(biāo)如LDH、β2-MG對PT-DLBCL的預(yù)后也有重要的意義。本組7例伴LDH或β2-MG水平異常增高的患者中2例未獲得CR，3例有復(fù)發(fā)。Liu等[8]發(fā)現(xiàn)伴LDH水平增高的患者其PFS較短，而β2-MG則被認(rèn)為是DLBCL的重要預(yù)后因素且與IPI系統(tǒng)聯(lián)合建立新的危險模型[9]，既往研究也提示伴異常增高的LDH和β2-MG的患者更易出現(xiàn)復(fù)發(fā)[10]。

PT-DLBCL多為non-GCB型，Al-Abbadi等[11]報道89%的患者為non-GCB型且伴高增殖活性，本組75.6%的患者為non-GCB型且Ki-67增殖指數(shù)均大于60%。CD5蛋白作為T細胞標(biāo)志物，僅在5%～10%的DLBCL中呈陽性[12]。文獻報道CD5+DLBCL多為non-GCB型，腫瘤細胞呈中心母細胞樣，伴BCL-2蛋白高表達，且多出現(xiàn)在體能狀態(tài)差、Ⅲ+Ⅳ期的老年男性患者[13]。本組2例(11.8%)高齡患者CD5、BCL-2均陽性，但其臨床分期為Ⅰ+Ⅱ期，體能狀態(tài)較好，與文獻報道不符。可能是腫瘤原發(fā)于睪丸，未出現(xiàn)明顯腫痛癥狀時即因睪丸腫大就醫(yī)，因此腫瘤初診時比結(jié)內(nèi)DLBCL或胃腸道DLBCL等分期較早，患者的體能狀態(tài)也較好。盡管這2例患者中有1例伴基因改變(BCL-6斷裂重組和MYD88L265P、CD79B、PIM1共突變)，但由于樣本量限制，基因改變對臨床病理特征的影響無法進行統(tǒng)計學(xué)分析。

分子遺傳學(xué)在腫瘤篩查、診斷及指導(dǎo)臨床用藥等方面具有重要意義。PIM1、MYD88和CD79B被認(rèn)為是淋巴瘤發(fā)生的早期驅(qū)動因素[14]，且MYD88和CD79B共突變被認(rèn)為是起源于免疫豁免區(qū)的PT-DLBCL和PCNS-DLBCL的特殊分子生物學(xué)特征[15-17]。MYD88在PT-DLBCL中突變頻率為70%～80%，CD79B的突變頻率為50%～80%，且多與MYD88突變共存[15-19]。約50%的MYD88突變病例中可同時存在PIM1突變[20]；Chapuy等[18]報道2例有PIM1、MYD88和CD79B共突變的PT-DLBCL。本組發(fā)現(xiàn)PIM1、MYD88L265P和CD79B共突變頻率達71.4%，與既往研究結(jié)果一致；但這三種基因的突變意義尚存在爭議。Takeuchi等[21]認(rèn)為MYD88和CD79B的突變狀態(tài)與PT-DLBCL的預(yù)后無關(guān)，且伴MYD88突變的患者對BTK抑制劑 —— 依魯替尼治療反應(yīng)差；Lee等[22]持相反觀點，發(fā)現(xiàn)伴MYD88突變的患者OS較短，但對依魯替尼敏感；Oishi等[23]還發(fā)現(xiàn)攜帶MYD88突變的non-GCB型淋巴瘤細胞在睪丸中傳播和生長具有選擇性優(yōu)勢。PIM1基因的異常及其編碼蛋白的過表達被證實與DLBCL不良預(yù)后相關(guān)，且會降低活化B細胞樣DLBCL(activated B-cell-like DLBCL, ABC-DLBCL)患者對依魯替尼的敏感性[24]，但其在PT-DLBCL中的價值仍有待于進一步分析。本組中5例攜帶PIM1、MYD88L265P和CD79B共突變的患者治療過程中未使用分子靶向藥也獲得了較好的治療效果，且未復(fù)發(fā)，我們推測PIM1、MYD88L265P和CD79B共突變可能對PT-DLBCL的預(yù)后影響較小。但本組5例患者初診時均為早期(IPI評分≤2)，可能對治療效果有一定影響，因此仍需積累更多病例進一步分析3種基因共突變的意義。本組突變結(jié)果為臨床靶向治療提供了有力依據(jù)，來那度胺、NF-κB通路抑制劑和PIM抑制劑等藥物對于治療PT-DLBCL可能有重要意義。結(jié)合FISH及二代測序檢測結(jié)果，本組發(fā)現(xiàn)BCL-6基因的斷裂重組發(fā)生頻率最高(60%)，且其中3例初診時即出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移，2例隨訪有復(fù)發(fā)，結(jié)合既往文獻報道[25]，推測BCL-6基因的斷裂重組與PT-DLBCL預(yù)后差相關(guān)。值得注意的是，4例同時行二代測序和FISH檢測的患者中，1例出現(xiàn)檢測結(jié)果不一致的情況。我們考慮可能由于進行二代測序時樣本已出現(xiàn)一定程度的DNA降解，報告時已剔除測序豐度不合格的位點；此外，該例FISH中檢測的BCL-6及p53突變的位點，二代測序試劑盒中的探針可能尚未覆蓋。

臨床多采用手術(shù)切除聯(lián)合術(shù)后化療的方案治療PT-DLBCL，治愈率60%～70%[5]，但由于血睪屏障和血腦屏障的存在，部分患者對化療的敏感性較差，復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差。研究報道對側(cè)睪丸復(fù)發(fā)率達5%～35%，中樞神經(jīng)系統(tǒng)5年復(fù)發(fā)率約20%、10年復(fù)發(fā)率可達35%。本組隨訪14例患者中有35.7%的患者出現(xiàn)了復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)部位主要為對側(cè)睪丸，與既往報道一致[26]。因此，國際結(jié)外淋巴瘤研究組推薦PTL的治療方案：手術(shù)切除+化療+鞘內(nèi)注射預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累+對側(cè)睪丸放療[26]。值得注意的是，本組有5例復(fù)發(fā)患者，3例曾接受不同劑量的放療但療效不明確，可能與發(fā)病年齡>80歲、Ann Arbor分期為IV期及化療不耐受等危險因素有關(guān)。

綜上所述，PT-DLBCL好發(fā)于老年男性，常表現(xiàn)為單側(cè)無痛性睪丸腫大，初診時多為non-GCB型，且攜帶PIM1、MYD88L265P和CD79B基因共突變及BCL-6基因斷裂重組可能為其特殊的分子學(xué)特征。盡管患者就診時分期早，體能狀態(tài)良好，但其復(fù)發(fā)風(fēng)險也較高，聯(lián)合手術(shù)切除、化療伴鞘內(nèi)注射和放療，對改善患者預(yù)后有積極意義。