袁惠玲，吳麗華，陳桂林，黃珂銘

(南方醫(yī)科大學附屬東莞人民醫(yī)院乳腺科，廣東東莞 523000)

人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)陽性乳腺癌(以下簡稱HER2+乳腺癌)是一類由HER2/neu引發(fā)的低免疫力型惡性乳腺腫瘤，占原發(fā)性浸潤性乳腺癌的15%～30%[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，HER2/neu是一種具有酪氨酸激酶活性的免疫原性蛋白，可在HER2+腫瘤患者中引起體液和細胞免疫反應(yīng)[3]。無論是通過“免疫編輯”還是其他免疫逃逸機制，在HER2+乳腺癌腫瘤微環(huán)境中對HER2/neu的細胞免疫反應(yīng)減弱都與較差的預后相關(guān)[4]。相反，針對HER2/neu的細胞和體液反應(yīng)增加與腫瘤發(fā)生減少和預后改善有關(guān)[5]。HER2/neu過表達的癌癥患者通常表現(xiàn)出針對該蛋白的現(xiàn)有免疫力降低[5]。因此，HER2/neu在刺激致瘤性免疫微環(huán)境中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，然而HER2/neu是否參與乳腺癌免疫微環(huán)境穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)尚未明確。

巨噬細胞是一群具有調(diào)控腫瘤免疫微環(huán)境穩(wěn)態(tài)作用的固有免疫細胞亞群，根據(jù)其表型分為M1或M2樣狀態(tài)[6]。M1型巨噬細胞與促炎反應(yīng)有關(guān)，而M2型巨噬細胞與血管新生和炎癥抑制相關(guān)[6]。乳腺癌中的腫瘤相關(guān)巨噬細胞(tumor-associated macrophage，TAM)主要是M2型巨噬細胞亞群，其促進乳腺腫瘤細胞的多種生物學進程，包括腫瘤細胞生長、侵襲和轉(zhuǎn)移[7]；其次，TAM還可以在乳腺癌模型中誘導對多種治療的耐藥性[8]。重要的是，HER2蛋白過表達或基因擴增發(fā)生在20%～30%的新診斷的晚期乳腺癌患者中，且晚期乳腺癌表現(xiàn)出高度極化的M2型TAM[8]。然而，HER2+乳腺癌細胞是否影響巨噬細胞極化仍不清楚。因此，在本研究中：(1)論證HER2+乳腺癌患者外周血和癌組織中可溶性程序性死亡配體1(soluble programmed death-ligand 1，sPD-L1)和癌組織局部巨噬細胞極化的關(guān)系；(2)體外探究HER2-腺癌細胞系和HER2+腺癌細胞系培養(yǎng)上清sPD-L1水平的差異；(3)探究HER2-腺癌細胞系和HER2+腺癌細胞系培養(yǎng)上清對巨噬細胞極化和功能的影響，以揭示HER2+和HER2-乳腺癌細胞對巨噬細胞極化的影響，并為HER2+和HER2-乳腺癌的抗PD-L1治療提供新的理論支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

征集2018年4月至2020年6月HER2-和HER2+乳腺癌患者各20例。納入標準：(1)術(shù)后經(jīng)病理檢查診斷為浸潤性乳腺癌；(2)術(shù)前未進行放化療和免疫治療；(4)符合HER2+乳腺癌或HER2-乳腺癌判定標準，即免疫組織化學染色雌激素受體陰性(ER-)孕激素受體陰性(PR-)和HER2+細胞80%以上判為HER2+乳腺癌，ER-PR-和HER2-細胞80%以上判為HER2-乳腺癌。排除標準：(1)有遠端轉(zhuǎn)移者；(2)其他腫瘤轉(zhuǎn)移到乳腺者;(3)合并嚴重心、肝、腎衰竭者；(4)合并嚴重心血管疾病者;(5)合并其他系統(tǒng)嚴重原發(fā)病者,如消化道疾病、泌尿系統(tǒng)疾病等。收集患者一般臨床資料，兩組年齡、體重指數(shù)(BMI)、腫瘤尺寸，以及淋巴結(jié)陽性、3級腫瘤、HER1+、ER+、PR+患者百分比比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；兩組Ki-67+患者百分比比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。本文研究經(jīng)本院倫理委員會審核批準，所有患者、志愿者均對本研究知情并簽署知情同意書。

表1 HER2-和HER2+乳腺癌患者臨床特征比較(n=20)

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和干預

乳腺癌細胞系BT-474、SK-BR-3、MDA-MB 453和MDA-MB 468購自武漢普諾賽生命科技有限公司。所有細胞系在含有100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素(美國Thermo Fisher Scientific公司)和10%胎牛血清(四季青，浙江天杭生物科技股份有限公司)的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Thermo Fisher Scientific公司)中常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱。5×105個細胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h貼壁后，收集0、12、24和48 h的培養(yǎng)上清液，1 000×g離心10 min。棄去沉淀后保留上清液，即為乳腺癌細胞條件性培養(yǎng)基(breast cell conditional medium，BCM)。

1.2.2ELISA

根據(jù)人PD-L1 ELISA說明書(武漢華美生物工程有限公司)檢測HER2-和HER2+乳腺癌患者外周血漿和組織勻漿液中sPD-L1表達。稱取約100 mg組織，用1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗組織。然后加入含苯甲基磺酰氟(PMSF，武漢塞維爾生物科技有限公司)的RIPA裂解液勻漿破碎后14 000×g 4 ℃離心20 min，收集上清液。將50 μL血漿和組織勻漿液加入微孔中，然后在室溫下于黑暗處孵育60 min。將液體從孔中倒出，并用吸收紙輕拍以確保液體完全通過孔排出。然后將偶聯(lián)酶(50 μL)加入孔中，在室溫下于黑暗處孵育60 min。洗滌過程重復3次。這些過程之后，將底物(50 μL)添加到每個孔中，并在室溫下在黑暗處孵育30 min。每孔加入終止試劑，并測定450 nm處的吸光度值(A450值)。每個樣品重復測量3次。

1.2.3人外周血單個核細胞分離和原代巨噬細胞培養(yǎng)

HER2-和HER2+乳腺癌患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)收集至乙二胺四乙酸(EDTA)處理抗凝采血管中，混勻后加入至等體積的單個核細胞淋巴分離液(天津市灝洋生物制品科技有限責任公司)上層，800×g離心30 min后吸取單個核細胞層。加入PBS漂洗3次。加入含有100 U/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素(美國Thermo Fisher Scientific公司)和10%胎牛血清(美國Thermo Fisher Scientific公司)的RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Thermo Fisher Scientific公司)中重懸并計數(shù)。1×105個細胞接種于12孔板，每孔加入50 ng/mL重組人巨噬細胞集落刺激因子(recombinant human macrophage colony-stimulating factor，rhM-CSF，美國PeproTech公司)，培養(yǎng)7 d貼壁后加入BCM培養(yǎng)24 h。

1.2.4流式細胞術(shù)

巨噬細胞的表型檢測采用異硫氰酸熒光素(FITC)偶聯(lián)的抗人CD68(61D3)、PE-Cyanine7偶聯(lián)的抗人CD86(IT2.2)和PE-Cyanine7偶聯(lián)的抗人CD206(19.2)，均購自美國eBioscience公司。采用1% TritonX-100破膜10 min后，加入PBS漂洗重懸，加入上述抗體2.5 mL。室溫孵育30 min 后加入PBS漂洗重懸。通過NovoCyte流式細胞儀分析巨噬細胞的表型，使用Treestar FlowJo 10.0.7版軟件(美國TreeStar公司)分析數(shù)據(jù)。

1.2.5總RNA提取和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)

采用Trizol法提取巨噬細胞總RNA。使用Nanodrop分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)分析RNA濃度和純度。1 000 ng RNA采用第一島鏈cDNA合成試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)合成cDNA。以10 ng為模板，采用SYBR Green Ⅰ染料(日本TaKaRa公司)在qRT-PCR儀(型號：Applied Biosystems 7900)檢測mRNA基因表達水平。反應(yīng)條件：98 ℃ 3 min，98 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，擴增40個循環(huán)，采用2-ΔΔCt計算擴增倍數(shù)。引物見表2。

表2 qPCR引物序列

1.2.6Western blot

乳腺癌細胞系總蛋白采用RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)提取。5×105個細胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h貼壁后培養(yǎng)48 h。棄去上清液后PBS漂洗1次，加入300 μL含1 mmol/L的PMSF(武漢塞維爾生物科技有限公司)孵育10 min。收集至1.5 mL EP管中，超聲5 s。14 000×g 4 ℃離心20 min。上清液采用Broadford檢測蛋白濃度并變性。以50 μg蛋白上樣量在10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離膠電泳分離，300 mA恒流濕轉(zhuǎn)2 h至聚偏二氟乙烯膜上，含5%牛血清清蛋白(BSA)的TBST溶液室溫封閉1 h，加入HER2一抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)后4 ℃搖床孵育12 h，第2天TBST室溫漂洗3次，每次5 min。室溫孵育二抗(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)1 h，TBST溶液以1∶5 000稀釋，TBST室溫漂洗3次，每次5 min。電化學發(fā)光(ECL)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)發(fā)光顯示。蛋白表達采用ImageJ軟件分析灰度值，標準化至β-actin(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 HER2-和HER2+患者外周血漿和組織勻漿液中sPD-L1表達水平

HER2+患者外周血漿和組織勻漿液中sPD-L1表達水平明顯高于HER2-患者，見圖1。

A：HER2-和HER2+患者的外周血漿中sPD-L1表達水平；B：HER2-和HER2+患者的組織勻漿液中sPD-L1表達水平；a：P<0.001。

2.2 HER2-和HER2+患者組織局部M1和M2巨噬細胞的比例

HER2+患者組織中M1型巨噬細胞比例(CD86+CD206-CD68+/CD68+)明顯低于HER2-患者(圖2A、B)，M2型巨噬細胞比例(CD86-CD206+CD68+/CD68+)明顯高于HER2-患者(圖2A、C)。

2.3 HER2-和HER2+腺癌細胞HER2表達和sPD-L1水平

相比于HER2-腺癌細胞系(BT-474和SK-BR-3)，HER2+腺癌細胞系(MDA-MB-453和MDA-MB-468)高表達HER2，見圖3A、B。HER2-腺癌細胞系(SK-BR-3)和HER2+腺癌細胞系(MDA-MB-453)BCM中的sPD-L1水平隨培養(yǎng)時間增加而上升，見圖3C、D。

A：HER2-和HER2+患者組織M1(CD86+CD206-CD68+/ CD68+)和M2型(CD86-CD206+CD68+/ CD68+)巨噬細胞極化流式細胞圖；B：HER2-和HER2+患者組織M1型巨噬細胞比例統(tǒng)計圖；C：HER2-和HER2+患者組織M2型巨噬細胞比例統(tǒng)計圖；a：P<0.05，b：P<0.001。

2.4 HER2-和HER2+腺癌細胞系培養(yǎng)上清液對PBMC源巨噬細胞表型極化的影響

相比于HER2-腺癌細胞系(BT-474和SK-BR-3)，HER2+腺癌細胞系(MDA-MB-453和MDA-MB-468)BCM中的sPD-L1明顯上升，見圖4A。HER2+腺癌細胞系(MDA-MB-453)BCM處理的M1型(CD86+CD206-CD68+/CD68+)和M2型(CD86-CD206+CD68+/CD68+)巨噬細胞比例明顯高于HER2-腺癌細胞系(SK-BR-3)，見圖4B、C、D。HER2+腺癌細胞系(MDA-MB-453)培養(yǎng)上清液處理組M1/M2比值明顯高于HER2-腺癌細胞系(SK-BR-3)處理組，見圖4E。

2.5 HER2-和HER2+腺癌細胞系BCM對PBMC源巨噬細胞功能極化的影響

為了進一步明確HER2-和HER2+腺癌細胞系對PBMC源巨噬細胞的功能極化，檢測M1型和M2型巨噬細胞功能相關(guān)基因mRNA水平。M1型巨噬細胞相關(guān)基因IFN-γ、IL-1β和INOS mRNA水平明顯降低，M2型巨噬細胞相關(guān)基因IL-10、TGF-β和ARG1 mRNA水平明顯上升，見圖5。

A：HER2-腺癌細胞系(BT-474和SK-BR-3)和HER2+腺癌細胞系(MDA-MB-453和MDA-MB-468)HER2表達Western blot圖；B：腺癌細胞系HER2相對表達水平統(tǒng)計圖；C：HER2-腺癌細胞系(SK-BR-3)BCM中sPD-L1水平統(tǒng)計圖；D：HER2+腺癌細胞系(MDA-MB-453)BCM中sPD-L1水平統(tǒng)計圖；a：P<0.05，b：P<0.01。

A：HER2-腺癌細胞系(BT-474和SK-BR-3)和HER2+腺癌細胞系(MDA-MB-453和MDA-MB-468)培養(yǎng)上清液sPD-L1水平檢測；B：M1型(CD86+CD206-CD68+/CD68+)和M2型(CD86-CD206+CD68+/CD68+)巨噬細胞極化流式細胞圖；C：M1型(CD86+CD206-CD68+/CD68+)巨噬細胞比例統(tǒng)計圖；D：M2(CD86-CD206+CD68+/CD68+)巨噬細胞比例統(tǒng)計圖；E：M1/M2型巨噬細胞比值統(tǒng)計圖；a：P<0.05，b：P<0.001。

a：P<0.05，b：P<0.001。

3 討 論

巨噬細胞是關(guān)鍵的免疫細胞和炎癥過程的重要調(diào)節(jié)劑[6]。駐留的巨噬細胞可以充當組織損傷的傳感器，并且可以維持組織穩(wěn)態(tài)[6]。盡管已經(jīng)使用分子標記(如HER2)對乳腺癌疾病進行分類，以預測預后并確定治療方式[3]。但目前的診斷和治療方式仍存在不足，許多患者因疾病復發(fā)而死亡。因而，進一步發(fā)掘和明確HER2乳腺癌的特征有助于其診斷和治療。本研究對HER2表達在乳腺癌免疫微環(huán)境巨噬細胞極化中的作用進行探討，結(jié)果顯示：(1)HER2+乳腺癌患者外周血和癌組織中sPD-L1水平明顯升高，并伴隨癌組織局部M2型巨噬細胞極化，提示HER2+患者免疫力降低可能與外周血漿和組織微環(huán)境中升高的sPD-L1有關(guān)。(2)HER2-腺癌細胞系(BT-474和SK-BR-3)和HER2+腺癌細胞系(MDA-MB-453和MDA-MB-468)均可分泌sPD-L1，且HER2+腺癌細胞系分泌更多的sPD-L1，提示HER2+患者組織微環(huán)境中升高的sPD-L1可能來自HER2+腺癌細胞，并可能參與組織M1和M2巨噬細胞極化。(3)HER2+腺癌細胞系(MDA-MB-453)促進M1型和M2型巨噬細胞比例增加，同時促進M1/M2平衡向M2型巨噬細胞功能極化偏移，提示HER2+腺癌細胞系(MDA-MB-453)來源的sPD-L1可能促進M1和M2型巨噬細胞極化平衡向M1。

HER2在大多數(shù)原位乳腺癌中表達，但僅在20%～30%的浸潤性乳腺癌中得到維持[9]。在乳腺癌的發(fā)生過程中，觀察到HER2表達從良性到導管癌逐漸減少，在浸潤性乳腺癌中HER2幾乎不表達[10]。然而，HER2在乳腺癌中的作用尚未完全明確。本研究結(jié)果表明，在HER2+乳腺癌患者中，高表達sPD-L1可能促進癌組織局部M2型巨噬細胞激活。因而，可能促進腫瘤生長和侵襲，導致免疫力降低和腫瘤血管新生[11-12]。

研究表明，肝細胞肝癌和滋養(yǎng)細胞來源的sPD-L1具有調(diào)控巨噬細胞極化介導免疫耐受的作用[13-14]。且血清高水平sPD-L1與轉(zhuǎn)移性晚期胃癌患者一線化療的總體生存期較差有關(guān)[12]。巨噬細胞極化是癌組織免疫微環(huán)境紊亂和腫瘤免疫治療低效的重要因素[15-16]。本研究體外實驗證實，HER2+腺癌細胞來源的sPD-L1具有調(diào)節(jié)巨噬細胞極化的作用。這可能促進乳腺癌組織血管新生、腫瘤生長及組織炎性反應(yīng)，導致抗腫瘤免疫炎癥治療低效[11]。

綜上所述，sPD-L1高表達于HER2+乳腺癌患者癌組織和外周血中，且HER2+乳腺癌患者癌組織局部巨噬細胞呈現(xiàn)M2極化偏移。HER2+腺癌細胞來源的sPD-L1促進M1型和M2型巨噬細胞極化，且M1/M2平衡偏向M1型并伴隨M2型功能增強。但是，尚需進一步的直接證據(jù)說明sPD-L1如何調(diào)控巨噬細胞及其分子機制。同時，下調(diào)sPD-L1是否在體影響HER2+乳腺癌患者癌組織巨噬細胞功能極化和抑制腫瘤生長尚需進一步闡明。因此，sPD-L1作為HER2+乳腺癌的治療靶點仍有待研究。