馮英楠 陳菲 王曉萌 王海征 林曉蘭

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的一類(lèi)腫瘤，約占顱內(nèi)所有腫瘤的35.26%～60.9%[1]。膠質(zhì)瘤具有侵襲性生長(zhǎng)、惡性程度高等特點(diǎn)。目前，治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤主要采取手術(shù)為主，輔助放療、化療等方法，但是膠質(zhì)瘤生存期短，死亡率高，對(duì)人類(lèi)健康威脅極大。中藥因其較好的安全性和有效性在腫瘤的治療中發(fā)揮積極作用，抗瘤丸是適用于腦膠質(zhì)瘤、腦垂體瘤的輔助治療的院內(nèi)制劑，臨床應(yīng)用近30年，服用的患者累計(jì)10萬(wàn)余人次，于2012年獲得國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利(專(zhuān)利號(hào)：ZL 2010 1 0234220.2)。

課題組前期研究也證實(shí)，抗瘤丸的抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞作用可能與誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡相關(guān)[2-3]，提示對(duì)治療膠質(zhì)瘤有良好的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用前景?？沽鐾鑳?yōu)化方-4是抗瘤丸的優(yōu)化處方之一，基于前期優(yōu)化處方研究[4-5]發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)的抗瘤丸優(yōu)化方-4抑瘤效果較好，故本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)抗瘤丸優(yōu)化方-4進(jìn)行研究?？沽鐾鑳?yōu)化方-4是在原方的基礎(chǔ)上，通過(guò)中醫(yī)藥專(zhuān)家論證，減少了6味佐使藥。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察對(duì)相關(guān)指標(biāo)表達(dá)的影響，進(jìn)一步闡明抗瘤丸優(yōu)化方-4治療膠質(zhì)瘤的作用機(jī)制，為抗瘤丸處方優(yōu)化提供數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)抗瘤丸提供相關(guān)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物與細(xì)胞

SPF級(jí)健康雄性BALB/c裸鼠，雄性，體質(zhì)量17～19 g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2012-0001；人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞(株)，購(gòu)于中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心(ATCC，CCL-107)。

1.2 藥物

抗瘤丸是由白花蛇舌草、半枝蓮、白英等18味中藥組成的院內(nèi)復(fù)方制劑?？沽鐾鑳?yōu)化方-4是抗瘤丸的優(yōu)化處方，由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥劑科提供。陽(yáng)性對(duì)照藥替莫唑胺(批號(hào)：H20080313)，購(gòu)于美國(guó)先靈葆雅制藥公司。

1.3 試劑及儀器

胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(批號(hào)：20120517)，購(gòu)于天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；DMEM培養(yǎng)基(高糖)(批號(hào)：1177237)、胰蛋白酶(批號(hào)：0458)、無(wú)鈣、鎂磷酸鹽緩沖液(10×PBS，PH 7.2-7.4)(批號(hào)：20120815)，均購(gòu)于北京諾博萊德科技有限公司；注射用青霉素鈉(批號(hào)：Y0302215)、注射用硫酸鏈霉素(批號(hào)：030103)，購(gòu)于華北制藥股份有限公司；CD34抗體、兔抗人原始造血細(xì)胞單克隆抗體(批號(hào)：12620110)，購(gòu)于北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司；VEGF抗體、rabbit IgG(批號(hào)：10CM199)，購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；二抗、(H+L)/HRP辣根酶標(biāo)記山羊抗兔(批號(hào)：K126816A)、DAB濃縮顯色液、A液和B液(批號(hào)：ZLI-9018)、原位末端標(biāo)記(TdT-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)：12469600)，均購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

6500型CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)NAPCO)，TE2101L型電子天平(德國(guó)賽多利斯)，倒置顯微鏡(日本OLYMPUS)，DM3000顯微鏡(德國(guó)Leica)。

1.4 人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的培養(yǎng)方法

U87細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)基2～3天更換一次，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至70%～80%融合時(shí)進(jìn)行傳代，用0.25%胰蛋白酶消化液進(jìn)行消化傳代，將培養(yǎng)基倒掉，用PBS洗兩遍，加消化液室溫下消化，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞開(kāi)始變圓，細(xì)胞間隙變大時(shí)，加入10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，用吸管輕輕吹打瓶底和瓶壁，按1瓶傳3瓶的比例接種，3到4天傳代一次。

1.5 模型制備

將U87細(xì)胞(5×107個(gè)細(xì)胞/只)接種到裸鼠(2只)右側(cè)腋窩、20天瘤塊長(zhǎng)至2 cm(直徑)，無(wú)菌剝離腫瘤成2 mm×2 mm×2 mm，用套管針將瘤塊移植至裸鼠(10只)右側(cè)腋窩，用火棉膠將切口粘住。17～19天再次長(zhǎng)至2 cm(直徑)，無(wú)菌剝離腫瘤成1 mm×1 mm×1 mm，再次移植裸鼠右側(cè)腋窩，用火棉膠將切口粘住。

1.6 分組與給藥

待動(dòng)物體內(nèi)瘤塊長(zhǎng)至80～180 mm3時(shí)，將裸鼠按瘤塊大小和體質(zhì)量采用分層隨機(jī)抽樣方法分為：模型組、陽(yáng)性藥(替莫唑胺)對(duì)照組、抗瘤丸優(yōu)化方-4高、中、低劑量組，每組12只?？沽鐾鑳?yōu)化方-4高、中、低劑量組藥物濃度分別為3.4 g、1.7 g、0.85 g生藥/kg，替莫唑胺膠囊藥物濃度為43 mg/kg。各藥物組按25 mL/kg灌胃給藥，模型組給予等體積去離子水，每天1次，連續(xù)給藥20天。

1.7 指標(biāo)檢測(cè)

給藥20天后處死裸鼠，取各組裸鼠的瘤塊，CD34免疫組化法染色，Weidner法計(jì)數(shù)微血管密度(microvascular density，MVD)；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)免疫組化法染色，圖像分析測(cè)定灰度值。TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞，計(jì)算腫瘤細(xì)胞凋亡率。

1.7.1 MVD檢測(cè) 取出經(jīng)10%福爾馬林固定，每組隨機(jī)取3個(gè)瘤塊，常規(guī)石蠟包埋、切片(每個(gè)腫塊切3張片子：第1切片取腫瘤最外側(cè)邊緣，第2切片取腫瘤正中，第3切片取前兩切片中間位置，厚度為4 μm)。CD34：(1)切片在65℃烤箱中烤片2小時(shí)，常規(guī)脫蠟至水后PBS緩沖液洗2分鐘×5次；(2)3% H2O2室溫下孵育10分鐘，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS緩沖液洗2分鐘×5次；(3)0.01M檸檬酸緩沖液(PH=6.2)中進(jìn)行抗原熱修復(fù)，高壓鍋中高溫高壓修復(fù)2小時(shí)，自然冷卻后PBS緩沖液洗2分鐘×5次；(4)室溫下5%山羊血清封閉非特異性背景10分鐘，PBS緩沖液洗2分鐘×5次；(5)分別加CD34一抗(抗體用PBS稀釋?zhuān)♂尡稊?shù)1∶100)和VEGF一抗(抗體用PBS稀釋?zhuān)♂尡稊?shù)1∶20)，4℃孵育過(guò)夜，PBS緩沖液洗2分鐘×5次；(6)物素化羊抗兔IgG(二抗)，37℃孵育30分鐘，PBS緩沖液洗2分鐘×5次；(7)DAB顯色3～5分鐘，蘇木精復(fù)染2分鐘，清水沖洗干凈，鹽酸酒精快速分化，清水返藍(lán)5分鐘，逐級(jí)梯度酒精脫水、二甲苯透明，樹(shù)脂封片。

MVD計(jì)數(shù)參照Weidner法如下：先在100倍下觀察整個(gè)切片，每張切片找出3個(gè)微血管密集區(qū)，血管內(nèi)皮細(xì)胞被染成棕色，然后在200倍鏡下計(jì)數(shù)被CD34染色的微血管數(shù)目。微血管判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：與鄰近的微血管、腫瘤細(xì)胞及其它結(jié)締組織成份不相連的、標(biāo)記清晰的內(nèi)皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞簇均可作為一個(gè)可計(jì)數(shù)的微血管。同一微血管的內(nèi)皮細(xì)胞，如染色清晰且相互分離，也可作為單獨(dú)的微血管計(jì)數(shù)。血管腔及腔內(nèi)紅細(xì)胞的存在不是確認(rèn)微血管的必備條件，對(duì)管腔直徑大于8個(gè)紅細(xì)胞或管壁有平滑肌存在的血管不進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7.2 VEGF灰度值檢測(cè) VEGF免疫組化染色程序同CD34，每組選9張切片，用Leica DM顯微鏡在同一條件下觀察，每張切片上隨機(jī)選3個(gè)視野，通過(guò)Leica CAMER圖像采集系統(tǒng)(Lecia Qwin V3)采集圖像，分析測(cè)定每個(gè)視野內(nèi)30個(gè)免疫陽(yáng)性反應(yīng)的灰度值。VEGF陽(yáng)性判定如下：VEGF為細(xì)胞漿著色，染色陽(yáng)性以細(xì)胞漿呈棕色顆粒狀為標(biāo)準(zhǔn)，且著色明顯高于背景?；叶确譃?～256級(jí)，反映不同的免疫陽(yáng)性反應(yīng)著色強(qiáng)弱。測(cè)量所得灰度值越小，陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng)。

1.7.3 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 取材、包埋、切片同CD34和VEGF，石蠟包埋切片后采用TdT介導(dǎo)的TUNEL法檢測(cè)凋亡細(xì)胞，具體操作按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。具體步驟如下：(1)切片常規(guī)脫蠟，二甲苯浸洗5分鐘×2次，梯度乙醇浸洗3分鐘×1次；(2)PBS漂洗2次，用proteinase K工作液處理組織15～30分鐘；(3)PBS漂洗2次，加入制備TUNEL反應(yīng)混合液(處理組用50 μL TdT+450 μL熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻，模型組僅加50 μL熒光素標(biāo)記的dUTP液，陽(yáng)性對(duì)照組先加入100 μL DNase I，反應(yīng)10分鐘，后面步驟同處理組；(4)加50 μL TUNEL反應(yīng)混合液(模型組僅加50 μL熒光素標(biāo)記的dUTP液)于標(biāo)本上，加蓋玻片在暗濕盒中37℃反應(yīng)1小時(shí)；(5)PBS漂洗3次，加50 μL converter-POD于標(biāo)本上，加蓋玻片在暗濕盒中37℃反應(yīng)30分鐘；(6)PBS漂洗3次，加50 μL DAB底物，反應(yīng)在10分鐘；(7)PBS漂洗3次，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

TUNEL染色切片觀察與分析:在Leica光學(xué)顯微鏡下觀察TUNEL染色，每組共取9個(gè)切片，每張切片在200倍視野下選取3個(gè)視野，計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和正常細(xì)胞數(shù)。凋亡細(xì)胞可見(jiàn)核中有棕褐色顆粒，凋亡細(xì)胞體積縮小，染色體斷裂成核碎片，形成膜包裹性的凋亡小體，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色。統(tǒng)計(jì)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞所占的比例，計(jì)算腫瘤細(xì)胞凋亡率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組U87裸鼠腫瘤組織MVD檢測(cè)

與模型對(duì)照組比較，抗瘤丸優(yōu)化方-4低劑量組、陽(yáng)性藥對(duì)照組的MVD值明顯降低(P<0.05)。經(jīng)免疫組化法染色顯示，CD34低表達(dá)。見(jiàn)表1、圖1。

圖1 各組U87裸鼠腫瘤組織中CD34的表達(dá)(DAB，×200)

表1 給藥20天后各組U87裸鼠腫瘤組織MVD比較

2.2 各組U87裸鼠腫瘤組織VEGF檢測(cè)

與模型對(duì)照組比較，抗瘤丸優(yōu)化方-4高、中、低劑量組、陽(yáng)性藥對(duì)照組移植瘤灰度值明顯增高(P<0.05)。經(jīng)免疫組化法染色顯示，VEGF低表達(dá)。見(jiàn)表2、圖2。

圖2 各組U87裸鼠腫瘤組織中VEGF的表達(dá)(DAB，×200)

表2 給藥20天后各組U87裸鼠腫瘤VEGF灰度值比較

2.3 各組U87裸鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率檢測(cè)

與模型對(duì)照組比較，上述給藥組細(xì)胞凋亡率顯著增高 (P<0.05)。經(jīng)TUNEL染色，模型對(duì)照組可見(jiàn)少量呈棕褐色的凋亡細(xì)胞，抗瘤丸優(yōu)化方-4高、中、低劑量組、陽(yáng)性藥對(duì)照組可見(jiàn)大量的凋亡細(xì)胞，具有明顯的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。見(jiàn)表3、圖3。

表3 給藥20天后各組U87裸鼠腫瘤細(xì)胞凋亡率比較

圖3 各組U87裸鼠腫瘤組織中的凋亡細(xì)胞TUNEL染色(×200)

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為膠質(zhì)瘤的發(fā)生與痰濕凝聚、氣滯血瘀、肝腎不足密切相關(guān)，主要治療法則是活血化瘀、扶正培本、健脾補(bǔ)腎、化痰軟堅(jiān)[6]?？沽鐾枋怯?8味中藥組成的院內(nèi)制劑，其中君藥具有清熱利濕、活血化瘀的功效。臣藥配伍君藥起到清熱解毒，豁痰開(kāi)竅的功效。白英等清熱利濕，解毒消腫；川貝母等潤(rùn)肺祛痰開(kāi)胸，利肺氣，通調(diào)水道以使痰濕下行；炒山楂等健脾開(kāi)胃，可消食化積散瘀，防君臣之藥傷及脾胃。全方配伍共奏清熱解毒，活血化瘀，化痰散結(jié)之功。前期臨床研究表明，KLW可延長(zhǎng)惡性膠質(zhì)瘤患者的生存時(shí)間，具有肯定療效，且價(jià)格低廉，有較好的開(kāi)發(fā)價(jià)值和前景[7]。

MVD是指生物組織如皮膚、肌肉、器官等組織中單位密度的微血管數(shù)量。MVD在臨床上應(yīng)用于惡性組織微血管新生、侵襲性以及預(yù)后評(píng)估的診斷，可以反映腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移[8]。VEGF是腫瘤血管生成的重要因子，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[9]。王奕丹等[10]研究MVD與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān),與患者的術(shù)后生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。李娜等[11]研究通過(guò)下調(diào)VEGF表達(dá)，抑制了新生血管的生成，阻斷其營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，抑制腫瘤增殖，進(jìn)而發(fā)揮其抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用?？沽鐾柚邪谆ㄉ呱嗖?、半枝蓮、白英等成分已有大量的藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)證明了抗瘤機(jī)制。其中白花蛇舌草可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增值[12]；半枝蓮能抑制腫瘤血管生成與轉(zhuǎn)移[13]；白英可通過(guò)調(diào)控VEGF相關(guān)信號(hào)通路誘導(dǎo)A549細(xì)胞的凋亡[14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，抗瘤丸優(yōu)化方-4能夠抑制VEGF的表達(dá)，降低MVD，從而抑制腫瘤組織新生血管形成，同時(shí)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

綜上所述，抗瘤丸優(yōu)化方-4對(duì)膠質(zhì)瘤有一定的作用效果，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制VEGF的表達(dá)相關(guān)，為抗瘤丸的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。