朱曉鵬， 紀(jì)曉茜， 郭海瑞， 高恩軍， 朱明昌

(沈陽化工大學(xué) 遼寧省無機(jī)分子基化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 遼寧 沈陽 110142)

癌癥被世界衛(wèi)生組織列為世界五大疑難雜癥之一，目前，中國癌癥病發(fā)率、死亡率排名全球第一.臨床藥物順鉑是無機(jī)藥物創(chuàng)新的一個(gè)里程碑式的發(fā)現(xiàn)，被廣泛用于各種癌癥的治療.但由于鉑類藥物有抗藥性、毒副作用等缺陷，限制了其廣泛使用.因此，開發(fā)結(jié)構(gòu)新穎、性能更優(yōu)的無機(jī)抗癌藥物激發(fā)了眾多科研工作者的熱情[1].針對不同目標(biāo)采用不同金屬，合成安全、可靠、有效和生物相容性的其他金屬配合物已成為結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)、藥物治療和臨床應(yīng)用領(lǐng)域中的發(fā)展策略，N-雜環(huán)羧酸類配合物因其獨(dú)特功能性，在藥物化學(xué)中引起了人們的極大關(guān)注[2].

銅是人體的內(nèi)源金屬，相應(yīng)的銅配合物被證實(shí)具有不尋常的電子行為和各種化學(xué)反應(yīng)性，能夠與DNA相互作用，并表現(xiàn)出較好的生物氧化還原活性和對核堿基相對較強(qiáng)的親和力[3-5].據(jù)報(bào)道，某些銅配合物能夠產(chǎn)生大量對線粒體和生物大分子造成氧化損傷的活性氧(ROS)，在無機(jī)抗腫瘤領(lǐng)域顯示出巨大的潛力.本文合成了一種新的Cu配合物CuL2(H2O)4，初步探討其對DNA的作用方式及對HeLa癌細(xì)胞的作用效果.使用X-射線晶體衍射技術(shù)對配合物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，熒光光譜法和凝膠電泳法測定其與DNA作用的方式，熒光顯微術(shù)測試配合物對HeLa細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

4-吡啶甲酸(HL)、三水合硝酸銅(Ⅱ)、PBR322質(zhì)粒DNA與魚精DNA(FS-DNA)均是商業(yè)來源，無特殊說明的試劑均為AR級產(chǎn)品.

MCO-18AC型二氧化碳培養(yǎng)箱用于HeLa癌細(xì)胞(人體宮頸癌細(xì)胞)培養(yǎng)；使用Finnigan EA1112型元素分析儀進(jìn)行碳、氫、氮的元素分析；使用卡爾蔡司公司制造的XD-RFL熒光倒置顯微鏡進(jìn)行熒光成像處理；采用Perkin Elmer 公司制造的LS 55型熒光分光光度計(jì)檢測與魚精DNA的鍵合作用.

1.2 配合物的制備

準(zhǔn)確稱取0.060 0 g Cu(NO3)2·3H2O和0.020 0 g 4-吡啶甲酸，加入12 mLV(DMF)∶V(H2O)=2∶1的溶劑，在40 ℃水浴條件下攪拌反應(yīng)2 h，調(diào)節(jié)pH=6后轉(zhuǎn)入15 mL聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，90 ℃加熱反應(yīng)72 h并緩慢冷卻至室溫靜置24 h.用無水乙醇多次洗滌得到混合物并在空氣中干燥，獲得適用于X-射線單晶衍射測量的藍(lán)色塊狀晶體.經(jīng)元素分析測得[理論值(實(shí)測值)，w/%]:C,37.75(37.71)；H,4.75(4.80)；N,7.34(7.39).

1.3 熒光光譜法的測定

溴化乙錠(EtBr)是最強(qiáng)烈的熒光探針之一[6].EtBr是由芳香環(huán)組成的共軛平面型分子，其本身的熒光強(qiáng)度非常微弱，但EtBr與無熒光的DNA分子相結(jié)合時(shí)熒光強(qiáng)度會有顯著增強(qiáng)，當(dāng)EtBr從DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中脫離后熒光強(qiáng)度又會明顯下降[7].基于此熒光現(xiàn)象,實(shí)驗(yàn)研究了配合物CuL2(H2O)4和EtBr在DNA分子中的置換.通過DNA-EtBr的熒光猝滅程度，即配合物與DNA的親和力強(qiáng)度監(jiān)測配合物與魚精DNA的鍵合作用.根據(jù)經(jīng)典Stern-Volmer方程I0/I=1+Ksqr描述配合物與DNA的作用強(qiáng)弱.式中：I0、I分別表示配合物CuL2(H2O)4不存在和存在狀態(tài)下的熒光強(qiáng)度；Ksq是線性Stern-Volmer猝滅常數(shù)，該常數(shù)取決于EtBr的結(jié)合濃度與DNA濃度的比值；r是配合物與DNA的濃度比值.

1.4 瓊脂凝膠電泳的測定

瓊脂糖凝膠內(nèi)部孔徑較大，因此常用于生物大分子的分離實(shí)驗(yàn).以PBR質(zhì)粒DNA為靶分子，根據(jù)產(chǎn)生DNA形態(tài)不同導(dǎo)致在電泳中涌動(dòng)速度不同，以此檢測配合物對DNA的切割能力[8-9].眾所周知，應(yīng)用凝膠電泳監(jiān)測切割質(zhì)粒DNA時(shí)主要有3種表現(xiàn)形式：如果質(zhì)粒DNA沒有被切割，將看到FormⅠ的超螺旋形式有最快的遷移；如果質(zhì)粒DNA的一條鏈被切割，則超螺旋結(jié)構(gòu)將會松弛以產(chǎn)生較慢移動(dòng)的帶切口的圓形形式Form Ⅱ；如果DNA的兩條雙螺旋鏈均被切割則會產(chǎn)生中間速率的Form Ⅲ遷移形式[10].凝膠電泳實(shí)驗(yàn)使用pH=7.2的Tris緩沖溶液(50.0 mmol/L的Tris乙酸鹽，18.0 mmol/L的NaCl緩沖液)和1.5 g瓊脂糖制備凝膠，然后用1.0 μL EtBr染色.設(shè)置好空白對照組開始加樣，在80 V下電泳2 h，置于凝膠圖像分析儀中進(jìn)行拍照，去除背景光.

1.5 熒光倒置顯微鏡對HeLa細(xì)胞的凋亡測定

細(xì)胞凋亡主要表現(xiàn)為細(xì)胞膜的破裂和細(xì)胞核的收縮，凋亡的細(xì)胞裂解成凋亡小體后，染色質(zhì)會冷凝并且伴隨DNA的核苷酸鏈斷裂，凋亡小體會被專職或者非專職吞噬細(xì)胞吞噬[11-12].目前，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡已經(jīng)成為評價(jià)抗癌藥物的重要指標(biāo).本實(shí)驗(yàn)通過配合物和HeLa細(xì)胞在37 ℃下孵育12 h，通過PI和FITC染色劑染色，設(shè)置波長為560 nm，在40倍鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化并用熒光顯微鏡成像.

2 結(jié)果與討論

2.1 配位化合物CuL2(H2O)4的結(jié)構(gòu)與分析

通過X-射線單晶衍射儀對晶體的掃描得出晶體數(shù)據(jù)及配合物的結(jié)構(gòu)模型(圖1)，顯示配合物為三斜晶系，空間群為P1，a=0.634 39(11) nm、b=0.689 87(12) nm、c=0.918 38(15) nm、α=99.428(2)°、β=105.241(2)°、γ=108.208(3)°，單晶體積為0.354 86(10) nm3.

由圖1可知:中心金屬Cu的配位數(shù)為6，其中金屬銅(Ⅱ)與2個(gè)4-吡啶甲酸的氮原子相連，且和4個(gè)水分子中的氧相連.2個(gè)吡啶環(huán)彼此平行，2個(gè)氮原子和銅原子牢牢相連使之無法扭曲從而形成一個(gè)平面，形成了一個(gè)完全對稱的配合物.Cu—O(3)鍵長為1.976 nm，Cu—O(5)鍵長為1.999 nm，Cu—O(6)鍵長為2.457 nm，Cu—N(1)鍵長為2.023 nm，Cu—N(4)鍵長為1.983 nm， O(3)—Cu—N(4)鍵角為91.0°，O(3)—Cu—O(5)鍵角為178.9°，N(4)—Cu—O(5)鍵角為90.0°，O(3)—Cu—N(1)鍵角為89.8°，N(4)—Cu—N(1)鍵角為178.4°，O(5)—Cu—N(1)鍵角為89.2°.

圖1 Cu配合物的結(jié)構(gòu)

2.2 熒光光譜分析

以526 nm為熒光光譜的激發(fā)波長，測得DNA-EtBr復(fù)合物體系[c(DNA)=5×105mol/L,c(EtBr)=2.54×10-4mol/L]與不同濃度的配合物CuL2(H2O)4作用的發(fā)射譜圖(其中熒光發(fā)射峰為618 nm)如圖2所示.

1 c(配合物)=0.00 mol/L 2 c(配合物)=0.50 mol/L 3 c(配合物)=1.00 mol/L 4 c(配合物)=1.50 mol/L 5 c(配合物)=2.00 mol/L 6 c(配合物)=2.50 mol/L 7 c(配合物)=3.00 mol/L

由圖2曲線的變化可知：使用溴化乙錠處理DNA得到DNA-EtBr復(fù)合物后，隨著加入配合物CuL2(H2O)4的濃度加大，DNA-EtBr復(fù)合物體系熒光猝滅程度越來越明顯，加入配合物CuL2(H2O)4達(dá)到3.00 mol/L時(shí)，熒光猝滅程度達(dá)到最大，熒光猝滅現(xiàn)象的發(fā)生說明配合物CuL2(H2O)4與魚精DNA發(fā)生了鍵合作用.

根據(jù)Stern-Volmer方程I0/I=1+Ksqr計(jì)算作圖，如圖3所示，配合物的Ksq值為0.061.數(shù)據(jù)結(jié)果表明配合物CuL2(H2O)4與EtBr發(fā)生了競爭作用，使DNA-EtBr體系的熒光強(qiáng)度得以猝滅.

圖3 配合物Stern-Volmer猝滅曲線

2.3 瓊脂凝膠電泳實(shí)驗(yàn)

電泳2 h后，置于凝膠圖像分析儀中拍照，去除背景光后得到如圖4所示圖像.

圖4 配合物切割PBR322 DNA

從圖4可以看到：質(zhì)粒DNA可被銅配合物有效切割，將FormⅠ超螺旋DNA降解為FormⅡ開環(huán)DNA及較少的FormⅢ線性DNA，其中0為空白組，1、2、3道為添加5.5 μmol/L、2.75 μmol/L、1.375 μmol/L濃度梯度呈下降的銅配合物.隨著配合物濃度的降低其切割DNA的活性呈下降趨勢，這一規(guī)律與熒光光譜法測量所得到的結(jié)果相一致.

2.4 熒光顯微分析

細(xì)胞凋亡是常見的基因控制過程.細(xì)胞凋亡成像技術(shù)通過細(xì)胞形態(tài)的變化觀測凋亡情況，圖像的方法可直觀地研究細(xì)胞形態(tài)學(xué).經(jīng)過配合物作用HeLa細(xì)胞12 h后，用FITC和PI染色.使用熒光倒置顯微鏡對HeLa細(xì)胞進(jìn)行觀測，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核質(zhì)發(fā)生明顯濃縮，核膜發(fā)生破損，這些結(jié)果表明配合物可有效誘導(dǎo)HeLa癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，如圖5所示.

圖5 配合物誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡效果

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)制備了一種新的過渡金屬配合物CuL2(H2O)4，并對其性質(zhì)進(jìn)行了表征.X-射線單晶衍射對配合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析；熒光光譜分析說明配合物與DNA發(fā)生了鍵合作用；瓊脂凝膠電泳實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了該配合物與DNA有較強(qiáng)的切割活性；熒光顯微鏡分析則顯示了該配合物可有效誘導(dǎo)HeLa癌細(xì)胞的凋亡，產(chǎn)生抗腫瘤效果.一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明配合物CuL2(H2O)4具有較好的生物學(xué)性質(zhì)，可用于進(jìn)一步研究，是一種有前景的抗腫瘤功能分子材料.