閆小雨，曾鴻鵠,2,3,4，宋曉紅,2,3,*，梁延鵬,2,3,4，黎昕，劉志銳，黃思齊，鄧?guó)櫛?/p>

1. 桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，桂林 541000 2. 廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，桂林 541000 3. 巖溶地區(qū)水污染控制與用水安全保障協(xié)同創(chuàng)新中心，桂林 541000 4. 廣西環(huán)境污染控制理論與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科教結(jié)合科技創(chuàng)新基地，桂林 541000

對(duì)羥基苯甲酸酯是對(duì)羥基苯甲酸與烷基形成的一種脂類化合物[1]，作為防腐劑被廣泛使用于食品、化妝品和藥品中[2-3]。在眾多對(duì)羥基苯甲酸酯化合物中，對(duì)羥基苯甲酸丙酯(propylparaben, PrP)在環(huán)境中的檢出頻率和含量較高，地表水、污泥、沉積物和土壤中均有檢出[4-5]。PrP的大量使用導(dǎo)致其廣泛存在于魚(yú)類、無(wú)脊椎動(dòng)物、海草、海洋大藻類、紅樹(shù)林等動(dòng)植物體內(nèi)[6]，在海洋食物網(wǎng)中有生物累積和放大作用[7]。此外，PrP在魚(yú)類的早期發(fā)育階段通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、DNA雙鏈斷裂、細(xì)胞凋亡以及改變脂肪酸代謝等途徑引起機(jī)體毒性[8]，并具有與雙酚類物質(zhì)相似的雌激素效應(yīng)[9]。

魚(yú)類的鰓和皮膚是重要防御組織，當(dāng)魚(yú)體暴露于受污染的水體時(shí)，某些污染物例如內(nèi)分泌干擾物會(huì)通過(guò)魚(yú)鰓和表皮組織進(jìn)入魚(yú)體[10-11]，從而破壞魚(yú)鰓細(xì)胞和魚(yú)體腎臟細(xì)胞等細(xì)胞的離子平衡[12]。Baldissera等[13]研究發(fā)現(xiàn)，銀鯰魚(yú)(Clariasbatrachus)在受到豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)毒害作用時(shí)，魚(yú)體腎臟細(xì)胞內(nèi)K+穩(wěn)態(tài)會(huì)被破壞最終導(dǎo)致魚(yú)體腎臟功能受損；Hung等[14]通過(guò)測(cè)量斑馬魚(yú)(Daniorerio)細(xì)胞內(nèi)Ca2+流速變化，證實(shí)了污染物順鉑對(duì)斑馬魚(yú)細(xì)胞離子穩(wěn)態(tài)的損害。K+是動(dòng)植物的必需元素，其穩(wěn)態(tài)對(duì)維持細(xì)胞各項(xiàng)功能正常運(yùn)轉(zhuǎn)具有重要作用[15]，人體血細(xì)胞內(nèi)K+含量過(guò)高或過(guò)低都會(huì)引起器官衰竭等病癥[16]。細(xì)胞內(nèi)高K+低Na+的環(huán)境是保持細(xì)胞離子平衡和新陳代謝的重要基礎(chǔ)，K+穩(wěn)態(tài)變化可有效指示污染物的毒害作用，目前關(guān)于PrP對(duì)魚(yú)體內(nèi)K+平衡影響的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

食蚊魚(yú)(Gambusiaaffinis)分布于我國(guó)華南地區(qū)的淡水水體中，體型小、容易捕撈且易于在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，因此被廣泛應(yīng)用于環(huán)境毒理學(xué)研究。本文以食蚊魚(yú)作為模式生物，通過(guò)急性毒性實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度PrP暴露下食蚊魚(yú)的半致死濃度(LC50)，采用非損傷微測(cè)技術(shù)檢測(cè)魚(yú)體表皮和魚(yú)鰓的K+流速，分別研究了不同濃度PrP瞬時(shí)暴露和96 h暴露后魚(yú)體表皮和魚(yú)鰓的K+流速變化，探討PrP暴露對(duì)魚(yú)體表皮和魚(yú)鰓細(xì)胞K+通道的影響機(jī)制，為PrP的毒性評(píng)估和環(huán)境監(jiān)測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

食蚊魚(yú)購(gòu)自廣西荔浦青山水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)，在水生生物養(yǎng)殖系統(tǒng)中適應(yīng)7 d。實(shí)驗(yàn)用水連續(xù)曝氣24 h以上，水溫為24.5℃±0.5℃，pH為7.5±0.1，溶解氧為(5.9±0.5) mg·L-1，保持14 h∶10 h的光暗條件，每天定時(shí)投喂2次豐年蟲(chóng)蟲(chóng)卵。挑選健康活潑、大小均一的個(gè)體作為實(shí)驗(yàn)用魚(yú)，平均體質(zhì)量為(0.18±0.04) g，平均體長(zhǎng)為(2.7±0.2) cm。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 食蚊魚(yú)急性毒性實(shí)驗(yàn)

采用半靜態(tài)法研究PrP對(duì)食蚊魚(yú)的急性毒性效應(yīng)，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)獲得96 h無(wú)死亡最高濃度(5 mg·L-1)和24 h全部死亡最低濃度(11 mg·L-1)，作為正式實(shí)驗(yàn)的濃度區(qū)間。采用等對(duì)數(shù)間距法設(shè)置8個(gè)濃度組，PrP的濃度分別為5.0、5.6、6.3、7.1、7.9、8.9、10和11 mg·L-1，并設(shè)空白對(duì)照組和二甲基亞砜(DMSO)對(duì)照組。按實(shí)驗(yàn)所需配制母液，實(shí)驗(yàn)前每次取1 mL母液加入1 L水中，DMSO終濃度為1‰。分別將8條實(shí)驗(yàn)用魚(yú)置于配有不同濃度PrP溶液的燒杯中，每個(gè)燒杯3 L PrP溶液，每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)平行。每24 h更換1/2 PrP溶液，測(cè)定溶解氧和pH，記錄24、48、72和96 h每個(gè)燒杯中食蚊魚(yú)的死亡情況。當(dāng)魚(yú)失去平衡、腹部向上，用玻璃棒觸碰無(wú)反應(yīng)，魚(yú)鰓無(wú)閉合則判定魚(yú)體死亡。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純，購(gòu)自Sigma-Aldrich化學(xué)制品有限公司(St.Louis, MO, USA)。

1.2.2 K+流速的測(cè)定方法

采用非損傷微測(cè)系統(tǒng)(NMT100/200 Series，北京旭月公司，中國(guó))以非損傷性掃描離子選擇微電極測(cè)定魚(yú)體表皮和魚(yú)鰓中K+的含量?；贜ernst方程和Fick’s第一擴(kuò)散定律計(jì)算K+流速，能夠獲得非常細(xì)微的信號(hào)，流速能夠達(dá)到10～12 pmol·(cm2·s)-1，離子流計(jì)算結(jié)果為正值時(shí)表示K+流出細(xì)胞(外排)，計(jì)算結(jié)果為負(fù)值時(shí)表示K+流入細(xì)胞(內(nèi)流)。

離子選擇微電極使用之前需要校正，校準(zhǔn)結(jié)果如下：校準(zhǔn)液1(1 mmol·L-1K+)電壓為-22.47 mV，校準(zhǔn)液2(0.25 mmol·L-1K+)電壓為-56.26 mV，測(cè)試液(0.5 mmol·L-1K+)電壓為-39.89 mV，在測(cè)試過(guò)程中測(cè)試液電壓波動(dòng)在±10 mV之內(nèi)，則滿足校準(zhǔn)要求。在靠近目標(biāo)物的2個(gè)位置之間移動(dòng)微電極，由電腦驅(qū)動(dòng)的液壓機(jī)械手來(lái)控制其移動(dòng)距離和頻率，將目標(biāo)物放置于裝有測(cè)試液的7.5 cm一次性無(wú)菌培養(yǎng)皿中，在室溫下(26～28 ℃)檢測(cè)離子流速。

1.2.3 PrP瞬時(shí)暴露食蚊魚(yú)K+的流速測(cè)定

將實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)后的食蚊魚(yú)在體式顯微鏡下迅速解剖取出魚(yú)體的單邊魚(yú)鰓組織，將魚(yú)鰓放入裝有測(cè)試液的培養(yǎng)皿中，平衡10 min，魚(yú)鰓測(cè)試液成分為CaCl2(0.1 mmol·L-1)、MgCl2·6H2O(0.98 mmol·L-1)、MgSO4(0.81 mmol·L-1)、KCl(0.5 mmol·L-1)、NaCl(149.4 mmol·L-1)、D-半乳糖(5 mmol·L-1)、丙酮酸鈉(5 mmol·L-1)，平衡完成后將培養(yǎng)皿放置于顯微鏡下，利用機(jī)械手使傳感器距離魚(yú)鰓鰓絲1 μm，選擇測(cè)試模式X-30檢測(cè)魚(yú)鰓的K+流速。每個(gè)魚(yú)鰓樣品檢測(cè)時(shí)間為30 min，在檢測(cè)第10分鐘時(shí)加入PrP暴露液。PrP暴露液濃度由急性毒性實(shí)驗(yàn)得到的96 h-LC50確定，濃度選擇如下：低濃度LC50/10 (0.9 mg·L-1)，中濃度LC50/5 (1.8 mg·L-1)，高濃度LC50/2 (4.6 mg·L-1)。每個(gè)濃度組測(cè)定5條魚(yú)。

魚(yú)體表皮的測(cè)試過(guò)程與魚(yú)鰓一致，魚(yú)體表皮的測(cè)試液成分為NaCl(151 mmol·L-1)、CaCl2(0.25 mmol·L-1)、MgSO4(0.2 mmol·L-1)、KCl(0.5 mmol·L-1)，在上機(jī)測(cè)試前先用0.4 mg·L-1間氨基苯甲酸乙酯甲磺酸鹽(MS-222)將魚(yú)體麻醉20 min，確保魚(yú)體在測(cè)試過(guò)程中處于麻醉狀態(tài)以不影響測(cè)試結(jié)果，魚(yú)鰓和魚(yú)體表皮的檢測(cè)過(guò)程如圖1所示，魚(yú)體表皮測(cè)試部位為魚(yú)體背鰭往后5 mm。

圖1 魚(yú)鰓和魚(yú)體表皮K+流速的測(cè)試過(guò)程 (左：魚(yú)鰓，右：魚(yú)體表皮；玻璃針為傳感器尖端)Fig. 1 The process of K+ flow velocity test in the fish gills and epidermis (left: fish gills, right: fish epidermis; the glass needle is the sensor tip)

1.2.4 PrP 96 h暴露食蚊魚(yú)K+的流速測(cè)定

分別將5條食蚊魚(yú)暴露于96 h-LC50/10 (0.9 mg·L-1)、96 h-LC50/5 (1.8 mg·L-1)和96 h-LC50/2 (4.6 mg·L-1)3種不同濃度PrP溶液中96 h，并設(shè)空白對(duì)照組。用NMT系統(tǒng)檢測(cè)K+流速的過(guò)程同1.2.3，每個(gè)樣品檢測(cè)20 min，每測(cè)完1條魚(yú)魚(yú)體表皮后，立即解剖魚(yú)鰓，再檢測(cè)魚(yú)鰓細(xì)胞的K+流速。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±S.E)表示，采用單因素方差分析，以Tukey檢驗(yàn)法進(jìn)行兩兩比較，以P>0.05、P<0.01表示差異不顯著。安全濃度按Turubell氏公式求出，計(jì)算公式為SC=0.3×48 h-LC50/(24 h-LC50/48 h-LC50)[20]。

2 結(jié)果(Results)

2.1 PrP對(duì)食蚊魚(yú)的急性毒性效應(yīng)

PrP對(duì)食蚊魚(yú)的急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，空白組的食蚊魚(yú)與實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)相比無(wú)明顯變化，低濃度組的食蚊魚(yú)的活潑性和存活率與對(duì)照組基本相似，隨著濃度的增高，食蚊魚(yú)出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，表現(xiàn)為反應(yīng)遲緩、游速減慢、身體逐漸失去平衡、腹部朝上。食蚊魚(yú)的死亡率隨著暴露濃度的升高而升高，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，濃度升高至11 mg·L-1時(shí)，燒杯內(nèi)食蚊魚(yú)全部死亡。PrP暴露后，食蚊魚(yú)的24 h-LC50、48 h-LC50、72 h-LC50和96 h-LC50分別為9.70、9.63、9.45和為9.14 mg·L-1，安全濃度為2.85 mg·L-1。本實(shí)驗(yàn)中，24 h-LC50>48 h-LC50>72h-LC50>96 h-LC50，說(shuō)明隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，PrP對(duì)食蚊魚(yú)的毒性效應(yīng)提高且呈一定的時(shí)間-劑量效應(yīng)，PrP的濃度與食蚊魚(yú)反應(yīng)之間的關(guān)系屬于“S”型曲線關(guān)系。

圖2 對(duì)羥基苯甲酸丙脂(PrP)暴露對(duì)食蚊魚(yú)死亡率的影響Fig. 2 Effects of propylparaben (PrP) exposure on the mortality of mosquito fish

2.2 PrP瞬時(shí)暴露后食蚊魚(yú)K+的流速變化

在圖3和表1中，魚(yú)鰓中的K+主要處于外排狀態(tài)，其中0.9 mg·L-1PrP暴露前后K+流速差別不顯著(P>0.05)，90%的K+流速處于-25～100 pmol·(cm2·s)-1之間(圖3(a))；1.8 mg·L-1PrP暴露前后K+流速差別顯著(P<0.01)，暴露前魚(yú)鰓中的K+流速主要處于0～200 pmol·(cm2·s)-1之間，暴露后90%的K+流速處于0～700 pmol·(cm2·s)-1之間，PrP暴露后K+外排量增大，波動(dòng)幅度增大(圖3(b))；4.6 mg·L-1PrP暴露前后K+流速差別顯著(P<0.01)，暴露前魚(yú)鰓中的K+通量主要處于-25～200 pmol·(cm2·s)-1之間，暴露后90%的K+通量處于250～1 000 pmol·(cm2·s)-1之間(圖3(c))。圖3(d)中暴露前各濃度組間無(wú)顯著差別(P>0.05)，暴露后低濃度組與空白對(duì)照組無(wú)顯著差別(P>0.05)，高、中、低3個(gè)濃度組間差別顯著(P<0.01)，隨著PrP暴露濃度的增加，魚(yú)鰓中的K+流速波動(dòng)幅度增大，K+外排量增加，呈現(xiàn)劑量效應(yīng)；加藥后10 min，4.6 mg·L-1暴露組K+外排量分別是0.9 mg·L-1和1.8 mg·L-1暴露組K+外排量的14.03倍和2.10倍，1.8 mg·L-1暴露組K+外排量是0.9 mg·L-1暴露組K+外排量的6.64倍；加藥后20 min，4.6 mg·L-1暴露組K+外排量分別是0.9 mg·L-1和1.8 mg·L-1暴露組K+外排量的18.61倍和2.52倍，1.8 mg·L-1暴露組K+外排量是0.9 mg·L-1暴露組K+外排量的7.37倍。加藥后第14分鐘時(shí)，4.6 mg·L-1暴露組K+外排量分別是0.9 mg·L-1和1.8 mg·L-1暴露組K+外排量的21.3倍和2.7倍，1.8 mg·L-1暴露組K+外排量是0.9 mg·L-1暴露組K+外排量的8.2倍，14 min后各濃度組間K+流速差距不再增長(zhǎng)趨于穩(wěn)定。

表1 不同PrP暴露方式對(duì)食蚊魚(yú)K+流速的影響Table 1 Influence of different PrP treatment methods on the K+ flow velocity of mosquito fish

圖3 PrP瞬時(shí)暴露后食蚊魚(yú)魚(yú)鰓K+的流速變化注：(a)、(b)和(c)分別表示不同濃度PrP (0.9、1.8和4.6 mg·L-1)瞬時(shí)暴露下魚(yú)鰓K+流速的波動(dòng)情況，圖中不同顏色的折線分別表示5條 魚(yú)魚(yú)鰓的K+流速情況，(d)中每條折線表示不同PrP暴露組中5條魚(yú)魚(yú)鰓的K+流速的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差 (Mean ±S.E)；下同。Fig. 3 Changes of K+ flow velocity in the gills of mosquito fish after PrP instantaneous exposureNote: (a), (b) and (c) respectively represent the fluctuation of the gill K+ velocity under the instantaneous exposure of different concentrations of PrP (0.9, 1.8, 4.6 mg·L-1); the polylines with different colors in the figure represent the gills K+ flow velocity of 5 fishes, and each polyline in (d) represents the average values (Mean±SEM) of the K+ flow velocity in 5 fish gills after exposed to different PrP groups; the same as follow.

在圖4和表1中，魚(yú)體表皮的K+主要處于內(nèi)流狀態(tài)，其中0.9 mg·L-1PrP暴露前后魚(yú)體表皮K+流動(dòng)情況差別不顯著(P>0.05)，90%的K+流速處于區(qū)間-400～200 pmol·(cm2·s)-1(圖4(a))；1.8 mg·L-1PrP暴露前后差別顯著(P<0.01)，暴露前魚(yú)體表皮K+流速區(qū)間為-300～100 pmol·(cm2·s)-1，暴露后流速區(qū)間為-600～200 pmol·(cm2·s)-1，暴露后K+內(nèi)流量和外排量均增加，波動(dòng)較大(圖4(b))；4.6 mg·L-1PrP暴露前后差別顯著(P<0.01)，暴露前魚(yú)體表皮K+流速區(qū)間為-400～100 pmol·(cm2·s)-1，暴露后流速區(qū)間為-600～200 pmol·(cm2·s)-1，K+內(nèi)流量增大幅度大于增加的K+外排量，波動(dòng)區(qū)間范圍增廣(圖4(c))。圖4(d)中低濃度組與空白對(duì)照組無(wú)顯著差別(P>0.05)，1.8 mg·L-1和4.6 mg·L-1處理組K+流速差異不顯著(P>0.05)，但均與0.9 mg·L-1處理組差異顯著(P<0.01)，加藥后10 min，4.6 mg·L-1暴露組K+內(nèi)流量是0.9 mg·L-1暴露組K+內(nèi)流量的5.45倍，1.8 mg·L-1暴露組K+內(nèi)流量是0.9 mg·L-1暴露組K+內(nèi)流量的4.59倍；加藥后20 min，4.6 mg·L-1暴露組K+內(nèi)流量是0.9 mg·L-1暴露組K+內(nèi)流量的4.35倍，1.8 mg·L-1暴露組K+內(nèi)流量是0.9 mg·L-1暴露組K+內(nèi)流量的3.73倍。

圖4 PrP瞬時(shí)暴露后食蚊魚(yú)魚(yú)體表皮K+的流速變化Fig. 4 Changes of K+ flow velocity in fish epidermis of mosquito fish after PrP instantaneous exposure

2.3 PrP 96 h暴露后食蚊魚(yú)K+的流速變化

在圖5和表1中，PrP 96 h暴露后食蚊魚(yú)魚(yú)鰓的K+主要處于外排狀態(tài)，空白組K+流速主要處于-25～100 pmol·(cm2·s)-1之間(圖5(a))；0.9 mg·L-1PrP暴露條件下90%的K+流速處于區(qū)間-25～400 pmol·(cm2·s)-1(圖5(b))；1.8 mg·L-1PrP暴露條件下，90%的K+流速處于區(qū)間0～500 pmol·(cm2·s)-1(圖5(c))；4.6 mg·L-1PrP暴露條件下，90%的K+流速處于區(qū)間-100～500 pmol·(cm2·s)-1(圖5(d))。在圖5(e)中各濃度組間K+流速差別顯著(P<0.01)，K+外排量隨著暴露濃度的增大而增大，測(cè)定前10 min時(shí)4.6 mg·L-1暴露組K+外排量分別是空白對(duì)照組和1.8 mg·L-1暴露組K+外排量的9.70倍和1.21倍，1.8 mg·L-1暴露組K+外排量分別是空白對(duì)照組和0.9 mg·L-1暴露組K+外排量的8.03倍和1.93倍，0.9 mg·L-1暴露組K+外排量是空白對(duì)照組K+外排量的4.17倍；測(cè)定10 min至20 min時(shí)4.6 mg·L-1暴露組K+外排量分別是空白對(duì)照組和1.8 mg·L-1暴露組K+外排量的10.81倍和1.37倍，1.8 mg·L-1暴露組K+外排量分別是空白對(duì)照組和0.9 mg·L-1暴露組K+外排量的7.87倍和3.31倍，0.9 mg·L-1暴露組K+外排量是空白對(duì)照組K+外排量的2.38倍。

圖5 PrP暴露96 h后魚(yú)鰓K+的流速變化注：(a)、(b)、(c)和(d)分別表示空白對(duì)照組和不同濃度PrP (0.9、1.8和4.6 mg·L-1)暴露96 h后魚(yú)鰓K+流速的波動(dòng)情況，圖中不同顏色的折線分別 表示5條魚(yú)魚(yú)鰓的K+流速情況，(e)中每條折線表示空白對(duì)照組和不同PrP暴露組中5條魚(yú)魚(yú)鰓的K+流速的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Mean±S.E)；下同。Fig. 5 Changes of K+ flow velocity in the gills of mosquito fish after PrP 96 h exposureNote: (a), (b), (c) and (d) respectively represent the fluctuation of the gill K+ flow velocity under the 96 h exposure of different PrP concentrations (0, 0.9, 1.8, 4.6 mg·L-1); the polylines with different colors in the figure represent the gills K+ flow velocity of 5 fishes, and each polyline in (e) represents the average values (Mean±SEM) of the K+ flow velocity in 5 fish gills after exposed to different PrP groups; the same as follow.

在圖6和表1中，PrP 96 h暴露后食蚊魚(yú)魚(yú)體表皮的K+主要處于內(nèi)流狀態(tài)。空白組K+流速主要處于-200～150 pmol·(cm2·s)-1之間(圖6(a))；0.9 mg·L-1PrP暴露組中，90%的K+流速處于區(qū)間-450～100 pmol·(cm2·s)-1(圖6(b))；1.8 mg·L-1PrP暴露組中，90%的K+流速處于區(qū)間-500～150 pmol·(cm2·s)-1(圖6(c))；4.6 mg·L-1PrP暴露組中，90%的K+流速處于區(qū)間-650～250 pmol·(cm2·s)-1(圖6(d))。圖6(e)中空白對(duì)照組和0.9 mg·L-1PrP暴露組K+流速無(wú)顯著差異(P>0.05)，其余各組間K+流速差異顯著(P<0.01)，K+流速跟暴露濃度出現(xiàn)正相關(guān)性，測(cè)定前10 min時(shí)4.6 mg·L-1暴露組分別是空白對(duì)照組和1.8 mg·L-1暴露組K+外排量的6.50倍和1.27倍，1.8 mg·L-1暴露組K+外排量分別是空白對(duì)照組和0.9 mg·L-1暴露組K+外排量的5.11倍和5.03倍；測(cè)定10 min至20 min時(shí)4.6 mg·L-1暴露組分別是空白對(duì)照組和1.8 mg·L-1暴露組K+外排量的7.94倍和1.13倍，1.8 mg·L-1暴露組K+外排量分別是空白對(duì)照組和0.9 mg·L-1暴露組K+外排量的7.03倍和7.38倍。

3 討論(Discussion)

3.1 PrP對(duì)食蚊魚(yú)的急性毒性效應(yīng)

PrP的96 h-LC50為9.14 mg·L-1，表現(xiàn)為中等毒性。這與Dobbins等[21]的研究結(jié)果類似，大型溞(Daphniamagna) PrP的96 h-LC50范圍在4.0～24.6 mg·L-1，黑頭軟口鰷(Pimephalespromelas) PrP的96 h-LC50為3.3～160.0 mg·L-1。Terasaki等[22]的研究表明，PrP對(duì)大多數(shù)水生生物都具有急性毒性效應(yīng)。PrP具有親脂性，Ding等[23]推測(cè)這種毒性效應(yīng)與水辛醇分配系數(shù)有關(guān)，該衍生物越疏水毒性效應(yīng)越強(qiáng)，由此可見(jiàn)，PrP對(duì)水生生物的毒性與其親脂性有關(guān)，相對(duì)于其他對(duì)羥基苯甲酸酯類物質(zhì)，PrP對(duì)水生生物類具有較強(qiáng)的毒性。

3.2 不同濃度PrP暴露對(duì)魚(yú)鰓K+流速的影響

鈉鉀泵是Na+和K+之間進(jìn)行交換的一種蛋白質(zhì)載體，通過(guò)磷酸化和去磷酸化的過(guò)程發(fā)生構(gòu)象的變化，導(dǎo)致與Na+、K+的親和力不同，使細(xì)胞外的Na+濃度高于細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)K+濃度高于細(xì)胞外，每消耗一個(gè)ATP分子，逆電化學(xué)梯度泵出3個(gè)Na+和泵入2個(gè)K+。通常情況下K+的流入量和流出量是平衡的，K+的流入量增多會(huì)出現(xiàn)低鉀血癥，鉀的流出量增多會(huì)出現(xiàn)高鉀血癥[24]。鈉鉀泵保持膜內(nèi)高鉀，膜外高鈉的不均勻離子分布，以維持細(xì)胞內(nèi)正外負(fù)的靜息電位以保證細(xì)胞正常的生理活動(dòng)，細(xì)胞內(nèi)外K+濃度變化會(huì)導(dǎo)致這種離子平衡機(jī)制被破壞從而影響細(xì)胞的正常生理活動(dòng)[25]。

Knudsen和Jensen[26]研究發(fā)現(xiàn)，鯉魚(yú)(Cyprinuscarpio)在受到亞硝酸鹽的脅迫時(shí)K+會(huì)從紅細(xì)胞和骨骼肌組織中快速外排，導(dǎo)致細(xì)胞體積縮小，在該種環(huán)境下長(zhǎng)期暴露最終會(huì)引發(fā)細(xì)胞衰亡。H?rdig等[27]發(fā)現(xiàn)，造紙廠廢水暴露會(huì)影響魚(yú)類血液系統(tǒng)，破壞血紅細(xì)胞內(nèi)多種離子平衡，K+會(huì)從細(xì)胞中高速流失到細(xì)胞外造成細(xì)胞外高鉀血癥。本研究中，魚(yú)鰓中的K+在PrP瞬時(shí)暴露和96 h暴露后都處于外排狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與這些報(bào)道一致。Mardones等[19]發(fā)現(xiàn)，魚(yú)鰓細(xì)胞暴露于有害鞭毛藻毒素后，藻毒素與載體蛋白相結(jié)合通過(guò)細(xì)胞膜的卵磷脂層產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，使K+高速流出。PrP的辛醇水分配系數(shù)為3.04，具有親脂性[28]，可與細(xì)胞膜內(nèi)載體蛋白相結(jié)合，通過(guò)卵磷脂層進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并最終破壞細(xì)胞膜內(nèi)鈉鉀泵的功能。本研究中魚(yú)鰓對(duì)PrP暴露反應(yīng)敏感，可能是由于PrP進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)并破壞鈉鉀泵轉(zhuǎn)運(yùn)的功能，將細(xì)胞膜溶解使K+快速排出，具體機(jī)制還需進(jìn)一步探究

PrP瞬時(shí)暴露實(shí)驗(yàn)中，魚(yú)鰓高、中、低濃度組間K+流速差異顯著，具有劑量效應(yīng)，K+外排量隨著PrP濃度的升高和暴露時(shí)間的延長(zhǎng)增大；96 h PrP暴露后各實(shí)驗(yàn)組魚(yú)鰓K+流速差異顯著，呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。Flores-Lopes和Thomaz[29]的研究表明，魚(yú)鰓有很大的外部接觸面，對(duì)水環(huán)境的化學(xué)和物理變化特別敏感，流域水質(zhì)惡化，水中的污染物會(huì)引起魚(yú)鰓病變，所以魚(yú)鰓可做為環(huán)境監(jiān)測(cè)的工具。本研究中無(wú)論P(yáng)rP瞬時(shí)暴露還是96 h暴露，魚(yú)鰓的K+流速變化都呈現(xiàn)出顯著的劑量效應(yīng)，說(shuō)明鰓細(xì)胞對(duì)環(huán)境中PrP的變化較為敏銳，可有效的指示水環(huán)境中的對(duì)羥基苯甲酸酯類污染物。

魚(yú)鰓瞬時(shí)暴露和96 h暴露后K+流速差異顯著，暴露方式不同對(duì)魚(yú)鰓K+流速有一定影響。低濃度組中，魚(yú)鰓K+流速瞬時(shí)暴露后與暴露前無(wú)顯著差異，96 h暴露時(shí)低濃度組與空白組有顯著差異，說(shuō)明魚(yú)鰓短時(shí)間接觸低濃度PrP可能不會(huì)引起機(jī)體鈉鉀泵損傷，長(zhǎng)期接觸低濃度PrP會(huì)造成魚(yú)鰓鈉鉀泵功能一定程度的受損。Mardones等[19]研究藻毒素對(duì)魚(yú)鰓細(xì)胞系(RTgill-W1)的細(xì)胞膜離子轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在加入藻毒素的后10 min內(nèi)魚(yú)鰓細(xì)胞有明顯的刺激反應(yīng)，但隨著檢測(cè)的進(jìn)行，H+和K+流速變化會(huì)趨于一個(gè)穩(wěn)定值；Lin等[17]也發(fā)現(xiàn)在加入G蛋白偶聯(lián)受體5 min內(nèi)，斑馬魚(yú)細(xì)胞Ca2+流速有明顯的刺激反應(yīng)，隨著檢測(cè)的進(jìn)行Ca2+的流速變化亦趨于穩(wěn)定。本研究中，PrP 96 h暴露實(shí)驗(yàn)中各濃度組K+流速在測(cè)定過(guò)程中相對(duì)穩(wěn)定，瞬時(shí)暴露實(shí)驗(yàn)中各濃度組K+流速在測(cè)定過(guò)程中先急速升高后趨于穩(wěn)定，魚(yú)鰓在加入PrP后5 min內(nèi)具有一定的應(yīng)激性反應(yīng)，隨著測(cè)試時(shí)間的延長(zhǎng)，應(yīng)激性逐漸減弱；并且，魚(yú)鰓在適應(yīng)環(huán)境的過(guò)程中產(chǎn)生一定的防御機(jī)制，緩解了PrP暴露所引起的損傷。

3.3 不同濃度PrP暴露對(duì)魚(yú)體K+流速的影響

魚(yú)體表皮細(xì)胞暴露于PrP后，K+內(nèi)流明顯且波動(dòng)范圍大，這與Horng等[30]的研究結(jié)果一致，魚(yú)體皮膚內(nèi)層細(xì)胞在受到鹽脅迫時(shí)會(huì)向外排出K+，但魚(yú)體表皮細(xì)胞會(huì)吸收K+，可能是由于魚(yú)體表面的角質(zhì)形成細(xì)胞會(huì)主動(dòng)攝取K+，平衡魚(yú)鰓和皮膚內(nèi)層細(xì)胞對(duì)K+的外排。本實(shí)驗(yàn)中，K+內(nèi)流可能是因?yàn)轸~(yú)體表皮通過(guò)角質(zhì)形成細(xì)胞的途徑攝取K+，魚(yú)體皮膚內(nèi)層細(xì)胞排出的K+需要角質(zhì)形成細(xì)胞從外界大量攝入K+來(lái)平衡，說(shuō)明PrP對(duì)魚(yú)體表皮細(xì)胞造成了一定的影響，導(dǎo)致鈉鉀泵功能紊亂。

PrP瞬時(shí)暴露實(shí)驗(yàn)中，1.8 mg·L-1和4.6 mg·L-1處理組魚(yú)體表皮K+流速差異不顯著，與0.9 mg·L-1處理組差異顯著，說(shuō)明PrP濃度變化對(duì)魚(yú)體表皮K+流速有影響，鈉鉀泵轉(zhuǎn)運(yùn)功能具有ATP依賴性和飽和性，所以PrP濃度達(dá)到一定閾值后，鈉鉀泵對(duì)K+的轉(zhuǎn)運(yùn)達(dá)到最大值，PrP的濃度繼續(xù)增大對(duì)K+內(nèi)流速度變化影響不大。96 h PrP暴露后魚(yú)體表皮K+流速除空白對(duì)照組和0.9 mg·L-1PrP暴露組K+流速無(wú)顯著差異外，其余各組間K+流速差異顯著，說(shuō)明低濃度PrP沒(méi)有引起魚(yú)體表皮細(xì)胞損傷。

比較魚(yú)體表皮瞬時(shí)暴露和96 h暴露的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低濃度組差異不顯著，中濃度組和高濃度組差異顯著，此外，低濃度組瞬時(shí)暴露前后差異不顯著，96 h暴露前后差異亦不顯著，說(shuō)明低濃度組PrP短時(shí)間暴露和長(zhǎng)期暴露都不會(huì)引起魚(yú)體表皮K+流速的異常，可能是由于魚(yú)體表皮具有較好的防御機(jī)制，低濃度PrP暴露對(duì)魚(yú)體表皮細(xì)胞的鈉鉀泵功能無(wú)明顯干擾。中高濃度組在瞬時(shí)暴露時(shí)魚(yú)體表皮K+流速與對(duì)照組無(wú)顯著差別，在96 h暴露后卻與對(duì)照組差別顯著，說(shuō)明暴露方式不同，PrP對(duì)魚(yú)體的損傷程度也不同。

在本實(shí)驗(yàn)中，PrP暴露后魚(yú)鰓細(xì)胞和魚(yú)體表皮細(xì)胞的鈉鉀泵功能都受到了一定程度的損傷，不能維持細(xì)胞內(nèi)K+的正常轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，魚(yú)鰓細(xì)胞均向外排出K+，魚(yú)體表皮細(xì)胞向內(nèi)吸收K+，呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)，PrP對(duì)K+流速的影響與暴露時(shí)間、暴露方式有關(guān)。相比較而言，魚(yú)體表皮細(xì)胞抵抗PrP損傷的能力更強(qiáng)，魚(yú)鰓細(xì)胞對(duì)PrP引起的損傷更敏感，具有一定的指示作用。