趙小敏，李 多，朱明雙，黃 勇，曹紀(jì)輝

(1.四川省南充市中醫(yī)醫(yī)院骨傷科，四川 南充 637001；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)骨傷科學(xué)教研室/成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院骨傷科，四川 成都 610072；3.重慶市長(zhǎng)壽區(qū)中醫(yī)院骨傷科，重慶 401220)

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)主要以疼痛、活動(dòng)受限為臨床表現(xiàn)，其病理表現(xiàn)為軟骨的變性破壞為主。目前學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)為KOA的發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)慢性、長(zhǎng)期、漸進(jìn)且不可逆的病理過(guò)程。流行病學(xué)調(diào)查顯示，KOA在全球的患病率為4%～13%，隨著人口老齡化的進(jìn)程加快，KOA患病率日漸增高[1]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療KOA中發(fā)揮著重要且不可替代的作用，其中獨(dú)活寄生湯作為治療KOA的經(jīng)典名方，臨床效果明顯，在臨床中為眾多醫(yī)家運(yùn)用[2，3]。研究發(fā)現(xiàn)[4]，Zinc-ZIP8-MTF1軸的激活在膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變中發(fā)揮了重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[5]，獨(dú)活寄生湯可以抑制炎性狀態(tài)下軟骨細(xì)胞內(nèi)Zn2+的濃度。本研究通過(guò)KOA模型動(dòng)物，探索獨(dú)活寄生湯在治療膝骨關(guān)節(jié)炎中的作用機(jī)制，及與Zinc-ZIP8-MTF1軸在該機(jī)制中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料2018年5月至2020年12月本研究在岐黃博恩生物科技有限公司實(shí)驗(yàn)室完成。C57BL/6小鼠54只(均由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2016-0002)。藥品與試劑：獨(dú)活寄生湯藥液；水合氯醛；乙二胺四乙酸二鈉鹽；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒；Anti-beta Actin antibody；二抗羊抗兔；Metallothionein Monoclonal Antibody；SLC30A9 Polyclonal Antibody；SLC39A8 Polyclonal Antibody；MTF1 Polyclonal Antibody；Animal Total RNA Isolation Kit；RT EasyTMⅡ；FluoZin-3 AM；Pluronic F-127；TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit；SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix；番紅-固綠染液。

1.2 動(dòng)物模型制作參考文獻(xiàn)[6，7]制作，采用7%水合氯醛行腹腔麻醉實(shí)驗(yàn)小鼠，選取小鼠右后膝關(guān)節(jié)作為操作模型，采用聚維酮碘和酒精對(duì)小鼠右后膝關(guān)節(jié)消毒；在顯微鏡下用小尖刀取髕旁內(nèi)側(cè)切口顯露膝關(guān)節(jié)，手術(shù)過(guò)程為減少失血，當(dāng)有出血時(shí)，進(jìn)行壓迫止血，小心打開(kāi)關(guān)節(jié)腔，注意操作過(guò)程中動(dòng)作不可粗暴，不破壞膝關(guān)節(jié)內(nèi)其它軟組織，用鉗子將髕骨向外側(cè)脫位，在手術(shù)過(guò)程中，為防止關(guān)節(jié)軟骨表明變干，可在關(guān)節(jié)軟骨表面滴入無(wú)菌生理鹽水，在確保不損傷關(guān)節(jié)軟骨和韌帶的情況下，用 10 號(hào)手術(shù)刀片切斷膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)半月板，將髕骨復(fù)位，關(guān)閉切口前，給予 0.25%布比卡因1滴，滴于手術(shù)部位以減少術(shù)后疼痛，用6-0絲線逐層閉合切口，縫合皮膚，結(jié)束手術(shù)。

1.3 動(dòng)物分組處理將54只小鼠隨機(jī)分為獨(dú)活寄生湯組(DHJST組)、對(duì)照組(Model組)、空白組(Control組)各18只。本實(shí)驗(yàn)選取造模4周時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始給藥，DHJST組予獨(dú)活寄生湯灌胃，Model組、Control組用0.9%氯化鈉溶液替代。獨(dú)活寄生湯劑量為1.86 g/ml×10 ml。每次灌胃后觀察實(shí)驗(yàn)小鼠一般狀態(tài)。在給小鼠灌胃4周后，脫頸處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，并分別取小鼠右后膝關(guān)節(jié)軟骨檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)中，因意外死亡2只小鼠(Model組和DHJST組各1只)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將每組小鼠再分為兩組，其中一組取小鼠完整膝關(guān)節(jié)用于病理學(xué)檢查和Zn2+濃度檢測(cè)，每組用于病理學(xué)檢測(cè)8只，熒光染色檢測(cè)3只，實(shí)時(shí)熒光定量(Real Time Quantitative PCR，RT-qPCR)檢測(cè)3只和 Western blotting檢測(cè)3只。

1.4 病理組織學(xué)檢測(cè)用無(wú)菌手術(shù)刀切開(kāi)右后膝關(guān)節(jié)周圍皮膚，用無(wú)菌剪刀在右后膝關(guān)節(jié)上下各1 cm處將小鼠股骨、脛腓骨剪斷，然后用無(wú)菌剪刀在不損傷膝關(guān)節(jié)和周圍關(guān)節(jié)囊的基礎(chǔ)上將膝關(guān)節(jié)周圍肌肉小心剔除，放入中性甲醛液中固定，采用10%EDTA-2Na 將膝關(guān)節(jié)脫鈣8周，固定小鼠膝關(guān)節(jié)脫水切片，滴加固綠染色3分鐘左右，清洗切片1～3分鐘，將多余的染料沖掉，在切片上滴加媒染劑處理10～30秒，再用自來(lái)水清洗1～3分鐘，并在切片上滴加番紅染液染色0.5～2分鐘，直至軟骨染著鮮紅色后，用自來(lái)水清洗1～3分鐘，最后脫水各3～5分鐘回后封片。所有小鼠膝關(guān)節(jié)均按病理檢驗(yàn)SOP程序嚴(yán)格操作。最后鏡檢對(duì)小鼠膝關(guān)節(jié)進(jìn)行觀察并采集圖像，本研究采用關(guān)節(jié)炎經(jīng)典評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)OARSI對(duì)已采集圖像進(jìn)行等級(jí)評(píng)分，以區(qū)別不同組別之間的KOA嚴(yán)重程度[8，9]，該等級(jí)從輕到重分為6個(gè)等級(jí)。

1.5 熒光染色技術(shù)檢測(cè)軟骨組織內(nèi)ZN2+將用于熒光染色經(jīng)過(guò)脫鈣的小鼠膝關(guān)節(jié)取出，放入預(yù)冷的冰凍切片機(jī)中(-20 ℃)，并制備10 μm厚的冰凍切片，然后采用5 μM FluoZin-3 AM和0.1% Pluronic F-127(Invitrogen)處理冰凍切片；30分鐘后，PBS液中洗滌，PBS溶液中繼續(xù)孵育30分鐘，整個(gè)實(shí)驗(yàn)處理過(guò)程必須保持在恒溫37 ℃。最后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)Zn2+成像。以驗(yàn)證獨(dú)活寄生湯在小鼠膝骨關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型體內(nèi)對(duì)軟骨細(xì)胞 Zn2+濃度的影響。

1.6 RT-qPCR用無(wú)菌手術(shù)剪刀小心剪取小鼠脛骨平臺(tái)內(nèi)側(cè)軟骨組織，提取總RNA，測(cè)RNA溶度濃度和純度，RT EasyTMⅡ試劑盒逆轉(zhuǎn)錄cDNA，檢測(cè)目標(biāo)mRNA相對(duì)表達(dá)量。對(duì)同一樣品中每個(gè)差異表達(dá)的 mRNA 的表達(dá)量進(jìn)行歸一化處理。測(cè)定鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ZIP8、ZNT9)、金屬調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子(MTF1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP3)、基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP13)mRNA的表達(dá)量。

1.7 Western blotting采用液氮研磨法，將膝關(guān)節(jié)軟骨放入研缽，不斷將液氮倒進(jìn)研缽中，用研杵在超低溫下將膝關(guān)節(jié)軟骨持續(xù)研磨，小心收集研磨至粉末狀軟骨，提取其總蛋白，經(jīng)處理后圖像灰度值掃描，檢測(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨組織中ZIP8、ZNT9、MTF1、MMP3、MMP13 mRNA 的蛋白表達(dá)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用 GraphPad Prism 8.3軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料多組間比較采用 One-Way ANOVA分析，組間兩兩比較采用Dunnett檢驗(yàn)，若數(shù)據(jù)方差不齊則采用Dunnett T3檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組小鼠軟骨組織病理學(xué)評(píng)分比較由表1及圖1可知，Model組組織病理學(xué)評(píng)分較Control組顯著升高(P<0.05)，提示造模成功。DHJST組組織病理學(xué)評(píng)分較Model組明顯下降(P<0.05)，提示獨(dú)活寄生湯對(duì)KOA小鼠具有治療作用。

表1 三組軟骨組織病理學(xué)評(píng)分比較 (分)

圖1 三組軟骨病理組織學(xué)觀察

2.2 三組小鼠軟骨組織Zn2+熒光染色技術(shù)檢測(cè)結(jié)果比較由圖2可知，熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，Model 組較Control 組軟骨細(xì)胞內(nèi)Zn2+含量明顯增加，經(jīng)獨(dú)活寄生湯作用后，Zn2+含量大幅減少，提示獨(dú)活寄生湯可明顯降低Zn2+濃度。

圖2 Zn2+熒光染色技術(shù)檢測(cè)結(jié)果

2.3 三組小鼠軟骨組織 RT-qPCR mRNA 表達(dá)比較表2顯示，與Control組相比，Model組軟骨組織中ZNT9、MTF1、MMP3、MMP13 mRNA表達(dá)增加(P<0.05)，ZIP8 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)；與Model組相比，DHJST組軟骨組織中ZIP8、ZNT9、MTF1、MMP3、MMP13 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)。

表2 各組小鼠軟骨組織 RT-qPCR mRNA 相對(duì)表達(dá)量

2.4 Western blotting蛋白含量比較表3顯示，與Control 組相比，Model組軟骨組織中 ZIP8、MTF1、MMP3、MMP13 蛋白表達(dá)增加(P<0.05)，ZNT9蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與 Model 組相比，DHJST 組軟骨組織中 MTF1、MMP3、MMP13 蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，ZIP8、ZNT9蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 Western blotting 蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討論

KOA病理特點(diǎn)為關(guān)節(jié)軟骨損傷退變[10]，研究結(jié)果中，Model組小鼠膝關(guān)節(jié)病理觀察可見(jiàn)，關(guān)節(jié)軟骨層厚薄不一，關(guān)節(jié)軟骨嚴(yán)重缺損、潮線不完整，大量纖維增生，說(shuō)明對(duì)Model 組小鼠進(jìn)行DMM后，關(guān)節(jié)軟骨受損，符合早中期膝骨關(guān)節(jié)炎的病理表現(xiàn)，DHJST組小鼠膝關(guān)節(jié)病理表現(xiàn)可見(jiàn)，軟骨層厚薄不一，關(guān)節(jié)軟骨表層缺損，潮線較整齊，本研究結(jié)果中，獨(dú)活寄生湯組小鼠軟骨退變程度較Model組減輕，表明獨(dú)活寄生湯具有保護(hù)KOA模型小鼠軟骨的作用，這與既往研究結(jié)果一致[11～13]。

Zn2+在膝骨關(guān)節(jié)炎疾病中起免疫系統(tǒng)，炎癥和新陳代謝的作用[14]。Zn2+是組成 MMPs 的重要成分，Zn2+是催化 MMP13 活性所必需的金屬離子，同時(shí)也是 MMPs 的活化中心[15，16]。 Zn2+與 KOA 發(fā)病機(jī)理的聯(lián)系在其作為基質(zhì)降解酶的結(jié)構(gòu)成分中得到了廣泛認(rèn)可。Zn2+在影響骨關(guān)節(jié)炎疾病時(shí)，受 ZIP 和 ZNT 家族的鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的控制[17，18]，在人類和小鼠的基因組中，編碼了14個(gè)ZIP 和9個(gè) ZNT 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[19]。膝關(guān)節(jié)軟骨中的Zn2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZIP8 蛋白在受到外力創(chuàng)傷、炎癥因子、異常機(jī)械壓力等因素的刺激后[4]，其表達(dá)水平會(huì)異常增高，此時(shí) ZIP8 蛋白會(huì)將細(xì)胞外的 Zn2+大量轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，Zn2+的涌入會(huì)大量激活 MTF1，MMPs和聚蛋白樣金屬蛋白酶會(huì)被活化的 MTF1所激活[20]，最終破壞關(guān)節(jié)軟骨。Song等[21]研究證實(shí)miR-488通過(guò)抑制ZIP8，進(jìn)而減少Zn2+涌入細(xì)胞內(nèi)，恢復(fù)了II型膠原蛋白的表達(dá)水平，減少了MMP-13被激活量，從而保護(hù)膝關(guān)節(jié)軟骨。研究中，Model 組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞內(nèi)Zn2+含量明顯增加，說(shuō)明造模成功后，Zn2+在細(xì)胞內(nèi)大量增加，并參與到膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生過(guò)程，而經(jīng)獨(dú)活寄生湯作用后，軟骨細(xì)胞內(nèi)Zn2+含量大幅減少，提示獨(dú)活寄生湯可抑制Zn2+，隨著 Zn2+的減少，MTF1 表達(dá)降低，進(jìn)而降低MMP3、MMP13表達(dá)，減少 MMPs 的被激活量，從而治療KOA，這與前期獨(dú)活寄生湯體外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相一致。

鋅離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ZIP 蛋白和 ZNT蛋白在調(diào)節(jié)細(xì)胞中的Zn2+中發(fā)揮重要作用。ZIP 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將Zn2+從細(xì)胞外液或細(xì)胞內(nèi)囊泡傳遞到細(xì)胞質(zhì)中，而 ZNT 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白則促進(jìn)Zn2+向細(xì)胞外空間移動(dòng)或?qū)⒓?xì)胞質(zhì)鋅螯合進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)區(qū)室，本研究結(jié)果顯示，與 Model 組相比，DHJST 組小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中ZNT9 mRNA表達(dá)明顯降低，ZIP8的相對(duì)表達(dá)量降低顯著。獨(dú)活寄生湯對(duì)Zn2+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 ZIP8、ZNT9沒(méi)有明顯抑制或促進(jìn)作用，這說(shuō)明對(duì)Zn2+濃度有降低作用，但獨(dú)活寄生湯對(duì)Zn2+進(jìn)出軟骨細(xì)胞的關(guān)鍵環(huán)節(jié)并沒(méi)有明顯影響。