王 慧, 高 原, 韓 雙

(沈陽化工大學(xué) 理學(xué)院， 遼寧 沈陽 110142)

土霉素(oxytetracycline，OTC)屬于四環(huán)素類，是一種廣譜抗生素，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、支原體等具有抑制或殺菌作用.由于其成本較低，被廣泛應(yīng)用到畜禽養(yǎng)殖和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，導(dǎo)致含有OTC的廢水被大量排放到水體和土壤中.OTC性質(zhì)極其穩(wěn)定，在自然環(huán)境中不易被降解，可長期存在于水體和土壤中，對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生潛在危害.若人類長期食用殘留OTC的食物，可能產(chǎn)生抗藥性，從而危害身體健康[1-4].

目前，檢測OTC的方法主要有高效液相色譜法[5-6]、毛細(xì)管電泳法[7]、酶聯(lián)免疫法[8]、分光光度法[9],以及不同方法的聯(lián)用技術(shù)[10]等.電化學(xué)方法是測定OTC的方法之一，因成本低廉、操作簡單、靈敏度高而受到廣泛關(guān)注.

分子印跡技術(shù)(molecular imprinting technique，MIT)是一種多學(xué)科交叉的新型分子識別技術(shù)，能夠?qū)Ｒ蛔R別、吸附目標(biāo)分子，完成從復(fù)雜底物中分離富集某一特定痕量待測物的目的[11].分子印跡技術(shù)具有較高的靈敏度和選擇性，其在生物毒素、農(nóng)藥殘留、違規(guī)添加劑的檢測分析中得到廣泛應(yīng)用.分子印跡聚合物(MIPs)具有較強(qiáng)的特異性分子識別能力，且耐高溫、高壓及酸堿腐蝕[12]，在制備不同功能的傳感器方面，已得到廣泛應(yīng)用.

石墨烯由于其獨特的二維平面結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的導(dǎo)電性[13-15]，使其成為一種理想的負(fù)載材料.聚乙烯亞胺(PEI)分子鏈上大量的氨基和亞胺基與水分子形成很強(qiáng)的氫鍵，是目前已知的具有最高電荷密度的陽離子聚合物[16].

本文利用石墨烯和聚乙烯亞胺制備的復(fù)合材料(RGO-PEI)修飾玻碳電極，以O(shè)TC為模板分子，鄰苯二胺(OPD)為功能單體，采用電聚合方法制備OTC分子印跡聚合物薄膜，基于此構(gòu)建了檢測OTC的分子印跡電化學(xué)傳感器.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

OTC、氯霉素(CAP)、鹽酸金霉素(CTC)和鹽酸多西環(huán)素(DHC)，上海阿拉丁生化科技有限公司；納米石墨粉，Sigma-Aldrich公司；K3[Fe(CN)6]，山東西亞化學(xué)有限公司；無水乙醇，遼寧嘉城精細(xì)化學(xué)品有限公司；冰乙酸和無水乙酸鈉，天津博迪化工股份有限公司；OPD、PEI、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和KCl，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.所有試劑均為分析純.實驗用水為二次蒸餾水.

CHI660E電化學(xué)工作站，上海辰華儀器有限公司.電化學(xué)測量采用三電極系統(tǒng)：工作電極為玻碳電極(GCE，直徑5 mm);參比電極為飽和甘汞電極(SCE);對電極為鉑電極.UV-2550型紫外可見分光光度計，日本島津公司.NICOLET-6700型紅外光譜儀，美國THERMO FISHER公司.

1.2 實驗過程

1.2.1 RGO-PEI的制備

采用改進(jìn)的Hummers法制備氧化石墨(GO)固體[17].超聲，配成GO水溶液.取20 mL 該溶液，加入1 mL 0.1g/mL 的PEI溶液，95 ℃反應(yīng)2 h.冷卻，離心,在60 ℃下烘干沉淀，配成1 g/L 的RGO-PEI溶液，超聲混合均勻.

1.2.2 RGO-PEI/GCE修飾電極的制備

將GCE在拋光布上分別用1.0、0.3、0.05 μm氧化鋁粉末拋光至鏡面，依次用乙醇和二次蒸餾水各超聲清洗3 min，氮氣吹干.將RGO-PEI溶液超聲15 min,混合均勻，滴涂到GCE表面，室溫晾干，待用，得到RGO-PEI/GCE修飾電極.

1.2.3 OTC分子印跡和非分子印跡薄膜電極的制備

將RGO-PEI/GCE修飾電極浸入含有5.0 mmol/L OPD和1.0 mmol/L OTC模板分子的0.2 mmol/L 醋酸鹽緩沖溶液(pH 4.8)中.采用循環(huán)伏安方法進(jìn)行電聚合，在0～0.8 V的電位區(qū)間內(nèi)掃描 30 圈，掃速為 0.05 V/s.掃描結(jié)束后取出電極，在無水乙醇中浸泡10 min進(jìn)行洗脫，除去分子印跡薄膜中的OTC模板分子,即得到OTC分子印跡聚合物薄膜電極(MIP OPD/RGO-PEI/GCE).

OTC非分子印跡聚合物薄膜電極和OTC分子印跡聚合物薄膜電極的制備過程相同，只是在電聚合時，電聚合溶液中不加入OTC模板分子.

1.2.4 電分析檢測OTC

將MIP OPD/RGO-PEI/GCE置于5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6] / 0.1 mol/L KCl溶液中，采用線性掃描伏安法檢測洗脫掉模板分子OTC后的峰電流(I0)，掃描電壓范圍為- 0.2～0.6 V，掃描速率為0.05 V/s.然后將電極置于不同濃度的OTC磷酸緩沖溶液中吸附10 min，取出電極，用二次蒸餾水淋洗電極，洗掉電極表面上可能吸附的物質(zhì).將電極再次置于5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/0.1 mol/L KCl溶液中進(jìn)行線性掃描，記錄峰電流(I).兩次峰電流的差值ΔI(ΔI=I0-I)和OTC的濃度在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性關(guān)系.

2 結(jié)果與討論

2.1 RGO-PEI的表征

2.1.1 紫外-可見光譜表征

如圖1所示，GO的紫外-可見光譜在230 nm處出現(xiàn)一個較強(qiáng)的吸收峰，這是GO的特征峰.RGO-PEI的吸收峰波長出現(xiàn)在270 nm.躍遷峰紅移，說明PEI成功將GO還原成RGO，氧化石墨烯共軛電子結(jié)構(gòu)得到恢復(fù).

圖1 RGO-PEI、GO的紫外可見光譜吸收曲線

2.1.2 紅外光譜表征

圖2是GO和RGO-PEI紅外光譜圖.GO在1 627.21 cm-1處的峰值對應(yīng)的是COOH的 C===O基團(tuán)的伸縮振動峰.經(jīng)過PEI還原并共價鍵合后，RGO-PEI在1 653.24 cm-1附近的峰值明顯減弱，在2 923.93 cm-1附近出現(xiàn)了PEI分子中的CH2—的一對對稱和反對稱的伸縮振動吸收峰，1653.24 cm-1附近的峰分別對應(yīng)PEI分子中的C—N基團(tuán)和N—H基團(tuán)的伸縮振動吸收峰.表明PEI已經(jīng)成功修飾到了RGO表面.

圖2 GO與RGO-PEI的紅外譜圖對比

2.2 OTC分子印跡薄膜的電聚合過程

圖3(a)為在模板分子OTC存在下，OPD在RGO-PEI/GCE上的電聚合循環(huán)伏安曲線.通過循環(huán)伏安掃描，功能單體OPD在RGO-PEI/GCE表面發(fā)生電聚合，同時裹挾著模板分子OTC沉積在電極表面.OPD的循環(huán)伏安曲線只有氧化峰，由此可見，其電化學(xué)聚合是一個不可逆的過程.隨著掃描的進(jìn)行，峰電流逐漸減弱.30圈后，電流下降到背景值并趨于穩(wěn)定.這表明電極表面形成了低導(dǎo)電性的致密聚合物薄膜，阻止了OPD的進(jìn)一步氧化，使得氧化峰電流受到抑制.圖3(b)為不加入模板分子OTC的OPD電聚合循環(huán)伏安曲線，與圖3(a)相比并無明顯變化.這表明OTC的存在不影響OPD的電聚合過程.

圖3 OPD的電聚合循環(huán)伏安曲線

2.3 OTC分子印跡薄膜的電化學(xué)表征

圖4是不同電極在5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6] /0.1 mol/L KCl溶液中的循環(huán)伏安圖.在裸GCE上有一對明顯的氧化還原峰(曲線a)，峰電流較大.這是由于K3[Fe(CN)6]在電極表面發(fā)生了氧化還原反應(yīng).在RGO-PEI/GCE修飾電極上，K3[Fe(CN)6]的氧化還原峰電流變大了(曲線b).這是由于RGO-PEI具有較好的導(dǎo)電性和高的比表面積.然而，RGO-PEI/GCE修飾電極在OPD溶液中電聚合之后，K3[Fe(CN)6]的氧化還原峰完全消失(曲線c).說明OPD在電極表面聚合生成了低導(dǎo)電性的致密聚合物薄膜，從而阻礙了探針K3[Fe(CN)6]擴(kuò)散到電極表面，進(jìn)而抑制了電子轉(zhuǎn)移.將該電極在乙醇溶液中洗脫之后，曲線d的K3[Fe(CN)6]的峰電流與曲線c的K3[Fe(CN)6]的峰電流相比明顯增大.這表明聚OPD薄膜上的OTC模板去除之后，留下空穴，為探針K3[Fe(CN)6]提供了傳質(zhì)通道，有利于其擴(kuò)散到電極表面發(fā)生電子轉(zhuǎn)移.利用洗脫后的電極吸附一定濃度的OTC溶液，K3[Fe(CN)6]在該電極上的峰電流降低(曲線e)，說明OTC被吸附至電極表面，一部分印跡孔穴被吸附的OTC阻塞，使探針K3[Fe(CN)6]的傳質(zhì)通道減少，所以峰電流下降.

圖4 不同電極在5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]/0.1 mol/L KCl溶液中的循環(huán)伏安圖

2.4 反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.4.1 電聚合圈數(shù)的優(yōu)化

在制備MIP OPD/RGO-PEI/GCE過程中，電聚合掃描圈數(shù)影響著該電化學(xué)傳感器的靈敏度.因此，實驗制備了一系列的電聚合圈數(shù)不同的MIP OPD/RGO-PEI/GCE.如圖5所示，隨著電聚合掃描圈數(shù)的增加，相同濃度OTC引起的K3[Fe(CN)6]的氧化還原峰電流下降.當(dāng)電聚合掃描圈數(shù)達(dá)到30圈時，電流響應(yīng)比值達(dá)到了最低.電聚合掃描圈數(shù)的進(jìn)一步增加會在電極表面得到更厚的聚合物分子印跡膜，使得待測物更難接近印跡點.因此，選擇30圈作為最佳電聚合掃描圈數(shù)來進(jìn)行下面的實驗.

圖5 電聚合圈數(shù)對MIP OPD/RGO-PEI/GCE的影響

2.4.2 pH的優(yōu)化

磷酸鹽緩沖溶液的pH對MIP OPD/RGO-PEI/GCE傳感器檢測OTC具有明顯的影響.為了考察這種影響，傳感器在pH為3.0～9.0的磷酸鹽緩沖溶液配制的OTC溶液中進(jìn)行吸附.如圖6所示，當(dāng)pH從3.0到7.0時，OTC的電流響應(yīng)比率增加；當(dāng)pH由7.0到9.0時，OTC的電流響應(yīng)比率降低.這是由于pH較低時，OTC的NH2和聚OPD的NH2均質(zhì)子化帶正電，導(dǎo)致二者之間存在靜電排斥作用，OTC不易被吸附，所以檢測OTC時的電流響應(yīng)比率較小；當(dāng)pH為7.0時，OTC和聚OPD呈中性，靜電排斥作用下降，使得檢測時出現(xiàn)一個大的電流響應(yīng).因此，選用pH為 7.0的磷酸緩沖溶液作為吸附OTC的介質(zhì).

圖6 pH對MIP OPD/RGO-PEI/GCE的影響

2.4.3 洗脫時間的優(yōu)化

為了獲得較好的靈敏度、選擇性和重現(xiàn)性，從聚OPD膜中脫除模板分子OTC是非常重要的步驟.實驗選用無水乙醇做洗脫液.結(jié)果表明：隨著洗脫時間的增加，對相同濃度OTC的響應(yīng)電流逐漸增大；當(dāng)洗脫時間為10 min時，響應(yīng)電流趨于平穩(wěn).因此，最佳洗脫時間選擇10 min.

2.4.4 吸附時間的優(yōu)化

吸附時間是影響OTC響應(yīng)電流的一個重要的因素.洗脫之后，將電極在固定濃度的OTC溶液中吸附10 min.圖7顯示：K3[Fe(CN)6]峰電流響應(yīng)比率隨著吸附時間的增加而減小，10 min之后趨于平穩(wěn).這表明了分子印跡膜對OTC的快速識別能力.因此，最佳的吸附時間選擇10 min.

圖7 吸附時間對MIP OPD/RGO-PEI/GCE的影響

2.5 傳感器的分析性能

2.5.1 OTC的檢測

在最優(yōu)的實驗條件下，將脫除模板分子的印跡電極放入含有一定濃度的OTC溶液中吸附10 min，取出電極，用二次蒸餾水淋洗干凈，置于5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6] / 0.1 mol/L KCl溶液中進(jìn)行線性伏安掃描，檢測峰電流.由圖8可知：隨著OTC濃度的增大，分子印跡膜中越來越多的印跡空腔被相匹配的OTC占據(jù)，K3[Fe(CN)6]峰電流降低，繼而ΔI增大.將ΔI與OTC濃度作圖，得到測定OTC濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖9).OTC在1.0～100.0 μmol/L范圍內(nèi)與ΔI呈線性關(guān)系，線性方程是ΔI=-9.476 16-0.043 63c，回歸系數(shù)R2是0.995 92，OTC的檢出限是0.33 μmol/L (3σ).

圖8 MIP OPD/RGO-PEI/GCE傳感器在不同濃度OTC溶液中的線性掃描伏安曲線

圖9 MIP OPD/RGO-PEI/GCE傳感器在不同濃度OTC溶液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5.2 傳感器選擇性和重現(xiàn)性

CAP、DHC、CTC和OTC同為四環(huán)素類抗生素，它們的結(jié)構(gòu)中都含有羥基，能與OPD形成氫鍵，故進(jìn)行選擇性實驗.如圖10所示，150 μmol/L 的CAP、DHC、CTC對檢測30 μmol/L 的OTC的影響不大.可見OTC分子印跡傳感器的選擇性良好.在最佳檢測條件下，同一支電極對30 μmol/L 的OTC溶液平行測定10次，電流響應(yīng)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.75 %，表明此傳感器的重現(xiàn)性良好.

a c(OTC)=30 μmol/L

2.5.3 實際樣品分析

為研究此傳感器對實際樣品的分析能力，對湖水進(jìn)行了OTC加標(biāo)回收率實驗.用湖水分別配制5.0 μmol/L和30.0 μmol/L OTC溶液，經(jīng)電極吸附后，置于5.0 mmol/L K3[Fe(CN)6] / 0.1 mol/L KCl溶液中檢測，測定結(jié)果如表1所示.實驗得到的回收率為100.4 %～102.6 %，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2 %～4.4 %，可滿足實際樣品分析的需要.

表1 湖水樣品中OTC的加標(biāo)回收率

3 結(jié) 論

研究采用一步還原法合成了石墨烯-聚乙烯亞胺復(fù)合材料.利用該復(fù)合材料修飾電極，通過原位電聚合OPD獲得了OTC的分子印跡聚合物薄膜，成功構(gòu)建了OTC分子印跡電化學(xué)傳感器.電流信號隨著OTC濃度的增大而增大，在一定范圍內(nèi)電流信號與OTC濃度成線性關(guān)系.石墨烯-聚乙烯亞胺復(fù)合材料為電極提供了較高的比表面積和豐富的氨基，有利于提高檢測靈敏度和分子印跡膜的穩(wěn)定性.相比于其他檢測方法，此傳感器制作簡單、靈敏度高、重現(xiàn)性好，無需復(fù)雜的前處理過程，實現(xiàn)了對湖水樣品中痕量OTC的高靈敏高選擇性檢測，具有一定的應(yīng)用前景.