韋薇 覃驪蘭 李莉 鄭偉灝

過敏性疾病(allergic disease)反復(fù)發(fā)作且難以根治已經(jīng)成為全球最受關(guān)注的公共衛(wèi)生問題之一[1]。據(jù)世界變態(tài)反應(yīng)組織統(tǒng)計，近30年來，過敏性疾病的發(fā)生率至少增加了3倍，目前全球總患病率已達22%。近年來，特異性生物標(biāo)志物、信號與蛋白相關(guān)機制是過敏學(xué)科的研究熱點[2]。肥大細胞是過敏性疾病發(fā)病的主要效應(yīng)細胞，存在于機體的大多數(shù)組織如皮膚、呼吸道、黏膜、腹腔中，被抗體激活的肥大細胞脫顆粒后產(chǎn)生的炎性介質(zhì)與細胞因子會參與多種炎癥免疫性疾病如過敏反應(yīng)、哮喘等，所以肥大細胞脫顆粒機制在過敏性疾病的發(fā)展進程中起到關(guān)鍵性作用[3-7]。研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控白細胞介素信號與磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases, PI3K)/蛋白激酶B (protein kinase B，PKB/Akt)信號通路，與治療過敏性疾病密切相關(guān)[8-10]。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療此病主要以控制疾病癥狀為主，無法有效緩解反復(fù)發(fā)作，而且副作用明顯[11]，而中醫(yī)藥治療過敏性疾病有著獨特的優(yōu)勢，療效顯著，且副作用較小?，F(xiàn)代研究表明玉屏風(fēng)散在治療哮喘、鼻炎、蕁麻疹等過敏性疾病都有顯著療效[12-14]，且玉屏風(fēng)散可以顯著減輕肥大細胞脫顆粒，可以通過抑制肥大細胞脫顆粒相關(guān)作用機制來治療過敏性疾病[15-17]。因此，本研究通過建立體外肥大細胞脫顆粒模型，來驗證玉屏風(fēng)散發(fā)揮抗過敏反應(yīng)的作用是否與肥大細胞脫顆粒作用機制和PI3K/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)信號通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

玉屏風(fēng)散浸膏：根據(jù)2015版《中華人民共和國藥典(一部)》玉屏風(fēng)項下提取方法，按3∶1∶1比例取黃芪600 g、防風(fēng)200 g、白術(shù)200 g，將200 g防風(fēng)予以碎斷，加4倍量的水浸泡2小時，蒸餾提取5小時，另收集蒸餾后的水溶液，將蒸餾后的藥渣與600 g黃芪、200 g白術(shù)一起煎煮2次，第一次1.5小時，第二次1小時，合并煎液，過濾，濾液濃縮至適量，加適量乙醇至含醇量70%，攪拌，靜置，過濾，濾液加壓回收乙醇，加入揮發(fā)油及蒸餾后的水溶液，濃攪拌，靜置，取上清液，過濾，濾液濃縮得156.611 g浸膏量(1 g浸膏含6.3852 g生藥)，置-20°冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

黃芪、防風(fēng)、白術(shù)(廣西仙茱中藥科技有限公司，批號：20190101、2019040、20190602)；胰酶(武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號：52419)；CCK-8(新賽美生物科技有限公司，批號：N9091085)；小鼠單抗PI3K(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：60225-1-Ig)，兔多抗p-PI3K(Abcam公司，批號：Ab182651)；兔多抗Akt(Bioss公司，批號：Bs-0115R)；p-Akt(Affinity公司，批號：AF0016)；兔多抗mTOR(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：20657-1-AP)；p-mTOR(CST公司，批號：5536t)；β-氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase, β-Hex)、組胺、白細胞介素(interleukin，IL)-4、IL-13、血小板激活因子(platelet activating factor, PAF)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號：202004)；Trizol(Ambion公司，批號：15596-026)；HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(武漢博士德生物工程有限公司，批號：BA1054)。

1.2 細胞株與分組

小鼠肥大細胞瘤P815購自中國科學(xué)院干細胞庫，編號：SCSP-516。細胞狀態(tài)為部分懸浮、部分貼壁生長。使用高糖伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco modified Eagle medium,DMEM)培養(yǎng)基，含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，1%雙抗。培養(yǎng)于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，待細胞密度達到80%～90%時，調(diào)整相應(yīng)的細胞數(shù)量進行傳代，取對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。將P815細胞隨機分為4組：空白組、模型組、玉屏風(fēng)散高劑量組、玉屏風(fēng)散低劑量組。

1.3 儀器設(shè)備

細胞恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；生物安全柜(美國Thermo公司)；倒置顯微鏡(日本奧林巴斯科技公司)；Epoch2T型吸收光酶標(biāo)儀(美國BioTek儀器有限公司)；全自動細胞計數(shù)儀(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)；離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)。

1.4 CCK-8測定P815細胞存活率

將玉屏風(fēng)散浸膏用不含血清高糖DMEM培養(yǎng)基按稀釋為1.5625 μg/mL、3.125 μg/mL、6.25 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL 7個濃度梯度，置于4℃冰箱保存。取對數(shù)生長期的P815細胞，用DMEM培養(yǎng)液(無血清)按1×105/mL密度接種于96孔板，每孔100 μL。設(shè)置空白組(培養(yǎng)基)、對照組(細胞、培養(yǎng)基)、給藥組(細胞、培養(yǎng)基、玉屏風(fēng)散)，每組設(shè)置5個復(fù)孔。饑餓處理24小時使其同步化后，吸走每孔內(nèi)原培養(yǎng)液，給藥組分別加入100 μL含終濃度(1.5625 μg/mL、3.125 μg/mL、6.25 μg/mL、12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL)的玉屏風(fēng)散DMEN培養(yǎng)液，空白組、對照組加入等體積無藥DMEM培養(yǎng)液，置于恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育。24小時后，吸走各孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入含10% CCK-8的培養(yǎng)液，37℃，5% CO2繼續(xù)孵育1.5小時，利用酶標(biāo)儀測定各孔在波長450 nm 處的吸光度(optical delnsity，OD)值，重復(fù)3次[18-19]。

計算各濃度組細胞存活率，細胞存活率%=(實驗組吸光度-空白組吸光度)/(對照組吸光度-空白組吸光度)×100%。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附法檢測β-Hex、組胺等炎性因子水平

取對數(shù)生長期的P815細胞計數(shù)，用無血清培養(yǎng)基稀釋成5×105/mL 密度的單細胞懸液，接種到6孔板上，設(shè)置空白組、模型組、玉屏風(fēng)散高劑量組(25 μg/mL)、玉屏風(fēng)散低劑量組(12.5 μg/mL)，每組設(shè)置3個復(fù)孔，每孔2 mL，置 37 ℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24小時。待細胞至80%融合度，于細胞空白組加入等體積DMEM培養(yǎng)液；細胞模型組用等體積DMEM培養(yǎng)液代替受試藥物，玉屏風(fēng)散高、低劑量組分別加入不同濃度的藥物，繼續(xù)培養(yǎng)在 37℃，5% CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中，在藥物作用6小時后，模型組、玉屏風(fēng)散高劑量組與玉屏風(fēng)散低劑量組加入500 μL胰蛋白酶(終濃度1 μg/mL)刺激，空白組加入等體積的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)，分別收集刺激l小時后的細胞上清液與細胞，上清液用來檢測β-氨基己糖苷酶(β-hexosaminidase, β-Hex)、組胺、IL-4、IL-13、PAF等細胞因子的分泌情況，孔板壁上的細胞用于后續(xù)提取蛋白[20]。細胞上清液嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫分析試劑盒操作步驟，記錄各細胞因子吸光度值。

1.6 Western blot法檢測PI3K、Akt、mTOR蛋白及其磷酸化的表達

將1.5步驟收集到的6孔板細胞，使用PIPA裂解液進行裂解提取蛋白，蛋白定量變性后，各蛋白以上樣量40 μg使用SDS-PAGE凝膠進行電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，使用5%脫脂牛奶封閉，1%的BSA封閉磷酸化蛋白，一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2小時，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照，用IPP對灰度值進行分析，使用GAPDH作為內(nèi)參。

1.7 實時熒光定量PCR法檢測PI3K、Akt、mTOR蛋白表達量

收集1.5收集到的細胞，使用 Trizol 法提取細胞總 RNA ，并反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，以 cDNA 為模板，進行實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR, qRT-PCR)實驗檢測各組細胞的PI3K、Akt、mTOR在mRNA水平上的表達，引物序列如表1。相對表達量運用2-ΔΔCt法計算。

表1 引物序列

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 玉屏風(fēng)散對P815細胞存活率的影響

對比其他組，玉屏風(fēng)散在25 μg/mL濃度以下時，P815細胞存活率達到80%以上，無明顯抑制作用，50 μg/mL濃度以上存活率低于80%，50 μg/mL與100 μg/mL濃度兩組對比其他5組有顯著差異，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。如圖1。

圖1 不同濃度玉屏風(fēng)散對P815細胞存活率比較

2.2 玉屏風(fēng)散對β-Hex、組胺等炎性因子水平的影響

胰酶刺激P815肥大細胞脫顆粒后，對比空白組，模型組細胞上清液中的β-Hex、組胺、IL-4、IL-13、PAF濃度都有顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；對比模型組，玉屏風(fēng)散高劑量組與玉屏風(fēng)散低劑量組的β-Hex、組胺、IL-4、IL-13、PAF濃度顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。如表2。

表2 玉屏風(fēng)散對各炎性因子濃度的影響

2.3 玉屏風(fēng)散對PI3K、Akt、mTOR及其磷酸化蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組、玉屏風(fēng)散高劑量組和玉屏風(fēng)散低劑量組PI3K、Akt、mTOR表達變化都無明顯差異(P>0.05)磷酸化后的p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表達變化有顯著差異，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，玉屏風(fēng)散高劑量組p-PI3K、p-Akt、p-mTOR表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，玉屏風(fēng)散低劑量組p-PI3K無明顯變化，p-Akt、p-mTOR表達顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。如表3、圖2。

表3 玉屏風(fēng)散對PI3K、Akt、mTOR及其磷酸化蛋白表達的影響

2.4 玉屏風(fēng)散對PI3K、Akt、mTOR蛋白表達量的影響

胰酶刺激P815肥大細胞活化脫顆粒后，與空白組比較，模型組PI3K、Akt、mTOR基因的相對表達量顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，玉屏風(fēng)散高劑量組與玉屏風(fēng)散低劑量組PI3K、Akt、mTOR基因的相對表達量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)。如表4。

注：A 空白組；B 模型組；C 玉屏風(fēng)散高劑量組；D 玉屏風(fēng)散低劑量組

表4 玉屏風(fēng)散對PI3K、Akt、mTOR蛋白表達量的影響

3 討論

實驗結(jié)果表明，玉屏風(fēng)散可以降低肥大細胞中β-Hex、組胺、IL-4、IL-13、PAF炎性因子水平，并對PI3K、Akt、mTOR蛋白的表達有調(diào)節(jié)作用，說明了玉屏風(fēng)散是通過抑制肥大細胞活化脫顆粒釋放炎性因子來減輕過敏反應(yīng)，其作用機制與PI3K/Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

過敏性疾病在新生兒到老年人的各個年齡階段都可能會發(fā)生，主要包括皮膚過敏反應(yīng)、呼吸道過敏反應(yīng)、消化道過敏反應(yīng)等。過敏反應(yīng)發(fā)病機制主要由免疫球蛋白介導(dǎo)，抗原(Ag)可以通過交聯(lián)的免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)E結(jié)合肥大細胞上的特異性親和受體(FcεRI)，激活肥大細胞內(nèi)部進行一系列磷酸化反應(yīng)和炎癥因子合成，使細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，導(dǎo)致肥大細胞脫顆粒化并釋放組胺、β-Hex、前列腺素(prostaglandins，PGs)和白三烯(leukot-rienes，LTs)、PAF等炎性介質(zhì)；Ag也可以通過交聯(lián)的IgG結(jié)合肥大細胞上的特異性親和受體(FcγRIII)刺激肥大細胞產(chǎn)生PAF。PAF可凝聚和活化血小板使之釋放組胺等，增強過敏反應(yīng)，PAF和組胺主要通過誘導(dǎo)平滑肌收縮和增加血管通透性引起過敏反應(yīng)癥狀[21-25]。另一種現(xiàn)代研究認為，過敏反應(yīng)是一種由輔助型T細胞2(T helper 2 cell，Th2)細胞因子引發(fā)的免疫系統(tǒng)失調(diào)疾病，Th2細胞主要產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10及IL-13等細胞因子，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答[26]。IL-4、IL-13與過敏反應(yīng)密切相關(guān)，IL-4、IL-13可以激活B細胞產(chǎn)生IgE。研究表明，哮喘、變應(yīng)性鼻炎發(fā)作過程中被活化的免疫細胞會釋放IL-4、IL-13等炎性介質(zhì)，引起支氣管收縮、血管通透性增加等炎癥反應(yīng)[27]。IL-4可以啟動肥大細胞分化，IL-13可促進IL-4的作用，兩者共同作用，促使并加重炎癥的形成與發(fā)展。因此，抑制這幾種炎癥性因子是治療過敏性疾病的有效途徑。

PI3K/Akt/mTOR信號通路是參與炎癥的發(fā)生、發(fā)展的重要信號通路，也是重要的細胞內(nèi)途徑之一。PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，能夠調(diào)節(jié)眾多細胞內(nèi)信號級聯(lián)的激活，以及多種炎癥介質(zhì)功能的發(fā)揮, 在PI3K下游的直接作用靶點是蛋白激酶Akt，也是最關(guān)鍵的靶酶，負責(zé)傳遞PI3K相關(guān)的生物信息。PI3K 的脂類激酶活性，可以催化Akt磷酸化，磷酸化的Akt從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細胞膜上，通過直接和間接兩種途徑激活底物mTOR蛋白，調(diào)節(jié)下游細胞生長、增殖和炎癥靶基因的表達[28]。在靶細胞水平上，通過PI3K可誘導(dǎo)合成內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)，由eNOS催化產(chǎn)生的一氧化氮可加劇過敏反應(yīng)。有研究表明，通過影響PI3K的表達，抑制Akt與mTOR的磷酸化水平，可以減輕炎癥反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展[29-30]。

肥大細胞脫顆粒試驗是過敏反應(yīng)模型常用的一種方法。彭博[31]在相同刺激條件下比較P815和RBL-2H3細胞激活后脫顆粒反應(yīng)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)P815細胞是活化后脫顆粒時間出現(xiàn)更早、程度更高的細胞。人皮膚肥大細胞在體外釋放類胰蛋白酶是一種新型的肥大細胞特性，而被釋放的類胰蛋白酶再通過特異性受體激活相鄰的肥大細胞，通過相關(guān)機制再次誘導(dǎo)相鄰肥大細胞組胺釋放，從而產(chǎn)生肥大細胞的“瀑布效應(yīng)”[32]。隋麗[5]和吳賢波[20]在體外培養(yǎng)P815細胞后，均采用胰蛋白酶激發(fā)誘導(dǎo)肥大細胞脫顆粒來檢測相關(guān)分子機制。

玉屏風(fēng)散最早記載于《丹溪心法》，由黃芪、防風(fēng)、白術(shù)三味藥組成，具有益氣固表、扶正祛邪之功效。其用藥量精少而配伍嚴(yán)謹，白術(shù)健脾益氣，脾旺則土可生金，使肺氣充足，衛(wèi)陽以固，與黃芪為伍，則益氣固表之力更宏，故用以為臣。防風(fēng)走表，祛風(fēng)以散風(fēng)邪，合黃芪、白術(shù)則益氣散邪，為佐使之用。本方中黃芪得防風(fēng)則固表不留邪，防風(fēng)得黃芪，祛邪不傷正，實為補中有散，散中寓補之方[33]。許多藥理學(xué)研究表明了玉屏風(fēng)散可通過調(diào)節(jié)機體免疫功能和相關(guān)通路以發(fā)揮臨床療效，并初步探索了玉屏風(fēng)散通過多種作用機制與相關(guān)信號通路對機體產(chǎn)生的抗炎抑菌、免疫調(diào)節(jié)、穩(wěn)定微生態(tài)環(huán)境及抗腫瘤、抗纖維化等功能。但是對玉屏風(fēng)散作用機制的研究仍不夠系統(tǒng)、深入，玉屏風(fēng)散作為治療過敏性疾病的經(jīng)典方劑，如果可以闡明其抗過敏作用機制，將會為中醫(yī)藥防治過敏性疾病提供更多新思路。