孫菲 蘇維瑋 李佳 劉曉剛

(1山東大學(xué)齊魯醫(yī)院(青島)肝病科/感染病科，山東 青島 266000；2唐山市工人醫(yī)院肝膽外科)

非酒精性脂肪肝(NAFLD)是指除酒精和其他明確的肝損傷因素外所致的以肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)度沉積為主要特征的臨床病理綜合〔1〕，包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相關(guān)的肝硬化。單純性脂肪肝指的是肝臟脂質(zhì)含量超過(guò)肝臟體積的5%，隨著肝臟脂質(zhì)沉積的增多，肝臟炎癥隨之發(fā)生。NASH是單純性脂肪肝的下一階段〔2〕，其在一般人群中的發(fā)病率為3%～5%，NASH患者在進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌方面具有更高風(fēng)險(xiǎn)〔3〕。非酒精性脂肪肝是與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關(guān)的獲得性代謝性肝病，與肥胖、胰島素抵抗和高血糖密切相關(guān)〔4,5〕。隨著2型糖尿病和肥胖癥患病率增加，非酒精性脂肪肝成為一種比酒精性脂肪肝更常見(jiàn)的脂肪肝〔6〕，患病率約占總?cè)巳旱?0%〔7〕，因此探究NAFLD發(fā)病機(jī)制，為其防治提供一定的理論基礎(chǔ)，具有重要的臨床意義。

脂氧合酶(Aloxe)3基因可編碼一種新型代謝調(diào)控蛋白即表皮型Aloxe3〔8〕。研究報(bào)道，通過(guò)對(duì)患有非大皰性先天性魚(yú)肌樣紅皮病家族進(jìn)行連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)Aloxe3基因突變和非大皰性先天性魚(yú)肌樣紅皮病有關(guān)〔9〕。隨后研究發(fā)現(xiàn)Aloxe是一個(gè)氧化不飽和脂肪酸如花生四烯酸等特定的過(guò)氧化物的含鐵蛋白酶家族，Aloxe3蛋白即其中的一個(gè)獨(dú)特的可催化特定的環(huán)氧醇類生成的環(huán)氧醇合酶。相關(guān)研究證實(shí)，過(guò)表達(dá)Aloxe3可改善糖尿病小鼠的胰島素抵抗〔10〕，Aloxe3作為一個(gè)潛在的肝細(xì)胞禁食反應(yīng)的效應(yīng)調(diào)控分子〔10〕，是代謝性疾病尤其是糖尿病治療中的重要代謝靶蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，在禁食、葡萄糖饑餓或海藻糖/海藻糖類似物治療期間，Aloxe3基因被激活并介導(dǎo)了肝臟饑餓相關(guān)代謝反應(yīng)〔10,11〕。然而目前關(guān)于Aloxe3在脂肪肝中的作用機(jī)制仍不清楚，本研究探究Aloxe3在脂肪肝中的具體作用機(jī)制，為NAFLD治療尤其脂肪肝藥物研發(fā)發(fā)掘潛在的分子靶向位點(diǎn)。

1 試劑和方法

1.1試劑 脂質(zhì)(油紅O)染色試劑盒(貨號(hào)：0080-1)購(gòu)買(mǎi)自默克公司，Aloxe3過(guò)表達(dá)病毒和Aloxe3干擾病毒均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P生物，脂質(zhì)檢測(cè)試劑盒包括三酰甘油(TG)檢測(cè)試劑盒、總膽固醇(TC)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物有限公司，貨號(hào)分別為A110-1、A112-1。β-羥基丁酸檢測(cè)試劑盒購(gòu)自R&D公司，貨號(hào)為R2302-A。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑均購(gòu)自日本東洋紡TOYOBO公司，貨號(hào)為FSQ-101和FSQ-115。Aloxe3抗體購(gòu)自上海晅科生物科技有限公司，貨號(hào)141-240，tubulin抗體購(gòu)自Santa公司，貨號(hào)為13022。

1.2高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪肝小鼠飼養(yǎng) 16只雄性5周齡C57/BL小鼠購(gòu)自南京模式動(dòng)物中心，體重16～18 g，小鼠飼養(yǎng)在無(wú)特定病原體(SPF)動(dòng)物房中，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20～24℃，日溫差≤3℃，相對(duì)濕度達(dá)50%～650%，新鮮空氣換氣次數(shù)10次/h，日照12 h晝夜循環(huán)。適度適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后隨機(jī)分為對(duì)照組和高脂飼料組，每組8只，高脂飼料組開(kāi)始高脂飼料喂養(yǎng)，高脂飼料購(gòu)自Research Diet公司，對(duì)照組為普通飼料喂養(yǎng)。

1.3基因型肥胖(ob/ob)小鼠的飼養(yǎng) 8只雄性8周齡ob/ob小鼠及8只野生型對(duì)照小鼠購(gòu)自南京模式動(dòng)物中心，體重22～26 g，小鼠飼養(yǎng)在SPF動(dòng)物房中，飼養(yǎng)環(huán)境要求同高脂飼料喂養(yǎng)小鼠，ob/ob小鼠及其對(duì)照組小鼠普通飼料喂養(yǎng)與1.2中小鼠一樣，8 w后，苯巴比妥鈉麻醉小鼠，心尖心搏最明顯處穿刺取血，4℃ 2 500 r/min離心10 min，取小鼠肝臟凍存于-80℃用于后續(xù)檢測(cè)。

1.4Aloxe3過(guò)表達(dá)病毒感染野生型小鼠 16只雄性6周齡C57/BL小鼠購(gòu)自南京模式動(dòng)物中心，體重18～20 g，小鼠飼養(yǎng)在SPF動(dòng)物房中，飼養(yǎng)環(huán)境要求同1.2。適度適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后所有小鼠開(kāi)始高脂飼料喂養(yǎng)，每周稱量小鼠體重，連續(xù)喂養(yǎng)7 w后，隨機(jī)分為對(duì)照組和Aloxe3過(guò)表達(dá)組，每組8只，Aloxe3過(guò)表達(dá)組尾靜脈注射5×1010pfu/ml Aloxe3過(guò)表達(dá)腺病毒，對(duì)照組給予同等劑量的對(duì)照載體病毒，給予病毒后每周檢測(cè)一次小鼠體重及進(jìn)食量，4 w后，苯巴比妥鈉麻醉小鼠，心尖取血，4℃ 2 500 r/min離心10 min，同時(shí)取小鼠肝臟并稱量肝臟重量，然后取50 mg肝臟保存于組織包埋劑(OCT)保存液中用于冰凍切片油紅O染色，其余肝臟凍存于-80℃用于后續(xù)檢測(cè)。

1.5Aloxe3 shRNA下調(diào)小鼠肝臟中Aloxe3表達(dá) 20只雄性6周齡C57/BL小鼠購(gòu)自南京模式動(dòng)物中心，體重18～20 g，小鼠飼養(yǎng)在SPF動(dòng)物房中，飼養(yǎng)環(huán)境要求同方法1.2。適度適應(yīng)性喂養(yǎng)2 w后隨機(jī)分為對(duì)照組、Aloxe3干擾組，每組10只，小鼠尾靜脈注射1×1011pfu/ml Aloxe3 shRNA干擾腺病毒，對(duì)照組給予同等劑量的對(duì)照載體病毒，6 w后，兩組饑餓16 h，稱量小鼠體重，然后苯巴比妥鈉麻醉，心尖取血，4℃ 2 500 r/min離心10 min，同時(shí)取小鼠肝臟并稱量肝臟重量，取肝臟凍存于-80℃用于后續(xù)檢測(cè)。

1.6血清和肝臟中的脂質(zhì)含量 稱取50 mg肝組織放入裝有研磨珠的2 ml離心管，加入0.5 ml預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)，將離心管放入組織樣品研磨機(jī)中60 Hz、120 s震蕩研磨，加入1 ml氯仿-甲醇溶液(體積比為2∶1)，充分振蕩混勻，2 500 r/min離心10 min，離心后剝離上層組織片，上層為水相，吸取下層有機(jī)相至另一新的1.5 ml離心管中，離心管敞開(kāi)蓋子，通風(fēng)櫥中干燥過(guò)夜，然后利用無(wú)水乙醇溶解干燥后的脂質(zhì)，用TG及TC檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清和肝臟中的脂質(zhì)含量。TG及TC的檢測(cè)方法參照南京建成公司試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.7酮體水平檢測(cè) 利用β-羥基丁酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)小鼠血清中酮體β-羥基丁酸，樣品均采用復(fù)孔檢測(cè)，減少操作導(dǎo)致的誤差。操作根據(jù)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，大致步驟如下：每孔加入血清樣品100 μl(10倍稀釋)，然后加入樣品反應(yīng)液，37℃反應(yīng)30 min后，加入終止液 450 nm處檢測(cè)每孔的吸光度(OD值)。

1.8油紅O染色 用OCT包埋劑浸沒(méi)的肝臟組織在液氮中保存，然后在冰凍切片機(jī)中切成厚度為10 μm的冰凍切片，然后用4%多聚甲醛固定10 min，其次用蒸餾水洗，60%異丙醇浸洗分化，油紅O染液染色10 min，60%異丙醇分色至背景無(wú)色后蒸餾水洗2遍，蘇木素復(fù)染，蒸餾水洗后甘油明膠封片，然后顯微鏡下觀察肝臟切片油紅O染液陽(yáng)性區(qū)域并拍照。油紅O屬于偶氮染料，可與TG結(jié)合，油紅O染液陽(yáng)性區(qū)域表示脂質(zhì)沉積區(qū)域。

1.9實(shí)時(shí)熒光定量PCR 提取肝臟總RNA，加總RNA抽提劑(TRIZOL)試劑1 ml，震蕩碾磨搖勻，加氯仿0.2 ml，輕搖15 s，室溫靜置2～3 min后，12 000 r/min，4℃離心15 min。然后取上清無(wú)色水相到EP管中加0.5 ml異丙醇，室溫下靜置10 min，12 000 r/min，4℃離心10 min。棄去上清后75%乙醇洗滌總RNA白色沉淀，7 500 r/min，4℃離心5 min，焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解總RNA，測(cè)RNA濃度后利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄，最后利用DNA結(jié)合染料(SYBR)和隨機(jī)引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)基因的表達(dá)。引物序列如下：Aloxe3 正義：5′-TACACTGCATCAGCTGCATC-3′；反義：5′-CG CTCGCTCGCTATCAGCTG-3′。SREBP1正義：5′-CT CGTAGCATGATATCGAGT-3′；反義：5′-ATCGCTGGTATCGATGTACA-3′。FASN正義：5′-ATGCTGAACA GTGTACACAAT-3′；反義：5′-ACGCGTGTCAGCTAGC TAGCTT-3′。PPARα正義：5′-AGCTACAACTCGCTGCATGAT-3′；反義：5′-CAATCAGTCAGCATCGATAC-3′。CPT1α正義：5′-CGTACGTACGTACGATGCT AG-3′；反義：5′-ACGCATGATGACTAGATCC-3′。AC OX1 3正義：5′-CGCGCGTAGCATGATCGTG-3′；反義：5′-ACGTGATCGATGTGGCACC-3′。HMGCS2正義：5′-ACAAGATGCTCTGAGAGAGCC-3′；反義：5′-CATCGATGTGACATC TAGAGAGC-3′。SCD1正義：5′-CGATGTGCTGTCGAGACTACCCA-3′；反義：5′-ACGACTGACTAGTATCTGCGATTC-3′。GAPDH正義：5′-ACTGCATGCATGTGTCATCAGCGA-3′；反義：5′-CCGCGCTAGCT GCATGTACGCAGTC-3′。

1.10Western印跡 用組織快速裂解液(RIPA)裂解肝臟組織并在組織破碎儀震蕩，12 000 r/min 4℃離心20 min，取上清進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定，然后上樣80 V恒壓電泳，以120 V恒壓將蛋白電轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含有5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉PVDF膜1 h。封閉結(jié)束后，在含5%牛血清白蛋白(BSA)的TBST中用相應(yīng)的一抗孵育4℃過(guò)夜，二抗室溫結(jié)合2 h，加入顯影液曝光顯影，分析目的蛋白的表達(dá)量。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism6.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1兩組脂肪中Aloxe3表達(dá) 高脂飼料組小鼠肝臟中TG的含量顯著高于對(duì)照組(P<0.001)。高脂飼料組mRNA水平和蛋白水平均顯著低于對(duì)照組(P<0.001或P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 兩組肝臟中的Aloxe3表達(dá)

2.2ob/ob脂肪肝小鼠中Aloxe3表達(dá) ob/ob小鼠組肝臟中TG含量顯著高于對(duì)照組(P<0.001)。ob/ob小鼠組mRNA、蛋白水平均顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 ob/ob脂肪肝小鼠中Aloxe3表達(dá)

2.3過(guò)表達(dá)Aloxe3的小鼠體重和攝食量的改變 Aloxe3過(guò)表達(dá)組肝臟中Aloxe3的mRNA和蛋白水平〔(4.68±0.73),(3.89±0.69)〕顯著高于對(duì)照組〔(1.03±0.05),(1.11±0.08);P<0.01或P<0.001〕，表明Aloxe3過(guò)表達(dá)成功。Aloxe3過(guò)表達(dá)組Aloxe3過(guò)表達(dá)前，兩組體重?zé)o明顯差異，在Aloxe3過(guò)表達(dá)病毒感染1 w后，Aloxe3過(guò)表達(dá)組體重即開(kāi)始明顯低于對(duì)照組(P<0.05)，在Aloxe3過(guò)表達(dá)的第2、3、4周，兩組差異明顯增大(P<0.01或P<0.001)。而兩組攝食量未見(jiàn)明顯差異(P>0.05)，提示Aloxe3可能參與調(diào)控機(jī)體的能量代謝率。見(jiàn)表3。

表3 過(guò)表達(dá)Aloxe3的小鼠體重和攝食量改變

2.4過(guò)表達(dá)Aloxe3的小鼠脂質(zhì)代謝的改變 Aloxe3過(guò)表達(dá)組肝臟脂質(zhì)沉積量顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。見(jiàn)圖1。Aloxe3過(guò)表達(dá)組肝臟TG、血清TG和TC含量顯著低于對(duì)照組，而酮體β-羥基丁酸含量顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，表明Aloxe3過(guò)表達(dá)可降低小鼠血脂，促進(jìn)酮體生成，改善肝臟脂質(zhì)沉積。見(jiàn)表4。

圖1 過(guò)表達(dá)Aloxe3的小鼠肝臟脂質(zhì)沉積水平(油紅O染色，×200)

表4 過(guò)表達(dá)Aloxe3的小鼠肝臟脂質(zhì)代謝的改變

2.5Aloxe3可促進(jìn)脂質(zhì)分解和脂肪酸氧化 Aloxe3過(guò)表達(dá)后肝臟脂質(zhì)合成相關(guān)基因膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)1、脂肪酸合酶(FASN)、硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD)1的表達(dá)無(wú)明顯變化，而肝臟脂質(zhì)氧化分解相關(guān)基因過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)α、肉毒堿棕櫚?；D(zhuǎn)移酶(CPT)1α、過(guò)氧化物酶?；o酶A氧化酶(ACOX)1的表達(dá)均顯著高于對(duì)照組(P<0.01或P<0.001)。酮體生成基因3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A合成酶(HMGCS)2的表達(dá)顯著高于對(duì)照組，表明Aloxe3主要通過(guò)上調(diào)脂質(zhì)分解和脂肪酸氧化，促進(jìn)酮體生成，增強(qiáng)小鼠的脂質(zhì)分解代謝率。見(jiàn)表5。

表5 過(guò)表達(dá)Aloxe3小鼠肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)

2.6Aloxe3下調(diào)后小鼠脂代謝的改變 Aloxe3 shRNA腺病毒感染后的小鼠肝臟中Aloxe3表達(dá)較對(duì)照組顯著降低(P<0.001)，見(jiàn)圖2、表6，表明Aloxe3 shRNA腺病毒下調(diào)效果明顯。Aloxe3 shRNA腺病毒感染小鼠饑餓16 h后肝臟TG含量也顯著增加(P<0.001)。同時(shí)血清脂質(zhì)包括TC和TG含量顯著升高(P<0.001)，Aloxe3干擾組血清β-羥基丁酸水平顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)表6，說(shuō)明Aloxe 3參與調(diào)控肝臟脂質(zhì)代謝，尤其是脂肪酸氧化和酮體生成水平。

圖2 Aloxe3 shRNA病毒感染后Aloxe3在小鼠肝臟中的表達(dá)

表6 Aloxe3下調(diào)后小鼠脂代謝的改變

3 討 論

Aloxe3基因是一種編碼表皮型脂氧合酶eLOX3，有研究表明〔10〕Aloxe3基因被激活并介導(dǎo)了肝臟饑餓相關(guān)代謝反應(yīng)，是一種潛在的治療性禁食反應(yīng)的新型效應(yīng)物，提示Aloxe3基因可能參與了機(jī)體脂質(zhì)代謝的調(diào)控。為此本文首先在飲食誘導(dǎo)和ob/ob小鼠脂肪肝模型中檢測(cè)Aloxe3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Aloxe3在上述兩個(gè)脂肪肝模型中均表達(dá)下降。在小鼠中過(guò)表達(dá)Aloxe3，發(fā)現(xiàn)Aloxe3不僅可降低小鼠體重，還可抵抗高脂誘導(dǎo)的小鼠脂肪肝。這與此前的研究結(jié)果一致，過(guò)表達(dá)Aloxe3可增強(qiáng)db/db糖尿病小鼠的基礎(chǔ)產(chǎn)熱、改善胰島素抵抗〔10〕，提示過(guò)表達(dá)Aloxe3可能改善小鼠糖脂代謝。

肝葡萄糖饑餓反應(yīng)作為一種治療途徑，可增強(qiáng)肝臟和整個(gè)宿主的代謝率〔12〕，目前得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用〔13，14〕，而這些代謝調(diào)控的作用機(jī)制仍不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)小鼠在攝食量未明顯改變的情況下，高脂小鼠體重降低，脂肪肝改善，同時(shí)酮體生成水平增加，即過(guò)表達(dá)Aloxe3小鼠表現(xiàn)為肝葡萄糖饑餓反應(yīng)。同時(shí)Aloxe3可增強(qiáng)肝臟脂質(zhì)代謝，減輕脂肪堆積和體重增加，并降低血液中的TG和TC水平。提示Aloxe3可能是肝葡萄糖饑餓反應(yīng)的重要介導(dǎo)因子。然而對(duì)Aloxe3是否引起熱量燃燒增加、促進(jìn)機(jī)體的代謝率改變，將是以后研究的重點(diǎn)，下一步將利用代謝籠加以探究。

新的研究發(fā)現(xiàn)，天然海藻糖可激活A(yù)loxe3的表達(dá)以提高機(jī)體胰島素敏感性，從而降低2型糖尿病的發(fā)病概率〔15，16〕。有研究表明，通過(guò)飲水的方式喂食小鼠海藻糖會(huì)對(duì)其肝臟糖脂代謝功能帶來(lái)有益的影響〔17〕，其效果類似于饑餓〔15～18〕，但是對(duì)于海藻糖引起的小鼠脂代謝的改善是否通過(guò)Aloxe3目前尚無(wú)相關(guān)研究，應(yīng)進(jìn)一步研究海藻糖可否調(diào)控肝臟特異性Aloxe3敲除小鼠的糖脂代謝改變。研究表明當(dāng)肝臟PPARγ特異性敲除后，Aloxe3介導(dǎo)的增強(qiáng)胰島素敏感性的作用即消失，因此Aloxe3主要通過(guò)PPARγ-PGC1α通路來(lái)提高肝胰島素敏感性〔10〕。Aloxe3作為一個(gè)潛在的依賴PPARγ的禁食反應(yīng)效應(yīng)調(diào)控分子〔19〕，在脂代謝中的作用尤其在脂肪酸氧化和酮體生成中的作用〔20〕，是否依賴PPARγ目前尚不可知，本研究結(jié)果顯示PPARα在Aloxe3過(guò)表達(dá)后其水平亦顯著上升，可推測(cè)Aloxe3的脂質(zhì)代謝改善作用可能是依賴PPARα，這有待進(jìn)一步研究。