李坤林 趙蕾

摘要：2021年4月，山東省博興縣某鴨場雛鴨發(fā)生一起以精神沉郁、發(fā)病急、病程短、發(fā)病率和死亡率高為主要臨床特征的疫病，根據(jù)臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果確診為基因C型鴨甲肝病毒和莢膜A型多殺性巴氏桿菌混合感染，為及時(shí)準(zhǔn)確采取針對性治療措施提供了參考。

關(guān)鍵詞：雛鴨;鴨甲肝病毒;多殺性巴氏桿菌;混合感染;診斷

鴨病毒性肝炎是雛鴨的一種急性、致死性傳染病，具有傳播快、病程短、發(fā)病急、病死率高等流行特點(diǎn)，其主要致病原為鴨甲肝病毒，以3周齡內(nèi)雛鴨易感，且雛鴨日齡越小，死亡率越高，是當(dāng)前危害雛鴨健康最嚴(yán)重的傳染病[1]。鴨巴氏桿菌病是由多殺性巴氏桿菌引起的一種急性、敗血性、高度接觸性傳染病，該病在我國鴨群中的流行較為普遍，每年都給我國養(yǎng)鴨產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。鴨甲肝病毒和多殺性巴氏桿菌均是當(dāng)前威脅鴨群健康的主要疫病，2021年4月，山東省博興縣某鴨場雛鴨發(fā)生一起疑似鴨甲肝病毒和多殺性巴氏桿菌混合感染病例，現(xiàn)將整個(gè)診斷過程匯報(bào)如下。

1 發(fā)病情況

2021年4月初，該鴨場飼養(yǎng)的7日齡肉鴨開始發(fā)病，發(fā)病雛鴨食欲下降、精神沉郁，發(fā)病急，發(fā)病率在80%以上，病程短，發(fā)病后48h內(nèi)死亡，剛開始發(fā)病時(shí)死亡率較低，但發(fā)病后期死亡率較高，整體死亡率在60%以上。

2 臨床癥狀

發(fā)病雛鴨精神沉郁，食欲廢絕，羽毛松亂，搖頭，喜臥，死亡前大多數(shù)會(huì)發(fā)生抽搐，表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)癥狀，死后呈角弓反張姿勢。

3 剖檢特征

解剖死亡雛鴨可見肝臟腫大、有出血點(diǎn)和出血斑、表面具有白色黏膜，脾臟腫大、壞死，腎臟腫大、有出血點(diǎn)，心內(nèi)外膜斑點(diǎn)狀出血，肺臟水腫、出血。無菌采集死亡雛鴨的肝臟、脾臟作為臨床病料樣品，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病毒PCR檢測和細(xì)菌分離鑒定。

4 病毒PCR檢測

4.1 設(shè)計(jì)合成引物

參照黃秋雪等[3]建立的基因A型和C型鴨甲肝病毒雙重RT-PCR鑒別檢測方法分別設(shè)計(jì)合成基因A型和C型鴨甲肝病毒特異性檢測引物（引物信息如表1所示）。

4.2 一步法RT-PCR擴(kuò)增

按照病毒基因組RNA提取試劑盒（購自北京百泰克生物科技有限公司）使用說明書提取臨床病料樣品的基因組RNA，利用設(shè)計(jì)合成的鑒別檢測引物對提取的病料樣品基因組RNA進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增。一步法RT-PCR擴(kuò)增體系為：2×One step Buffer 12.5μL、One step Enzyme Mix 0.5μL、引物F1/R1/F2/R2各0.5μL、RNA 4.0μL、H2O 6.0μL。一步法RT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?0℃ 30min;95℃ 5min;95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，30個(gè)循環(huán);72℃ 10min。一步法RT-PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示，擴(kuò)增產(chǎn)物在194bp處具有一條特異性擴(kuò)增條帶，與基因C型鴨甲肝病毒預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致，表明臨床病例為基因C型鴨甲肝病毒陽性。

5 細(xì)菌分離鑒定

5.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)

將無菌采集死亡雛鴨的肝臟、脾臟等臨床病料樣品劃線接種于鮮血瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24h后，血平板上生長出邊緣整齊、表面光滑、圓形隆起、灰白色、露珠狀的單菌落，將單菌落涂片、革蘭氏染色、鏡檢可見革蘭氏陰性菌、短桿狀，符合多殺性巴氏桿菌的培養(yǎng)特征。

5.2 生化鑒定試驗(yàn)

對分離菌株進(jìn)行常規(guī)生化鑒定試驗(yàn)，結(jié)果表明分離菌株能夠發(fā)酵蔗糖、葡萄糖、果糖，不能發(fā)酵麥芽糖、乳糖、鼠李糖，氧化酶、吲哚試驗(yàn)均為陽性，甲基紅、硫化氫試驗(yàn)均為陰性，符合多殺性巴氏桿菌的生化特性。

5.3 莢膜基因型鑒定試驗(yàn)

5.3.1 設(shè)計(jì)合成引物 參照Townsend K M等[4]建立的多殺性巴氏桿菌不同莢膜基因型多重PCR鑒別檢測方法分別設(shè)計(jì)合成莢膜A型、B型、D型、E型、F型特異性檢測引物（引物信息如表2所示）。

5.3.2 PCR擴(kuò)增 按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（購自北京百泰克生物科技有限公司）使用說明書提取分離菌株的基因組DNA，利用設(shè)計(jì)合成的鑒別檢測引物對提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：2×Taq PCR Master Mix 12.5μL、DNA 4μL、引物F3/R3/F4/R4/F5/R5/F6/R6/F7/R7各0.5μL、水3.5μL。PCR擴(kuò)增條件為：95℃ 5min;95℃ 45s，55℃ 45s，72℃ 45s，30個(gè)循環(huán);72℃ 10min。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示，擴(kuò)增產(chǎn)物在1，044bp處具有一條特異性擴(kuò)增條帶，與莢膜A型多殺性巴氏桿菌預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致，表明分離菌株為莢膜A型多殺性巴氏桿菌。

6 綜合診斷結(jié)果

根據(jù)發(fā)病情況、臨床癥狀、剖檢特征等臨床診斷結(jié)果和病毒PCR檢測、細(xì)菌分離鑒定等實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果，綜合判定臨床病例為基因C型鴨甲肝病毒和莢膜A型多殺性巴氏桿菌混合感染。

7 討論

鴨甲肝病毒具有三種基因型（A型、B型和C型），各基因型之間無交叉保護(hù)作用，基因A型為我國傳統(tǒng)的流行毒株，基因B型為2007年開始出現(xiàn)的新毒株，我國內(nèi)陸地區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)基因B型的流行。過去我國鴨甲肝病毒的流行優(yōu)勢基因型為A型，但近年來隨著基因A型疫苗和卵黃抗體的廣泛應(yīng)用，A型的發(fā)病率逐步降低，但由于基因A型疫苗和卵黃抗體無法保護(hù)基因C型的感染，導(dǎo)致近年來基因C型的發(fā)病率迅速增加，管飄萍等[5]采用PCR方法對從山東省分離出的22株鴨甲肝病毒進(jìn)行了基因分型，基因A型占36.36%（8/22），基因C型占63.63%（14/22）。本研究采用RT-PCR方法對臨床病例進(jìn)行了基因分型檢測，結(jié)果顯示為基因C型，與管飄萍等[5]的研究結(jié)果表現(xiàn)出了一致性，說明當(dāng)前山東地區(qū)鴨群中流行的鴨甲肝病毒以基因C型為主要流行基因型，以預(yù)防基因A型為主的防控措施已不能滿足臨床疫病的防控需要，應(yīng)逐步加強(qiáng)基因C型的防控。

根據(jù)多殺性巴氏桿菌莢膜抗原不同，將其分為5個(gè)莢膜基因型（A型、B型、D型、E型、F型），我國主要流行A型、B型、D型。Townsend K M等[4]通過比較分析多殺性巴氏桿菌莢膜基因特異性位點(diǎn)，建立了檢測多殺性巴氏桿菌莢膜分型的多重PCR鑒別檢測方法，該方法操作簡單、準(zhǔn)確、快速，在多殺性巴氏桿菌基因型分析中得到了廣泛應(yīng)用。仇桂玲等[6]采用多重PCR方法對20株禽源多殺性巴氏桿菌進(jìn)行了莢膜基因型分型，莢膜A型為18株，占90%。本研究采用多重PCR方法對臨床病例進(jìn)行了基因分型檢測，結(jié)果顯示為莢膜基因A型，與仇桂玲等[6]的研究結(jié)果表現(xiàn)出了一致性，說明當(dāng)前我國禽源多殺性巴氏桿菌的流行菌株以莢膜A型為主要基因型，臨床應(yīng)合理選擇和使用疫苗，確保疫苗的免疫效果。

混合感染病例不僅使疫病的危害程度加劇，經(jīng)濟(jì)損失增加，也使疫病的診斷和治療更加困難。由于混合感染病例的臨床癥狀十分復(fù)雜，僅通過臨床診斷很難確診致病原，一般均需要借助實(shí)驗(yàn)室診斷方法。PCR方法作為最常用的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，能夠檢測到不同基因型致病原的特異性核苷酸序列，具有常規(guī)免疫學(xué)檢測技術(shù)無法比擬的準(zhǔn)確性，故本病例采用PCR技術(shù)分別對病毒和細(xì)菌均進(jìn)行了分子水平上的鑒定，使診斷結(jié)果準(zhǔn)確可靠?？傊?，本研究綜合臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷結(jié)果判定為此次疫病由基因C型鴨甲肝病毒和莢膜A型多殺性巴氏桿菌兩種致病原混合感染所致，但尚不能確定是哪種致病原在雛鴨發(fā)病過程中起主導(dǎo)作用，推測有兩種可能，一種可能是雛鴨先感染了鴨甲肝病毒，導(dǎo)致雛鴨抵抗力降低，此時(shí)環(huán)境中的條件性致病菌（多殺性巴氏桿菌）迅速生長繁殖，加劇了疫病危害程度，使發(fā)病率和死亡率增加;另一種可能是雛鴨先感染了多殺性巴氏桿菌，導(dǎo)致雛鴨體質(zhì)下降，引起鴨甲肝病毒的感染。無論是哪種可能，都與鴨場的日常飼養(yǎng)管理和生物安全防控技術(shù)密切相關(guān)，本次疫病發(fā)生的鴨場為連續(xù)飼養(yǎng)多年的老場，場內(nèi)致病原逐年累積，一旦鴨群受到環(huán)境應(yīng)激（如溫差較大、多雨潮濕、驚嚇、疫苗免疫等），鴨群免疫力下降后就會(huì)增加致病原混合感染的風(fēng)險(xiǎn)。故只有加強(qiáng)日常飼養(yǎng)管理和生物安全防控措施，使鴨群保持健康體質(zhì)，才能有效避免混合感染的發(fā)生。

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[3] 黃秋雪，湯承，聶培婷，等. 鴨甲肝病毒基因A型和C型雙重RT-PCR檢測方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，34（2）：120-123.

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[5] 管飄萍，Enkhbayar Munkhbayar，黃紫貝，等. 22株鴨甲型肝炎病毒的分離鑒定及其VP1基因的序列分析[J]. 中國家禽，2021，43（1）：105-109.

[6] 仇桂玲，鐘嘉誠，譚結(jié)敏，等.20株禽多殺性巴氏桿菌的分離及莢膜與脂多糖的分型鑒定[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2021，46（1）：43-49+52.

作者簡介：李坤林（1976— ），山東成武人，助理研究員，本科，主要從事動(dòng)物營養(yǎng)與動(dòng)物疫苗研制工作，E-mail：15865218222@163.com

通訊作者：趙蕾（1977— ），副研究員，主要從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究工作，E-mail：zhaolei77718@163.com