袁濤，江航，陳正權(quán)，文坤明

遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院胃腸外科，貴州遵義 563003

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率在惡性腫瘤中居第3位，病死率居第2位[1]。手術(shù)切除和放化療是CRC的主要治療方式[2]，然而，即使實(shí)施了標(biāo)準(zhǔn)的根治手術(shù)及放化療，CRC患者的5年總生存率(約65%)仍未見明顯改善，腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是其治療失敗的主要原因[3]。研究發(fā)現(xiàn)，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transitions，EMT)與多種惡性腫瘤(包括CRC)的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、耐藥等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)，最終導(dǎo)致治療失敗[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，hnRNPAB在CRC組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，且hnRNPAB高表達(dá)與CRC分期和患者預(yù)后不良密切相關(guān)[5]。hnRNPAB對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT過程的調(diào)控作用研究較少。本研究旨在探討過表達(dá)hnRNPAB基因?qū)θ私Y(jié)直腸癌SW480、HT29細(xì)胞EMT的影響及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、L-15培養(yǎng)基(培養(yǎng)SW480細(xì)胞)、5A培養(yǎng)基(培養(yǎng)HT29細(xì)胞)購自美國HyClone公司；2.5%胰酶購自北京索萊寶科技有限公司；RNA提取試劑盒、PrimeScript RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；Transwell小室購自美國Corning公司；細(xì)胞全蛋白提取試劑盒和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；鼠抗人E-cadherin、N-cadherin、波形蛋白、WNT3A、WNT5A、β-catenin、GAPDH和β-tubulin一抗以及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗購自美國Proteintech公司。過表達(dá)hnRNPAB的慢病毒(hnRNPAB-GFP-PURO)及陰性對(duì)照病毒(NC-GFPPURO)由上海漢恒生物科技有限公司構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 人結(jié)直腸癌SW480、HT29細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫。分別用hnRNPAB-GFPPURO和NC-GFP-PURO轉(zhuǎn)染SW480、HT29細(xì)胞，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組(SW480-hnRNPAB、HT29-hnRNPAB)與對(duì)照組(SW480-NC、HT29-NC)。轉(zhuǎn)染步驟：將細(xì)胞于含10% FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時(shí)進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染前1 d，用0.25%胰酶消化細(xì)胞并接種于24孔板中(1×105個(gè)/孔)；采用陰性對(duì)照病毒確定兩種細(xì)胞的轉(zhuǎn)染條件及感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection，MOI)值，根據(jù)MOI值計(jì)算每孔所需病毒量[病毒體積=(MOI×細(xì)胞數(shù)目)/病毒滴度，病毒滴度=2×108TU/ml]，每孔加入

2.5 μl 聚凝胺(polybrene，2 mg/ml)，然后加入培養(yǎng)基補(bǔ)充體積至500 μl/孔，48 h后更換新鮮培養(yǎng)基，72 h后倒置顯微鏡下觀察熒光并拍照，收集細(xì)胞并采用RT-qPCR和Western blotting鑒定轉(zhuǎn)染病毒后hnRNPAB過表達(dá)的效果。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)hnRNPAB mRNA的表達(dá)水平

收集細(xì)胞，使用Trizol試劑提取總RNA，并測(cè)定總RNA濃度。取0.8 μg總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照PrimeScript RT reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟操作。采用SYBR Green染料法行實(shí)時(shí)PCR，總反應(yīng)體積為20 μl。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，90 ℃15 s。設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法確定目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequences used for RT-qPCR

1.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將細(xì)胞接種于24孔板中(3×105個(gè)/孔)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿孔板后，用1 ml注射器針頭沿孔板中軸垂直劃線，用PBS清洗3次去除脫落細(xì)胞，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，顯微鏡下觀察0 h、24 h后細(xì)胞遷移情況并拍照，用Image pro軟件測(cè)量后計(jì)算劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(0 h的劃痕距離－24 h的劃痕距離)/0 h的劃痕距離×100%。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞12 h使其處于饑餓狀態(tài)，然后取1×105個(gè)細(xì)胞，離心去上清，用250 μl無血清培養(yǎng)基重懸后接種于Transwell小室上室中，將Transwell小室放入24孔板(下室)中，下室中加入600 μl含10%FBS的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后取出Transwell小室，用0.1%結(jié)晶紫染色，隨機(jī)選取5個(gè)視野，顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.2.5 Western blotting檢測(cè)hnRNPAB、E-cadherin、N-cadherin、波形蛋白、WNT3A、WNT5A及β-catenin蛋白的表達(dá)水平 收集細(xì)胞，按照全蛋白提取試劑盒說明書步驟提取總蛋白并測(cè)定濃度；取40 μg總蛋白，根據(jù)目的蛋白分子量在相應(yīng)濃度的凝膠上進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上；加入5%脫脂奶粉，室溫封閉1 h，加入鼠抗人E-cadherin、N-cadherin、波形蛋白、WNT3A、WNT5A、β-catenin、GAPDH和β-tubulin一抗(1:2000)4 ℃孵育過夜；次日以TBST洗膜3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG二抗(1:10 000)室溫孵育1 h；TBST洗膜3次，置于ECL發(fā)光液中2 min后，用X線膠片曝光顯現(xiàn)蛋白質(zhì)條帶，掃描膠片后所得條帶用Quantity-One軟件進(jìn)行分析。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白的灰度值/內(nèi)參GAPDH蛋白條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0及GraphPad prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和制圖。所有數(shù)據(jù)以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 慢病毒轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌SW480、HT29細(xì)胞的效果 結(jié)直腸癌SW480、HT29細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染hnRNPAB-GFP-PURO和NC-GFP-PURO，72 h后，熒光倒置相差顯微鏡下可見綠色熒光(圖1)，表明病毒轉(zhuǎn)染成功。

圖1 結(jié)直腸癌SW480、HT29細(xì)胞轉(zhuǎn)染病毒72 h后的效果(×100)Fig.1 Effects of colorectal cancer SW480 and HT29 cells transfected with virus for 72 hours (×100)

2.2 結(jié)直腸癌SW480、HT29細(xì)胞轉(zhuǎn)染病毒后hnRNPAB過表達(dá)效果鑒定 RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組hnRNPAB mRNA表達(dá)水平分別提高了2.1倍(SW480：3.10±0.26vs.1.00±0.18，P＜0.01)和1.7倍(HT29：2.70±0.21vs.1.00±0.12，P＜0.01)。

Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組結(jié)直腸癌細(xì)胞中hnRNPAB蛋白表達(dá)水平明顯升高(SW480：1.02±0.06vs. 0.67±0.05，P＜0.01；HT29：1.07±0.04vs. 0.58±0.03，P＜0.01，圖2)，表明hnRNPAB在SW480和HT29細(xì)胞中被成功過表達(dá)。

圖2 Western blotting檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞中hnRNPAB蛋白表達(dá)水平Fig.2 hnRNPAB protein levels in colorectal cancer cells detected by Western blotting

2.3 hnRNPAB過表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移能力的影響 劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組劃痕愈合率明顯增高(SW480：19.6%±0.90%vs.2.23%±0.80%，P＜0.01；HT29：40.30%±0.70%vs.6.40%±0.06%，P＜0.01，圖3)。

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移能力Fig.3 The ability of migration of colorectal cancer cells detected by scratch test

2.4 hnRNPAB過表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯增多[SW480：(315.0±6.7)個(gè)vs. (62.0±4.3)個(gè)，P＜0.01；HT29：(289.0±7.2)個(gè)vs. (54.0±5.2)個(gè)，P＜0.01，圖4]。

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲能力(×100)Fig.4 The ability of invasion of colorectal cancer cells detected by Transwell assay (×100)

2.5 hnRNPAB過表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin及波形蛋白mRNA和蛋白表達(dá)的影響RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組(SW480-NC、HT29-NC)相比，實(shí)驗(yàn)組(SW480-hnRNPAB、HT29-hnRNPAB)結(jié)直腸癌細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin mRNA表達(dá)水平明顯降低(P＜0.01)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin和波形蛋白mRNA表達(dá)水平在SW480細(xì)胞中分別提高了1.1倍和1.5倍，在HT29細(xì)胞中則分別提高了0.9倍和1.7倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，表2)。

表2 結(jié)直腸癌細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和波形蛋白mRNA和蛋白表達(dá)情況(±s)Tab.2 The mRNA and protein levels of E-cadherin, N-cadherin and vimentin in colorectal cancer cells (±s)

表2 結(jié)直腸癌細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和波形蛋白mRNA和蛋白表達(dá)情況(±s)Tab.2 The mRNA and protein levels of E-cadherin, N-cadherin and vimentin in colorectal cancer cells (±s)

與SW480-NC比較，(1)P＜0.01；與HT29-NC比較，(2)P＜0.01。

組別 E-cadherin N-cadherin 波形蛋白mRNA 蛋白 mRNA 蛋白 mRNA 蛋白SW480-NC 1.02±0.07 0.67±0.04 1.00±0.06 0.61±0.02 1.03±0.05 0.59±0.02 SW480-hnRNPAB 0.65±0.04(1) 0.50±0.02(1) 2.13±0.08(1) 0.91±0.03(1) 2.45±0.04(1) 0.88±0.02(1)HT29-NC 1.01±0.05 0.61±0.03 1.07±0.07 0.59±0.04 1.03±0.04 0.62±0.03 HT29-hnRNPAB 0.58±0.07(2) 0.47±0.05(2) 1.92±0.09(2) 0.95±0.04(2) 2.69±0.11(2) 0.92±0.05(2)

Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組(SW480-NC、HT29-NC)相比，實(shí)驗(yàn)組(SW480-hnRNPAB、HT29-hnRNPAB)結(jié)直腸癌細(xì)胞中上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)水平明顯降低，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin蛋白和波形蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，表2、圖5)。

圖5 Western blotting檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和波形蛋白表達(dá)水平Fig.5 The expression levels of E-cadherin, N-cadherin and vimentin in colorectal cancer cells detected by Western blotting

2.6 hnRNPAB過表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞中WNT3A、WNT5A和β-catenin蛋白表達(dá)的影響 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組結(jié)直腸癌細(xì)胞中WNT3A(SW480：0.87±0.04vs. 0.47±0.03，P＜0.01；HT29：0.91±0.03vs.0.52±0.04，P＜0.01)、WNT5A(SW480：0.92±0.05vs. 0.53±0.04，P＜0.01；HT29：0.96±0.06vs.0.62±0.05，P＜0.01)及β-catenin(SW480：1.02±0.03vs. 0.58±0.02，P＜0.01；HT29：1.08±0.04vs.0.59±0.03，P＜0.01)蛋白表達(dá)水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖6)。

圖6 Western blotting檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞中WNT3A、WNT5A和β-catenin蛋白表達(dá)水平Fig.6 The protein levels of WNT3A, WNT5A and β-catenin in colorectal cancer cells detected by Western blotting

3 討 論

結(jié)直腸癌是發(fā)病率和病死率均較高的惡性腫瘤，腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是其治療失敗的主要原因[6]。研究發(fā)現(xiàn)，EMT可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲能力，最終導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[7]。目前EMT的啟動(dòng)機(jī)制仍不清楚，亟需進(jìn)一步深入研究，以為結(jié)直腸癌的治療提供新的靶點(diǎn)及切入點(diǎn)。hnRNPAB屬于hnRNPs家族，是一類與mRNA生物學(xué)功能密切相關(guān)的RNA結(jié)合蛋白，參與核酸代謝的多個(gè)方面，包括RNA剪接、維持端粒酶活性、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)以及轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控等[8-10]。hnRNPAB包括4種亞型：hnRNPA1、hnRNPA2/B1(又稱hnRNPA2或hnRNPB1)、hnRNPA3和hnRNPA0[8]。目前研究發(fā)現(xiàn)，hnRNPAB及其亞型與多種惡性腫瘤的惡性生物學(xué)行為，如增殖、抗細(xì)胞凋亡和預(yù)后不良密切相關(guān)[11-13]，且能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞的EMT過程[14-16]。但hnRNPAB是否參與結(jié)直腸癌細(xì)胞EMT過程的調(diào)控，目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

EMT是一種復(fù)雜的分子及細(xì)胞程序，在胚胎形態(tài)發(fā)生、組織纖維化、傷口愈合和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中起著重要作用[17]。當(dāng)EMT被激活時(shí)，上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)受到抑制，細(xì)胞因此失去極性和細(xì)胞間的黏附能力，并表達(dá)與間質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)相關(guān)的標(biāo)志物，如N-cadherin、波形蛋白等，從而導(dǎo)致上皮特征的逐漸喪失并伴隨著間質(zhì)特征的獲得[18]，使細(xì)胞獲得了運(yùn)動(dòng)和侵襲能力，從其原發(fā)部位擴(kuò)散并在遠(yuǎn)處形成繼發(fā)性腫瘤[19]。為了明確hnRNPAB是否能夠誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT，本研究采用過表達(dá)hnRNPAB的慢病毒和陰性對(duì)照病毒轉(zhuǎn)染SW480、HT29細(xì)胞，轉(zhuǎn)染72 h后通過RT-qPCR和Western blotting檢測(cè)hnRNPAB mRNA及蛋白的表達(dá)以驗(yàn)證hnRNPAB過表達(dá)的效果，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組(SW480-hnRNPAB、HT29-hnRNPAB)hnRNPAB mRNA及蛋白的表達(dá)水平均較對(duì)照組(SW480-NC、HT29-NC)明顯升高，表明hnRNPAB在SW480和HT29細(xì)胞中被成功過表達(dá)。本研究結(jié)果還顯示，實(shí)驗(yàn)組劃痕愈合率明顯高于對(duì)照組，穿膜細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組，表明過表達(dá)hnRNPAB基因增強(qiáng)了SW480和HT29細(xì)胞的遷移和侵襲能力。進(jìn)一步通過RT-qPCR和Western blotting檢測(cè)EMT標(biāo)志物mRNA和蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin和波形蛋白mRNA和蛋白表達(dá)明顯增高，表明過表達(dá)hnRNPAB基因誘導(dǎo)SW480和HT29細(xì)胞發(fā)生了EMT，從而增強(qiáng)了細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

目前研究發(fā)現(xiàn)，hnRNPAB及其亞型可調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白的表達(dá)：Stockley等[20]采用RNA干擾敲減前列腺癌細(xì)胞hnRNPAB亞型hnRNPA2(hnRNPA2/B1)的表達(dá)后，細(xì)胞的增殖及克隆形成能力明顯減弱，而過表達(dá)hnRNPA2則促進(jìn)了前列腺癌細(xì)胞的增殖，其機(jī)制與hnRNPA2促進(jìn)CTNNB1(編碼β-catenin蛋白)mRNA及蛋白的表達(dá)有關(guān)；Meng等[21]發(fā)現(xiàn)，hnRNPAB亞型hnRNPA1可促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)向軟骨分化，其機(jī)制與促進(jìn)Wnt信號(hào)通路中WNT3A、WNT5A及β-catenin蛋白的表達(dá)有關(guān)。有研究證實(shí)，Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活與CRC的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[22-23]。本研究采用Western blotting檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞中WNT3A、WNT5A和β-catenin蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組WNT3A、WNT5A和β-catenin蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組升高，提示過表達(dá)hnRNPAB基因可導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，過表達(dá)hnRNPAB基因可誘導(dǎo)結(jié)直腸癌SW480和HT29細(xì)胞發(fā)生EMT，增強(qiáng)其遷移和侵襲能力，其機(jī)制可能與激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。該結(jié)果為hnRNPAB在臨床上用于結(jié)直腸癌的分子靶向治療提供了理論依據(jù)。但本研究?jī)H在體外細(xì)胞水平證實(shí)了hnRNPAB對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，而體內(nèi)功能驗(yàn)證及其EMT與Wnt/β-catenin信號(hào)通路之間的具體調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。