高思琦 肖準(zhǔn) 王曉檸 劉偉 陳佳美 劉平

肝竇阻塞綜合征(hepatic sinus obstruction syndrome，HSOS)，即肝小靜脈閉塞性阻塞(hepatic veno-occlusive disease，HVOD)，是由肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致的肝竇流出道梗阻的肝內(nèi)門靜脈高壓綜合征，可進(jìn)展為多器官衰竭，其死亡率極高[1]。在中國(guó)，攝入含有天然毒性吡咯里西啶生物堿的土三七是導(dǎo)致HSOS的主要原因[2-4]。目前，臨床尚無(wú)有效的治療藥物，現(xiàn)行可用的僅有去纖苷，在歐洲被批準(zhǔn)用于治療造血干細(xì)胞移植后的重癥HSOS，但其治療具有一定局限性[5]?，F(xiàn)有研究表明，中藥的一些活性成分具有改善HSOS的作用，如芝麻酚、川芎嗪等[6-7]，其主要作用機(jī)制可能與抗炎抗氧化相關(guān)。中醫(yī)名方一貫煎出自清代醫(yī)家魏之秀的《續(xù)名醫(yī)類案》，由生地黃、麥冬、北沙參、枸杞、當(dāng)歸、川楝子六味中藥組成，主治“脅痛，吞酸，吐酸，疝瘕，一切肝病”，有滋陰養(yǎng)肝之效?，F(xiàn)代研究表明，一貫煎具有良好的抗肝纖維化作用，其主要作用機(jī)制與抗炎抗氧化，抗肝細(xì)胞損傷，改善肝竇毛細(xì)血管化以及抑制肝星狀細(xì)胞活化有關(guān)[8-9]。然而一貫煎對(duì)于HSOS的干預(yù)作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究探究中藥復(fù)方一貫煎對(duì)野百合堿(monocrotaline，MCT)誘導(dǎo)的急性HSOS大鼠模型的干預(yù)作用，觀察氧化應(yīng)激、炎癥及細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司動(dòng)物中心。動(dòng)物許可證編號(hào)：XYXK(滬)2020-0009。飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由飲食飲水，恒溫恒濕，晝夜交替。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(PZSHUTCM190315007)。

1.2 藥物、試劑和儀器

一貫煎由生地黃(18 g)、麥冬(10 g)、北沙參(10 g)、枸杞子(12 g)、當(dāng)歸(10 g)、川楝子(4.5 g)六味中藥組成，浸膏粉(含生藥3.021 g/g)由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院制劑中心(國(guó)家中醫(yī)藥管理局三級(jí)實(shí)驗(yàn)室)一次性制備。

野百合堿購(gòu)自Sigma公司(C2401)；丙氨酸/天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase/aspartate aminotransferase， ALT/AST)、總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione s-transferase，GST)活性檢測(cè)以及蘇木素—伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色的試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；免疫組化試劑盒購(gòu)自基因科技(GK500705，批號(hào)：2018082901)；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(顯色法)購(gòu)自碧云天(C1091，批號(hào)：031819190703)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本Toyobo公司；BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒購(gòu)自Thermo 公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購(gòu)自Proteintech公司。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

F200PRO型酶標(biāo)儀(瑞士Tecan集團(tuán)公司)；VIIA7型PCR儀(美國(guó)ABI公司)；041BR127719型電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；OdysseyCLX雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(美國(guó)LI-CORBiosciences公司)； SCN400型數(shù)據(jù)切片掃描機(jī)(德國(guó)Leica公司)； QUANTA FEG 250環(huán)境掃描電子顯微鏡(荷蘭飛利浦公司生產(chǎn))。

1.3 動(dòng)物模型制備與分組

將SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組及一貫煎組，每組8只，模型組及一貫煎組大鼠采用90 mg/kg MCT灌胃制備HSOS模型，正常對(duì)照組同時(shí)灌胃等量的蒸餾水。造模后6小時(shí)、30小時(shí)對(duì)一貫煎組大鼠予一貫煎(劑量為1.139g/kg)灌胃兩次，模型組灌胃等量的蒸餾水，灌胃藥液量為10 mL/kg。48小時(shí)后，各組均未見(jiàn)死亡，以3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后處死取材，采集血液(靜置3小時(shí)后，轉(zhuǎn)速1000 g/分鐘，離心15分鐘獲取血清)和肝組織樣本用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 血清生化分析及組織病理學(xué)觀察

將血清樣本室溫解凍，振蕩混勻，按照試劑盒說(shuō)明書步驟檢測(cè)ALT和AST活性。肝組織病理學(xué)樣品取肝臟大葉同一部位肝組織，置于10%中性甲醛緩沖液固定，自動(dòng)脫水機(jī)脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，封片，使用數(shù)據(jù)切片掃描機(jī)自動(dòng)掃描，觀察肝細(xì)胞損傷、炎癥反應(yīng)程度等。掃描電子顯微鏡觀察樣品制備：先用PBS通過(guò)大鼠腹主動(dòng)脈灌注，后用含有2.5%戊二醛的固定液灌注、取樣，樣本處理后用QUANTA FEG 250環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察。

1.5 MDA含量、T-SOD及GST活性檢測(cè)

在預(yù)冷的PBS中勻漿肝組織，采用MDA試劑盒測(cè)定。BCA法檢測(cè)肝組織蛋白質(zhì)濃度，MDA量表示為nmol/mg蛋白。肝臟T-SOD、GST活性檢測(cè)同上，均根據(jù)試劑盒說(shuō)明書測(cè)定。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)檢測(cè)mRNA表達(dá)

稱取肝組織，加入Trizol試劑對(duì)組織總RNA進(jìn)行提取后，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA。用Real-time PCR檢測(cè)肝組織mRNA的表達(dá)水平，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各mRNA的表達(dá)量。

1.7 蛋白免疫印跡法(Western Blot，WB)檢測(cè)肝組織蛋白表達(dá)

稱取肝組織，加RIPA蛋白裂解液后，使用全自動(dòng)研磨儀勻漿，提取上清液，BCA蛋白定量并加上樣緩沖液。制備10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜，膜封閉及抗體反應(yīng)，使用odydssey紅外圖像系統(tǒng)檢測(cè)，采用Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.8 免疫組化染色

肝組織石蠟切片常規(guī)脫蠟復(fù)水，置于檸檬酸緩沖液(檸檬酸三鈉3 g+檸檬酸0.4 g，定容至1000 mL)中，微波爐高溫抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫。將切片取出浸泡于3%過(guò)氧化氫溶液滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，室溫避光孵育10分鐘，滴加10%山羊血清封閉30分鐘，滴加一抗，4℃過(guò)夜。次日使用免疫組化試劑盒孵育二抗，37℃，30分鐘，DAB顯色，然后用蘇木素染細(xì)胞核，梯度酒精脫水，二甲苯透明后用中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察。

1.9 TUNEL法檢測(cè)肝組織細(xì)胞凋亡

根據(jù)碧云天TUNEL試劑盒說(shuō)明書操作。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一貫煎對(duì)MCT誘導(dǎo)的大鼠HSOS病理學(xué)變化及干預(yù)作用

模型組血清ALT及AST活性較正常對(duì)照組顯著升高(P<0.01)，一貫煎組可顯著降低MCT誘導(dǎo)的血清ALT、AST活性(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組HSOS大鼠血清ALT、AST活性比較

肝組織HE染色可見(jiàn)正常組肝臟組織結(jié)構(gòu)正常，肝板排列整齊，匯管區(qū)未見(jiàn)擴(kuò)大及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。而模型組則見(jiàn)肝臟結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，肝細(xì)胞大面積壞死，匯管區(qū)周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肝竇內(nèi)紅細(xì)胞大量聚集，“瘀血”現(xiàn)象明顯，一貫煎組肝組織損傷明顯減輕。見(jiàn)圖1。

圖1 各組HSOS大鼠肝組織HE染色結(jié)果(×200)

肝組織掃描電鏡結(jié)果可見(jiàn)，與正常對(duì)照組相比，模型組肝竇內(nèi)皮呈現(xiàn)連續(xù)性破壞，肝竇內(nèi)皮窗孔擴(kuò)大，“篩狀”結(jié)構(gòu)消失，甚至脫落，使Disse空間暴露；而一貫煎組的肝竇內(nèi)皮損傷病變明顯改善，表明一貫煎可顯著改善MCT誘導(dǎo)的HSOS大鼠的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷、肝細(xì)胞壞死等病理改變。見(jiàn)圖2。

圖2 各組HSOS大鼠肝組織掃描電鏡結(jié)果(×20，000)

2.2 一貫煎對(duì)MCT誘導(dǎo)的HSOS大鼠肝臟氧化應(yīng)激及炎性因子的影響

與正常對(duì)照組相比，模型組肝組織GST活性和MDA含量顯著升高(P<0.05)，一貫煎組肝組織GST活性較模型組有所降低，MDA較模型組顯著降低(P<0.05)。模型組T-SOD活性較正常對(duì)照組顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，一貫煎組肝組織T-SOD有升高的趨勢(shì)。見(jiàn)表3。

表3 各組HSOS大鼠肝組織GST活性、T-SOD活性和MDA含量比較

與正常對(duì)照組相比，模型組肝組織炎癥相關(guān)因子如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、血紅加氧酶(heme oxygenase 1，HO-1)及炎癥小體(nod-like receptor protein 3，NLRP3)的mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.01)，而一貫煎干預(yù)組肝組織中這些基因的表達(dá)較模型組顯著降低(IL-1β：P<0.05，HO-1：P<0.01)。見(jiàn)表4。

表4 各組HSOS大鼠肝組織TNF-α、IL-1β、HO-1及NLRP3的mRNA表達(dá)比較

與正常對(duì)照組相比，模型組肝組織TNF-α蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)，而一貫煎組肝組織TNF-α的蛋白表達(dá)較模型組顯著降低(P<0.01)。見(jiàn)圖3、表5。此外，肝組織巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80免疫組化染色結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組F4/80的陽(yáng)性面積顯著增加，一貫煎干預(yù)后F4/80的陽(yáng)性面積明顯減少(見(jiàn)圖4)。以上結(jié)果提示一貫煎可改善MCT誘導(dǎo)的HSOS大鼠肝臟氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)。

圖3 各組HSOS大鼠肝組織TNF-α蛋白表達(dá)

表5 各組HSOS大鼠肝組織TNF-α蛋白表達(dá)比較

圖4 各組HSOS大鼠肝組織F4/80蛋白表達(dá)(×200)

2.3 一貫煎對(duì)MCT誘導(dǎo)的HSOS大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響

肝組織經(jīng)TUNEL染色可見(jiàn)，正常組肝組織幾乎沒(méi)有TUNEL陽(yáng)性表達(dá)；模型組肝組織TUNEL主要表達(dá)在肝細(xì)胞上，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞顯著增多；一貫煎組肝組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組明顯減少(見(jiàn)圖5)。進(jìn)一步檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X,Bax)的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，模型組肝組織Bcl2的蛋白表達(dá)及Bcl2/Bax的比值較正常組顯著降低(P<0.01，P<0.05)，而一貫煎組干預(yù)后均有所提高(見(jiàn)圖6、表6)，提示一貫煎可顯著減輕MCT誘導(dǎo)的HSOS大鼠肝細(xì)胞凋亡。

圖5 各組HSOS大鼠肝組織凋亡TUNEL染色(×200)

圖6 各組HSOS大鼠肝組織Bcl2/Bax蛋白表達(dá)

表6 各組HSOS大鼠肝組織Bcl2/Bax蛋白表達(dá)比較

3 討論

HSOS作為一種肝病的危重癥，常因肝腫大、腹水、黃疸、門靜脈高壓甚至嚴(yán)重的肝衰竭而導(dǎo)致死亡，其在臨床上目前尚無(wú)可用的治療藥物?，F(xiàn)行可用的去纖苷，臨床報(bào)道數(shù)據(jù)顯示，治療HSOS的治愈率僅25.5%[10]。除去纖苷外，一些單克隆抗體、索拉菲尼等也具有治療HSOS的作用，但仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段[11-14]。國(guó)內(nèi)提出的“吡咯生物堿相關(guān)肝竇阻塞綜合征診斷和治療專家共識(shí)意見(jiàn)(2017年, 南京)”[15]對(duì)該病的治療也僅限于對(duì)癥支持療法，因而探求HSOS的有效治療藥物具有十分重要的臨床意義。天然產(chǎn)物MCT屬于PAs，其代謝產(chǎn)物脫氫野百合堿可通過(guò)與肝竇內(nèi)皮細(xì)胞上的F-actin共價(jià)結(jié)合，導(dǎo)致F-actin解聚，并進(jìn)一步造成肝竇充血以及微循環(huán)障礙，引起廣泛的炎癥和組織壞死，最終形成HSOS。MCT誘導(dǎo)的HSOS模型具有典型的HSOS病理學(xué)特點(diǎn)，被廣泛用于HSOS的研究[16-18]。

HSOS疾病發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)在于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷，電鏡下可見(jiàn)MCT造成的肝血竇擴(kuò)張，內(nèi)皮窗孔擴(kuò)大，“篩狀”結(jié)構(gòu)消失，甚至脫落而致竇內(nèi)皮的不連續(xù)，以及Disse空間暴露等一系列肝竇內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷的表現(xiàn)，而一貫煎可顯著減輕肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。且一貫煎顯著降低MCT誘導(dǎo)的大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶及谷草轉(zhuǎn)氨酶活性，顯著改善MCT大鼠肝組織病理改變。此外，TUNEL檢測(cè)結(jié)果還顯示一貫煎可顯著抑制HSOS大鼠肝組織的肝細(xì)胞凋亡。

強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激與HSOS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物，可影響線粒體鏈復(fù)合物及相關(guān)酶活性，加劇細(xì)胞損傷，是公認(rèn)的有效評(píng)估組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的標(biāo)志物[19]。本研究中，MCT處理后造成肝臟內(nèi)MDA的大量蓄積是強(qiáng)烈氧化應(yīng)激的反映，而在予以一貫煎干預(yù)后則顯著下降。已有研究表明，中藥中的一些活性單體如黃芩素、綠原酸、兒茶素、甘草素與甘草苷均可通過(guò)調(diào)控相關(guān)代謝酶，提高機(jī)體抗氧化能力以發(fā)揮對(duì)MCT誘導(dǎo)的HSOS的改善作用[18, 20-21]。其中，GST可促進(jìn)GSH與有親電子物質(zhì)的結(jié)合，并清除體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化物。本研究中，MCT處理后造成肝臟急性損傷導(dǎo)致GST活性應(yīng)激性的升高，而一貫煎干預(yù)后其活性降低。T-SOD的結(jié)果也提示一貫煎減弱了MCT誘導(dǎo)的大鼠肝臟氧化應(yīng)激損傷。即結(jié)果均表明可能是通過(guò)減輕肝臟氧化應(yīng)激損傷而改善MCT誘導(dǎo)的HSOS。

炎癥反應(yīng)是HSOS發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用的環(huán)節(jié)，其中TNF-α作為重要促炎因子[22]，可響應(yīng)氧化應(yīng)激而被激活，可作為平衡細(xì)胞存活、凋亡和壞死中的主要調(diào)節(jié)劑，是聯(lián)系氧化應(yīng)激反應(yīng)與細(xì)胞死亡的重要環(huán)節(jié)。在本實(shí)驗(yàn)中，MCT處理后肝組織TNF-α的mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加，這與HSOS發(fā)生的嚴(yán)重的炎癥風(fēng)暴及細(xì)胞死亡相一致。同時(shí)，在肝臟急性損傷后，巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)一方面可介導(dǎo)炎癥的發(fā)生，另一方面對(duì)肝臟的血管及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)具有十分重要的作用[23-24]。肝組織免疫組化染色顯示MCT造模后巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80在損傷區(qū)域的大量陽(yáng)性表達(dá)，提示肝組織發(fā)生了嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。同時(shí)，MCT引起的氧化應(yīng)激使得炎癥小體NLRP3和促炎因子IL-1β的mRNA表達(dá)顯著增加，而一貫煎干預(yù)后TNF-α、F4/80及IL-1β的表達(dá)顯著下降，表明一貫煎具有良好的抗炎作用。然而本實(shí)驗(yàn)MCT處理后HO-1的mRNA表達(dá)顯著增加，而一貫煎干預(yù)后HO-1的mRNA表達(dá)顯著下降，該結(jié)果似乎與既往研究[25-26]不同?？紤]導(dǎo)致差異的主要原因可能是由于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性，并且全身的反應(yīng)不僅限于肝臟。MCT導(dǎo)致HO-1的mRNA表達(dá)的增加可能是由于強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)而誘發(fā)機(jī)體的自我防御能力，而一貫煎可顯著改善HSOS的病理變化，炎癥反應(yīng)也顯著減輕，因此HO-1的mRNA表達(dá)隨之降低。

此外，細(xì)胞死亡也是HSOS的重要表現(xiàn)之一[1]，其中由強(qiáng)烈的氧化應(yīng)激引起的凋亡途徑是其中重要的環(huán)節(jié)。Bcl2家族蛋白在該途徑中發(fā)揮著重要的作用，包括抗凋亡蛋白Bcl2及促凋亡蛋白Bax[27]。MCT誘導(dǎo)的大鼠HSOS肝組織中可見(jiàn)嚴(yán)重的大面積的細(xì)胞死亡，而一貫煎干預(yù)后肝組織HE染色及TUNEL染色顯示出細(xì)胞凋亡明顯減輕，且Bcl2的表達(dá)和Bcl2/Bax升高，提示一貫煎可能是通過(guò)提高抗凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)抑制肝細(xì)胞的凋亡進(jìn)而改善HSOS。

綜上，一貫煎可顯著改善野百合堿誘導(dǎo)的大鼠HSOS，其作用機(jī)制可能與抗過(guò)氧化抗炎性損傷，抑制肝細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究為中醫(yī)古籍方劑一貫煎治療HSOS的臨床應(yīng)用發(fā)展提供部分實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

致謝 特別感謝上海中醫(yī)藥大學(xué)科技實(shí)驗(yàn)中心陸雄、陸敏兩位老師對(duì)課題組的電鏡技術(shù)及病理解讀方面提供的幫助與支持！