徐宏超，邢榮蓮，李源美，叢明

煙臺(tái)大學(xué)，煙臺(tái) 264005

過(guò)去30年，我國(guó)海水養(yǎng)殖規(guī)模迅猛發(fā)展，產(chǎn)量得到快速增長(zhǎng)。其中，海洋軟體動(dòng)物的產(chǎn)量最高，達(dá)到海水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的72.6%～78.6%，因此成為我國(guó)海水養(yǎng)殖產(chǎn)量的主要貢獻(xiàn)者[1]。海岸帶區(qū)域是海洋生物特別是海洋軟體動(dòng)物的重要養(yǎng)殖區(qū)域[2]，海岸帶環(huán)境的健康狀況與軟體動(dòng)物尤其貝類養(yǎng)殖的健康發(fā)展密切相關(guān)。隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展和人民生活水平的大幅提高，大量污染物未經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的凈化處理就排放到環(huán)境中，并隨著徑流進(jìn)入海洋環(huán)境中。由于海岸帶位于河流和海洋的交匯處，因此陸源污染導(dǎo)致海岸帶的污染狀況尤其嚴(yán)重。國(guó)家海洋水質(zhì)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，養(yǎng)殖海域非離子氨的限定濃度為0.02 mg·L-1(GB11607—89)。然而，2019年中國(guó)生態(tài)環(huán)境報(bào)告顯示，入海河流的氨氮濃度范圍為0.02～26.4 mg·L-1，平均濃度為0.64 mg·L-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)養(yǎng)殖區(qū)域內(nèi)海水氨氮的安全濃度[3]。已有研究表明，海洋環(huán)境中的氨氮對(duì)軟體動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重影響，但是對(duì)其致毒機(jī)制還不是很清楚，因此有必要從基因水平對(duì)其毒性進(jìn)行分析研究[4-6]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是檢測(cè)基因表達(dá)的重要方法之一，可以很好地反映受試生物體中相關(guān)基因表達(dá)的變化情況。通常可以選擇一個(gè)內(nèi)參基因作為其他基因表達(dá)的對(duì)照，如果內(nèi)參基因的表達(dá)不穩(wěn)定或者是不同的實(shí)驗(yàn)條件下發(fā)生改變，則無(wú)法檢測(cè)其他基因表達(dá)的微小變化，甚至可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，為特定的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮Y選合適的內(nèi)參基因非常重要。理論上，內(nèi)參基因的表達(dá)對(duì)維持組織細(xì)胞的生命活動(dòng)是必不可少的，在細(xì)胞中的表達(dá)比較恒定。但是，研究發(fā)現(xiàn)在生物體不同的發(fā)育階段、不同的組織以及不同的實(shí)驗(yàn)條件下基因表達(dá)水平存在很大差異[7-8]。李迪等[9]以鱖魚6個(gè)不同組織和5個(gè)不同發(fā)育階段為研究對(duì)象，從GAPDH、β-Actin和18SrRNA這3個(gè)備選內(nèi)參基因中篩選最適內(nèi)參基因。結(jié)果表明，在胚胎發(fā)育階段β-Actin表達(dá)最穩(wěn)定；不同組織樣品中，GAPDH表達(dá)最穩(wěn)定。鮑相渤等[10]研究Actin、GAPDH、Tubu、Cytb、Tbp和EF-1α等6個(gè)備選內(nèi)參基因，在饑餓脅迫下各組織、致病菌感染前后和水環(huán)境升溫前后不同時(shí)段血樣中mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果表明，饑餓脅迫條件下，在鰓、腎和血淋巴中Actin的表達(dá)穩(wěn)定，但是在外套膜、肝胰臟和閉殼肌中的表達(dá)不穩(wěn)定；致病菌感染條件下，Actin的表達(dá)最穩(wěn)定；而在水溫升高的條件下，Actin的穩(wěn)定性降低；GAPDH在饑餓脅迫中的表達(dá)穩(wěn)定性較差，但是在致病菌感染和溫度改變的條件下相對(duì)穩(wěn)定。

海洋軟體動(dòng)物的鰓和肝胰腺組織在免疫應(yīng)答和解毒過(guò)程中都發(fā)揮重要作用，前期我們已經(jīng)對(duì)無(wú)機(jī)氮脅迫條件下菲律賓蛤仔鰓組織的內(nèi)參基因做了深入研究[11-12]，但是對(duì)肝胰腺中內(nèi)參基因的表達(dá)情況不甚了解。因此，本研究以菲律賓蛤仔為研究對(duì)象，采用環(huán)境相關(guān)濃度(0.1 mg·L-1和0.5 mg·L-1)的氨氮暴露菲律賓蛤仔，在暴露3 h、1 d、3 d、7 d和14 d后分別取肝胰腺組織作為實(shí)驗(yàn)材料，篩選不同濃度氨氮暴露后，菲律賓蛤仔肝胰腺組織穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因。本實(shí)驗(yàn)選擇了肌動(dòng)蛋白基因(β-Actin、Actin)、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因(elongation factor 1-alpha,EF-1α)、微管蛋白基因(beta-tubulin,Tubu)、核糖體(18S RNA, 18S)、泛素蛋白基因(ubiquitin,Ubi)和親環(huán)素基因(cyclophilin A,CyPA)作為備選內(nèi)參基因，以肝胰腺cDNA為模板，利用qRT-PCR檢測(cè)備選基因的表達(dá)情況，并結(jié)合geNorm、NormFinder和BestKeeper程序評(píng)估其穩(wěn)定性，最后通過(guò)RefFinder軟件綜合分析不同氨氮濃度暴露后菲律賓蛤仔肝胰腺組織的最適內(nèi)參基因，為后續(xù)研究不同氨氮濃度條件下菲律賓蛤仔肝胰腺組織的基因表達(dá)提供定量分析基礎(chǔ)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用的菲律賓蛤仔于2019年10月購(gòu)自煙臺(tái)萊山區(qū)佳世客超市，選取健康、生命力強(qiáng)、體態(tài)均勻(長(zhǎng)3.77 cm±0.12 cm)的個(gè)體。氨氮暴露實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將菲律賓蛤仔放入室內(nèi)裝有40 L過(guò)濾海水的養(yǎng)殖池(60 cm×60 cm×30 cm)里暫養(yǎng)7 d，水溫(18±1) ℃，pH 8.0，鹽度30‰，24 h曝氣供氧；按照100只菲律賓蛤仔稱取1.0 g螺旋球藻喂食，每天喂食1次，喂食前和喂食后2 h各換水一次。從第8天開(kāi)始，根據(jù)海水的體積、溫度和pH值，向養(yǎng)殖池中加入對(duì)應(yīng)體積的1 mg·L-1分析純氯化銨配制的母液(國(guó)藥集團(tuán)，上海)，使其氨氮濃度分別達(dá)到0.1 mg·L-1和0.5 mg·L-1。

我們的前期研究表明，0.1 mg·L-1和0.5 mg·L-1氨氮濃度脅迫菲律賓蛤仔21 d，能夠?qū)е路坡少e蛤仔鰓組織出現(xiàn)膜系統(tǒng)損傷、攝食功能下降、鰓組織結(jié)構(gòu)損傷甚至死亡等嚴(yán)重毒性效應(yīng)[13-14]。因此，我們同樣采用相同的氨氮濃度梯度進(jìn)行14 d暴露實(shí)驗(yàn)，即設(shè)置0.1 mg·L-1暴露組、0.5 mg·L-1暴露組和空白對(duì)照，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)組30只菲律賓蛤仔。當(dāng)蛤仔暴露3 h、1 d、3 d、7 d和14 d后，從每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)組中隨機(jī)取2個(gè)蛤仔，摘取肝胰腺組織，濾紙吸干水分后迅速放入Trizol試劑中，-80 ℃保存。

1.2 總RNA提取及可用性檢測(cè)

采用Trizol試劑盒(TaKaRa，大連)，提取肝胰腺組織的總RNA。勻漿管中加入0.8 mL預(yù)冷的Trizol；取菲律賓蛤仔的肝胰腺組織放入勻漿管中，置于勻漿機(jī)(Bertin Precellys 24，法國(guó))勻漿20 s；轉(zhuǎn)移0.8 mL的勻漿液于1.5 mL EP管中，冰上放置5 min；加入200 μL的氯仿并用力震蕩30 s，冰上放置5 min后，4 ℃ 12 000g離心10 min；取300 μL的上清液，加入等體積的異丙醇并-20 ℃放置15 min后，4 ℃ 12 000g離心5 min；倒掉上清液，RNA沉淀用1.0 mL 75%的乙醇洗滌2次，4 ℃ 7 500g離心5 min；倒掉乙醇放置超凈臺(tái)干燥，待乳白色沉淀變?yōu)闊o(wú)色膠透明狀，加入30 μL RNase free水并放置于冰盒中溶解RNA沉淀；使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，利用Nanodrop 2000(Thermo Scientific，美國(guó))檢測(cè)其純度和濃度，當(dāng)OD260/OD280在1.8～2.2范圍內(nèi)時(shí)，認(rèn)為RNA的純度滿足qRT-PCR的實(shí)驗(yàn)條件。

1.3 cDNA合成及擴(kuò)增濃度確定

普通PCR反轉(zhuǎn)錄RNA合成cDNA，按照TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix (Transgen Biotech)提供的試劑和操作方案反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)體系為：總體積20 μL，包括2 μL RNA、1 μL Anchored Oligo(dT)18Primer(0.5 μg·μL-1)、10 μL 2×TS Reaction Mix、1 μL TransScript?RT/RI Enzyme Mix、1 μL gDNA Remover、5 μL RNase-free water；反應(yīng)條件為：42 ℃孵育15 min；85 ℃加熱5 s失活TransScript?RT/RI與gDNA Remover。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

根據(jù)前期研究基礎(chǔ)[11-12]，本次實(shí)驗(yàn)選取Actin、EF-1α、Tubu、18S、Ubi和CyPA作為備選內(nèi)參基因，其定量引物如表1所示，以菲律賓蛤仔肝胰腺組織的cDNA作為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。

表1 內(nèi)參基因的引物序列Table 1 Primer sequences for housekeeping genes

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)在ABI 7500 Real-Time Detection System (Applied Biosystems，美國(guó))中進(jìn)行，根據(jù)TransStart Tip Green qPCR SuperMix(Transgen Biotech)提供的試劑和操作方法擴(kuò)增目的基因。其擴(kuò)增的體系為：總體積20 μL，包括6 μL Template cDNA、0.4 μL Forward Primer(10 μmol·L-1)、0.4 μL Reverse Primer(10 μmol·L-1)、10 μL 2×TransStart tip green qPCR superMix、0.4 μL Passive Reference Dye Ⅰ、2.8 μL Nuclease-free water；反應(yīng)條件為94 ℃ 30 s；(94 ℃ 5 s、58 ℃ 15 s、72 ℃ 10 s)×40 cycles，擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線的數(shù)據(jù)分析。

1.5 內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

對(duì)備選內(nèi)參基因進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)獲得CT值，用-2-ΔΔCT法[15](ΔCT=CTsample-CTmin)計(jì)算每個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量。利用geNorm[16]、NormFinder[17]和BestKeeper[18]軟件3種方法對(duì)6個(gè)內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性值(expression stability value, M)進(jìn)行評(píng)價(jià)，并且最終根據(jù)RefFinder軟件[19]確定合適的內(nèi)參基因。根據(jù)數(shù)值越小穩(wěn)定性越好的原則，篩選出表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

geNorm軟件是一款用于微軟Excel平臺(tái)的VBA宏程序，分析Actin、18S、Ubi、CyPA、EF-1α和Tubu的-2-ΔΔCT，輸出平均穩(wěn)定性值(M)，M<1.5的基因被認(rèn)為是可行性的基因。根據(jù)M值越小基因表達(dá)穩(wěn)定性越好的原則，確定備選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性大小。另外據(jù)M值還可以得出配對(duì)差異值(Vn/Vn+1)，系統(tǒng)默認(rèn)配對(duì)差異值為0.15，若Vn/Vn+1<0.15，則最適內(nèi)參基因適配數(shù)為n,若Vn/Vn+1>0.15，則最適內(nèi)參基因適配數(shù)為n+1。

NormFinder是根據(jù)差異性來(lái)評(píng)估內(nèi)參基因穩(wěn)定性的軟件，它的算法和geNorm相似，也是分析內(nèi)參基因數(shù)據(jù)得出M值，根據(jù)M值越小其穩(wěn)定性越好的原理篩選最佳內(nèi)參基因，但是它無(wú)法確定最適內(nèi)參基因的數(shù)目。

BestKeeper軟件輸入每個(gè)備選內(nèi)參基因的CT值，并且基于標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV)值進(jìn)行計(jì)算，確定內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，基因的穩(wěn)定性與SD和CV值成反比。SD值<1的備選內(nèi)參基因被認(rèn)為是可接受作為內(nèi)參基因的；而SD值>1被認(rèn)為是不可接受的。

RefFinder是一款基于Web的內(nèi)參基因綜合評(píng)估工具，根據(jù)大量的CT值評(píng)估和選擇內(nèi)參基因。這個(gè)軟件集合geNorm、NormFinder、BestKeeper軟件和ΔCT4種內(nèi)參基因的評(píng)估方法，比較和排列備選內(nèi)參基因。每個(gè)內(nèi)參基因分配適當(dāng)?shù)臋?quán)重，計(jì)算它們權(quán)重的幾何平均值，最終根據(jù)賦值越小穩(wěn)定性越好的原則，確定最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

2 結(jié)果(Results)

2.1 RNA、cDNA和引物的質(zhì)量檢測(cè)

提取的總RNA進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，有28S、18S和5S條帶(圖1)，并且用Nanodrop 2000檢測(cè)純度，OD260/OD280在1.8～2.2范圍內(nèi)。結(jié)果表明，提取樣品RNA的完整性和純度良好，符合qRT-PCR的質(zhì)量要求。備選內(nèi)參基因的qRT-PCR結(jié)果顯示，熔解曲線呈單一的峰并且重復(fù)性好(圖2)。因此，所設(shè)計(jì)的引物特異性好，適合作為qRT-PCR擴(kuò)增引物。

圖1 對(duì)照組、氨氮脅迫組菲律賓蛤仔的肝胰腺組織總RNA電泳圖譜注：C1～C6，Control組；M，Marker；A1～A6，0.1 mg·L-1氨氮脅迫組；B1～B6，0.5 mg·L-1氨氮脅迫組。Fig. 1 Gel electrophoresis of total RNA samples from the hepatopancreas tissues of R. philippinarum in the control and ammonia nitrogen exposed groupsNote: C1～C6 denote control groups; M denotes Marker; A1～A6 denote 0.1 mg·L-1 of ammonia nitrogen-exposed groups; B1～B6 denote 0.5 mg·L-1 of ammonia nitrogen-exposed groups.

圖2 6個(gè)備選內(nèi)參基因擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線Fig. 2 Melting curves of PCR products from 6 reference genes

2.2 cDNA的濃度確定

對(duì)樣品cDNA模板進(jìn)行梯度稀釋，稀釋倍數(shù)為10倍、20倍、100倍、200倍和1 000倍。qRT-PCR結(jié)果表明，10倍和20倍稀釋濃度下CT值在20.0～25.0之間，其他的稀釋濃度的CT值>25.0。因此，10倍和20倍稀釋濃度的cDNA模板適合作為檢測(cè)模板，本次實(shí)驗(yàn)采用稀釋20倍的cDNA為定量模板。

2.3 內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

2.3.1 geNorm軟件分析

通過(guò)geNorm軟件分析(表2)，得到Actin、18S、Ubi、CyPA、EF-1α和Tubu的平均表達(dá)穩(wěn)定性值M值分別為1.029、1.207、1.029、1.085、1.861和1.403。根據(jù)M值越小基因的穩(wěn)定性越好的原則，6個(gè)備選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性大小為Actin=Ubi>CyPA>18S>Tubu>EF-1α。因此，geNorm分析表明Actin和Ubi是表達(dá)相對(duì)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

內(nèi)參基因的數(shù)目通過(guò)geNorm軟件分析得到的配對(duì)差異值Vn/Vn+1來(lái)確定，一般默認(rèn)值為0.15，當(dāng)Vn/Vn+1<0.15時(shí)，選擇n個(gè)基因作為內(nèi)參基因，不必添加基因來(lái)提高基因表達(dá)分析的準(zhǔn)確性；當(dāng)Vn/Vn+1>0.15時(shí)選擇n+1個(gè)基因作為內(nèi)參基因。在本研究中Vn/Vn+1均>0.15(圖3)，無(wú)法通過(guò)geNorm確定內(nèi)參基因的數(shù)目。

圖3 geNorm分析氨氮暴露后內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性Fig. 3 Stability value of reference gene expression after ammonia nitrogen exposure by geNorm

2.3.2 NormFinder軟件分析

NormFinder分析結(jié)果顯示(表2)，6個(gè)備選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值分別為Actin(0.075)、18S(0.416)、Ubi(0.363)、CyPA(0.284)、EF-1α(0.932)和Tubu(0.475)，即NormFinder分析表明表達(dá)最穩(wěn)定的基因是Actin。

2.3.3 BestKeeper軟件分析

BestKeeper軟件分析結(jié)果顯示(表2)，Actin、18S、CyPA和Ubi的SD值分別為0.99、0.67、0.81和0.47，均<1；Tubu和EF-1α的SD值分別為1.11和2.19，均>1。根據(jù)BestKeeper軟件的規(guī)則，SD值<1的基因可接受作為內(nèi)參基因，否則不可接受為內(nèi)參基因。因此，BestKeeper軟件分析可知Actin、18S、CyPA和Ubi可接受為內(nèi)參基因，其中Ubi是表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

表2 geNorm、NormFinder和BestKeeper分析穩(wěn)定值排名Table 2 Stability ranking by geNorm、NormFinder and BestKeeper analysis

2.3.4 綜合排名分析

通過(guò)在線軟件RefFinder集合geNorm、NormFinder、BestKeeper軟件和ΔCT的內(nèi)參基因評(píng)估方法，將各基因的CT值輸入程序中，程序?yàn)槊總€(gè)基因賦值排序，賦值越小則表達(dá)越穩(wěn)定。RefFinder綜合分析6個(gè)備選基因表達(dá)穩(wěn)定性大小依次為(表3)：Actin(1.32)、18S(1.83)、Ubi(2.00)、CyPA(2.71)、Tubu(5.00)和EF-1α(6.00)。因此，不同濃度氨氮暴露菲律賓蛤仔的肝胰腺組織中，表達(dá)相對(duì)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因是Actin。

表3 RefFinder分析穩(wěn)定值排名Table 3 Stability ranking by RefFinder analysis

3 討論(Discussion)

目前，熒光定量PCR是快速、可靠定量目標(biāo)基因表達(dá)水平的常用方法。為了準(zhǔn)確比較不同實(shí)驗(yàn)條件下mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，需要選擇一個(gè)表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因作為對(duì)照[20]。閆含笑等[21]在研究池蝶蚌β-連環(huán)蛋白基因cDNA的克隆及表達(dá)特征分析時(shí)，采用Actin作為內(nèi)參基因，對(duì)不同組織中的β-連環(huán)蛋白基因進(jìn)行表達(dá)定量分析；程雪艷等[22]利用qRT-PCR技術(shù)，分析谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)基因在泥蚶的不同組織以及重金屬刺激后的表達(dá)量時(shí)，選取18S作為內(nèi)參基因。關(guān)于菲律賓蛤仔內(nèi)參基因的篩選，牟政強(qiáng)等[23]以菲律賓蛤仔的不同發(fā)育階段和不同組織為研究材料，運(yùn)用qRT-PCR技術(shù)結(jié)合3個(gè)內(nèi)參基因篩選方法geNorm、NormFinder及△CT對(duì)12個(gè)備選內(nèi)參基因進(jìn)行穩(wěn)定性分析，發(fā)現(xiàn)菲律賓蛤仔在不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)較穩(wěn)定的內(nèi)參基因是CYTC、CYTB5和RPS23，菲律賓蛤仔成體不同組織中表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因是CYTB5和GFRP2，Actin在菲律賓蛤仔的不同組織和不同發(fā)育階段表達(dá)皆最不穩(wěn)定。曹滕飛等[11]以經(jīng)0.1 mg·L-1氨氮暴露后的菲律賓蛤仔鰓組織為研究材料，篩選穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因，發(fā)現(xiàn)EF-1α是表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。王愛(ài)云等[12]以經(jīng)亞硝態(tài)氮暴露的菲律賓蛤仔為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)Actin可作為研究亞硝態(tài)氮對(duì)菲律賓蛤仔鰓組織基因功能的內(nèi)參基因。綜上可見(jiàn)，即使是同一種生物，受到不同的脅迫處理、同一暴露物的不同暴露濃度、不同發(fā)育階段和不同組織等條件下，其內(nèi)參基因表達(dá)的穩(wěn)定性存在極大差異。因此，為了確保檢測(cè)目的基因表達(dá)水平的準(zhǔn)確性，當(dāng)實(shí)驗(yàn)條件發(fā)生改變時(shí)，相應(yīng)的內(nèi)參基因篩選工作需要重新進(jìn)行。

本研究中，使用geNorm、NormFinder和BestKeeper程序分別評(píng)估不同氨氮濃度(0.1 mg·L-1和0.5 mg·L-1)暴露下，菲律賓蛤仔肝胰腺組織內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性，最后通過(guò)RefFinder程序綜合評(píng)估內(nèi)參基因的穩(wěn)定性。根據(jù)geNorm軟件對(duì)6個(gè)備選內(nèi)參基因表達(dá)的分析結(jié)果，備選內(nèi)參基因穩(wěn)定性大小為，Actin=Ubi>CyPA>18S>Tubu>EF-1α；NormFinder分析結(jié)果表明，菲律賓蛤仔肝胰腺組織中備選內(nèi)參基因穩(wěn)定性大小為Actin>CyPA>Ubi>18S>Tubu>EF-1α；BestKeeper軟件分析SD值<1的18S(0.67)、CyPA(0.81)、Actin(0.99)和Ubi(0.47)可作為內(nèi)參基因，其穩(wěn)定性大小為Ubi>18S>CyPA>Actin。

由于geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件評(píng)估的側(cè)重點(diǎn)不同，其分析結(jié)果存在差異。因此，我們利用包含上述3種方法以及ΔCT的RefFinder程序綜合評(píng)估內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，為每個(gè)內(nèi)參基因分配適當(dāng)?shù)臋?quán)重，并且計(jì)算它們權(quán)重的幾何平均值，最終確定內(nèi)參基因穩(wěn)定性的大小。RefFinder分析結(jié)果表明(表3)，6個(gè)備選內(nèi)參基因穩(wěn)定性通過(guò)geNorm和NormFinder軟件單獨(dú)分析的結(jié)果與RefFinder的基本一致，BestKeeper軟件單獨(dú)分析的結(jié)果與RefFinder稍有差異。但是通過(guò)RefFinder綜合分析6個(gè)備選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，其結(jié)果為Actin>18S>Ubi>CyPA>Tubu>EF-1α。

另外，單獨(dú)通過(guò)geNorm軟件計(jì)算內(nèi)參基因的配對(duì)差異(Vn/Vn+1)值可確定最適內(nèi)參基因的數(shù)目。不同氨氮濃度暴露菲律賓蛤仔中配對(duì)變異值均>0.15(圖3)，無(wú)法通過(guò)配對(duì)變異值確定內(nèi)參基因的數(shù)目。但是，根據(jù)geNorm提供的手冊(cè)，系統(tǒng)默認(rèn)的配對(duì)變異值0.15并非嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)。大量的研究表明，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中存在配對(duì)變異值>0.15的情況。Zhang等[24]利用qRT-PCR篩選百合中用于基因表達(dá)研究的內(nèi)參基因時(shí)，所有的實(shí)驗(yàn)條件下Vn/Vn+1>0.15，無(wú)法確定內(nèi)參基因的數(shù)目，但是作者通過(guò)geNorm、NormFinder和BestKeeper的分析結(jié)果確定適合的內(nèi)參基因；Li等[25]通過(guò)qRT-PCR鑒定合適的內(nèi)參基因用于人類卵巢腫瘤的基因表達(dá)研究，備選內(nèi)參基因的配對(duì)變異值都>0.15，但是根據(jù)配對(duì)變異值的趨勢(shì)，作者推薦GUSB、PPIA和TBP為人類卵巢腫瘤的基因表達(dá)研究的內(nèi)參基因。Penning等[26]研究?jī)?nèi)參基因在貓的牙(牙根、牙冠)、心(左心室)、腎、肝、肺和乳腺組織里表達(dá)的穩(wěn)定性時(shí)，在所有組織中備選的10個(gè)內(nèi)參基因的配對(duì)差異分析值均>0.15，需要同時(shí)選用6個(gè)才能對(duì)檢測(cè)的所有組織基因表達(dá)進(jìn)行最佳標(biāo)準(zhǔn)化。潘暢等[27]確定RPS23可以作為孟氏隱唇蟲不同發(fā)育階段和不同組織的基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因，而該研究的Vn/Vn+1>0.15。鮑相渤等[10]用定量PCR研究?jī)?nèi)參基因在蝦夷扇貝中表達(dá)穩(wěn)定性時(shí)，發(fā)現(xiàn)饑餓的條件下，血淋巴、腎和閉殼肌中出現(xiàn)了Vn/Vn+1>0.15的情況，這可能時(shí)由于饑餓對(duì)內(nèi)參基因的表達(dá)產(chǎn)生了影響；此外，該研究在預(yù)試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，正常喂食的條件下候選內(nèi)參基因在各種組織間的Vn/Vn+1值也>0.15，作者指出這可能是由于組織的細(xì)胞組成類型和比例不同及試驗(yàn)中的候選基因有限所致。國(guó)外的研究者也指出，在某些情況下默認(rèn)值0.15可能過(guò)于嚴(yán)格，它受實(shí)驗(yàn)條件、個(gè)體間的差異以及基因數(shù)量等因素的影響[28-29]，因此不必拘泥于Vn/Vn+1值是否<0.15。綜合3個(gè)評(píng)估方法的分析結(jié)果和RefFinder的綜合分析結(jié)果，我們認(rèn)為在當(dāng)前氨氮濃度(0.1 mg·L-1和0.5 mg·L-1)暴露條件下，Actin是研究菲律賓蛤仔肝胰腺組織內(nèi)基因表達(dá)的最適內(nèi)參基因。