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豹貓轉錄組從頭組裝及組織特異性表達分析

2021-09-27 02:41蔣蘭張雪艷王俊茵李靜
四川動物 2021年5期
關鍵詞:骨骼肌特異性基因組

蔣蘭, 張雪艷, 王俊茵, 李靜

(1. 四川大學生命科學學院,生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室,成都610065;2. 峨眉山景區(qū)管委會,峨眉山生物多樣性保護研究所,四川峨眉山614200)

豹貓Prionailurusbengalensis屬食肉目Carnivora貓科Felidae豹貓屬,地理分布極為廣泛,從亞洲南部和西南部的熱帶雨林到中國北方和俄羅斯遠東地區(qū)的森林(Hughes,1998;Woolfetal.,2002),在中國,根據(jù)地理分布豹貓被分為5個亞種(Rossetal.,2015)。盡管豹貓資源豐富,但人類活動使其棲息地不斷縮小,同時對其皮毛的需求也導致豹貓的生存受到嚴重威脅(Hughes,1998)。目前中國的野生豹貓種群數(shù)量正在下降,分布范圍也逐漸縮小,一些原有的分布區(qū)域,如寧夏、青海、山東等地區(qū)的豹貓數(shù)量已非常稀少?!吨袊鵀l危動物紅皮書》(汪松,1998)將豹貓列為易危種。

目前國內(nèi)外有關豹貓的文獻報道集中在遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育等研究。研究人員分別利用12s RNA、cytb序列和cDNA序列探討西表島貓Prionailurusiriomotensis和豹貓系統(tǒng)發(fā)育關系,結果表明二者分歧時間較近,西表島貓應為豹貓的一個亞種(Masudaetal.,1994;Suzukietal.,1994)。Masuda和Yoshida(1995)基于cytb序列認為馬島貓Prionailurusbengalensiseuptilurus也是豹貓的一個亞種。Saka等(2018)發(fā)現(xiàn)西表島和馬島的豹貓種群的MHC多樣性遠低于家貓Feliscatus種群,暗示島嶼上的豹貓由于近親繁殖或地理隔離,其對病原體的抵抗力降低。Ko等(2018)基于微衛(wèi)星分析了韓國豹貓的遺傳多樣性,發(fā)現(xiàn)其平均等位基因數(shù)和雜合度分別為3.8和0.41,多樣性低于其他12種貓科動物57個種群的平均值。白素英等(2004)利用隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)研究中國6個豹貓種群結構發(fā)現(xiàn),各種群的關系與種群間的地理距離及亞種劃分一致。目前國內(nèi)關于豹貓的研究集中在分類、分布、食性以及解剖等方面(張淑云等,1988;白素英等,2004;Xiongetal.,2016),而關于其基因表達的研究還未見報道。

轉錄組測序技術(RNA-seq)是一種廣泛應用于研究基因表達調(diào)控的分析方法,通過有效識別和量化RNA轉錄本,從而獲得其特定生理狀況的轉錄組信息(Fengetal.,2012;Spradlingetal.,2013)。RNA-seq使得從整體水平分析動物基因結構及基因功能成為可能,更有利于發(fā)現(xiàn)生物學過程、免疫反應基因、疾病產(chǎn)生過程中的基因表達譜變化以及免疫受體多樣化機制(Wang & Kirkness,2005)。由于RNA-seq技術對樣本新鮮程度要求較高,一定程度上阻礙了其在野生動物相關研究中的應用。本研究基于1只意外死亡的野生豹貓個體,采用RNA-seq對其大腦、心臟、腎臟、肝臟、肺和骨骼肌 6個組織進行轉錄組測序,通過從頭組裝、注釋,報道了一個高質(zhì)量的豹貓轉錄組。這些數(shù)據(jù)為理解豹貓的遺傳背景及基因表達譜提供了寶貴的資源,也為這一小型貓科動物的基因組注釋和深入開展保護遺傳學研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與測序

豹貓各器官的組織樣品均來自于1只在峨眉山被汽車意外撞死的雌性成年個體,被管理人員發(fā)現(xiàn)后提供給本實驗室。共采集了6個不同器官的組織樣品,分別為大腦、心臟、腎臟、肝臟、肺和骨骼肌,新鮮的組織樣品迅速置于液氮中保存,其余樣品-80 ℃儲存。樣品的總RNA提取和轉錄組建庫測序工作由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成,采用Illumina HiSeq 4000測序平臺對6個樣品的cDNA文庫分別進行150 bp的雙端測序。

1.2 質(zhì)控與過濾

轉錄組組裝前需對原始序列進行質(zhì)量控制,過濾標準為去除含N比例大于10%、低質(zhì)量(質(zhì)量值<5)堿基數(shù)比例大于50%、含有接頭污染的序列,最終得到高質(zhì)量的clean reads用于后續(xù)分析。

1.3 轉錄組從頭組裝

使用Trinity(Haasetal.,2013)對過濾后的clean reads進行denovo組裝,僅輸出片段長度大于300 bp的contig序列。由于Trinity組裝獲得的轉錄組中通常含有大量相似的冗余序列,故最后使用Cd-hit-est (Li & Godzik,2006)去除冗余序列,得到非冗余轉錄本用于后續(xù)分析。

1.4 功能注釋

為了獲得較為全面的基因功能信息,利用blastx(Camachoetal.,2009)將Unigene與NCBI非冗余蛋白質(zhì)(NR)數(shù)據(jù)庫、euKaryotic Ortholog Groups(KOG)數(shù)據(jù)庫、Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫進行比對,E值設為1E-5。再根據(jù)NR數(shù)據(jù)庫的比對結果進行Gene Ontology(GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)注釋的分類統(tǒng)計,分別通過在線工具Web Gene Ontology Annotation Plot(WEGO)(Yeetal.,2006)和KEGG Automatic Annotation Server(KAAS)完成(Moriyaetal.,2007)。在使用WEGO進行分類統(tǒng)計之前,需先將轉錄本與NR數(shù)據(jù)庫比對的結果導入Blast2GO(Conesaetal.,2005)搜索相關的GO功能條目。

1.5 轉錄本的表達量和組織特異性分析

2 結果

2.1 測序和質(zhì)控

共獲得171 370 884條150 bp的raw reads,共計51.4 Gb。質(zhì)控過濾后得到154 489 126條(90.15%)clean reads,共計45.42 Gb,每個組織的數(shù)據(jù)量為5.54~13.46 Gb(表1),表明測序數(shù)據(jù)質(zhì)量符合要求。

表1 測序結果和質(zhì)量控制Table 1 Summary of sequencing and quality control

2.2 轉錄組從頭組裝

使用Trinity將clean reads進行denovo組裝,最終得到369 246條轉錄本,轉錄本長度301~31 696 bp,平均長度1 465 bp,Contig N50為2 660 bp(表2)。拼接的序列中,155 985條(42.24%)序列長度在1 000 bp以上,組裝質(zhì)量較高。大多數(shù)轉錄本長度為300~400 bp和1 000~2 000 bp(圖1)。使用Cd-hit-est對Trinity組裝的轉錄本去冗余,最終得到269 412條非冗余轉錄本用于注釋分析。

表2 豹貓轉錄組組裝結果Table 2 Summary of transcriptome assembly of Prionailurus bengalensis

2.3 轉錄本的功能注釋

使用blastx將去冗余后的轉錄本與NR、Swiss-Prot、KOG和KEGG 4個公共數(shù)據(jù)進行同源性比對注釋。NR蛋白數(shù)據(jù)庫注釋到轉錄本110 997條(41.13%);Swiss-Prot蛋白數(shù)據(jù)庫注釋到轉錄本 98 192條(36.39%);KOG數(shù)據(jù)庫注釋到轉錄本97 616條(36.17%);KEGG數(shù)據(jù)庫獲得注釋信息轉錄本65 895條(24.42%)。4個數(shù)據(jù)庫注釋結果的韋恩圖顯示,共注釋到轉錄本114 517條(42.44%),63 860 條轉錄本在所有數(shù)據(jù)庫中都有注釋(圖2:A)。

NR數(shù)據(jù)庫比對表明,73%的序列有較強的同源性(E值≤1.0E-30),其中,25%的序列比對E值為0,39%的為0~1.0E-45,9%的為1.0E-45~1.0E-30(圖2:B)。相似度分布顯示,83%的序列比對相似度≥80%,僅有17%的為30%~80%(圖2:C)。物種間比對結果顯示,豹貓的轉錄本與貓科動物的相似性高,約49%的序列與貓科動物基因組(家貓:23%,金錢豹Pantherapardus:13%,獵豹Acinoyxjubatus:8%,虎Pantheratigris:5%)己經(jīng)注釋的基因同源(圖2:D)。

轉錄本的GO富集顯示,33 262條轉錄本注釋到247 376個GO功能條目(圖3:A),包括生物過程(113 399條,45.84%)、分子功能(37 773條,15.27%)和細胞組分(96 204條,38.89%)。生物過程中,細胞過程(20 431條)、代謝過程(16 659條)和生物調(diào)節(jié)(12 227條)最多;細胞組分中,細胞(18 428條)、細胞部分(18 261條)和細胞器(13 859條)最豐富;分子功能中,最豐富的為連接(18 061條)和催化活性(11 917條)。

根據(jù)同源性比對KOG數(shù)據(jù)庫,97 616條(36.17%)轉錄本分別在25種類別中被注釋到(E值≤1E-5)(圖3:B),信號轉導機制和一般功能預測的轉錄本最多,其次是翻譯后修飾、蛋白轉換、分子伴侶和轉錄。

KEGG注釋結果顯示有65 895條(24.42%)轉錄本被分配到386個KEGG通路上,其中與人類疾病相關的轉錄本(26 761條)最多,其次是生物系統(tǒng)(22 997條)(圖3:C)。在二級分類中,參與信號轉導的轉錄本(10 039條)和傳染?。翰《?10 003條)的轉錄本數(shù)量最多。

2.4 轉錄本的組織特異性表達

轉錄本TSI值的頻數(shù)分布圖顯示(圖4:A),僅17條轉錄本TSI值<0.15,它們在所有6個組織中表達差異很小,為低組織特異性基因,其中可能包括了一些重要的管家基因;而39.65%(66 763條)的轉錄本TSI值在0.15~0.85之間,為中等組織特異性基因,它們的表達量在各組織中存在差異,TSI值越大差異越大;60.34%的轉錄本TSI值>0.85,為高組織特異性基因,其在部分組織中的表達與其他組織存在明顯差異,其中24.5%(41 354條)的轉錄本TSI值達到1.0,它們嚴格地在特定的某一種組織中表達。由表達量熱圖(圖4:B)可見,這3類轉錄本在各組織中的表達模式不同。

2.5 各組織高表達轉錄本

為了解這些組織特異表達基因是否為各組織高表達基因,統(tǒng)計了6個組織中表達量最高的10條轉錄本(表3),共包括39條轉錄本,其TSI值為0.48~1.0(平均0.83)。其中骨骼肌中10條轉錄本FPKM值均超過10 000,而腦組織中9條轉錄本FPKM值為1 213.09~3 074.01,僅1條>10 000,顯示不同組織中基因表達量差異較大。這些轉錄本中,6條轉錄本(T_90962_c0_g2_i7、T_92170_c4_g8_i1、T_92170_c4_g7_i1、T_90443_c2_g7_i2、T_92619_c3_g1_i2和T_87893_c2_g3_i5)在骨骼肌和心臟中高表達,4條轉錄本(T_90962_c0_g2_i7、T_84299_c4_g5_i2、T_92588_c6_g2_i6和T_92288_c9_g4_i1)在腎臟和肝臟中高表達。39條轉錄本中26條(61.5%)為高組織特異性表達,包括8條在骨骼肌中高表達,7條在肺中高表達,6條在肝臟中高表達,腎臟、心臟、大腦中高表達的分別有5條、4條、3條;其他13個高表達轉錄本的組織特異性較低,如COX1在除肺以外的5個組織中都高表達。

表3 豹貓6個組織中表達量最高的10條轉錄本的NR注釋結果及其組織特異性Table 3 NR annotation of the top 10 transcripts with the highest FPKM value in the 6 tissues of Prionailurus bengalensis and TSI analysis

續(xù)表3

3 討論

作為一種分布廣泛的小型貓科動物,過去關于豹貓的研究大多關注其種群分布、遺傳多樣性水平和系統(tǒng)發(fā)育關系等(Mukherjeeetal.,2010;Pateletal.,2017)。Ito等(2020)基于基因組SNP分析了豹貓遺傳多樣性,Bredemeyer等(2021)報道了豹貓的全基因組,但迄今為止關于豹貓基因表達調(diào)控相關研究仍非常缺乏。本研究采用RNA-seq對豹貓6個組織的轉錄組進行了測序、從頭組裝、功能注釋及不同組織的基因表達譜分析,從而為豐富豹貓的遺傳資源、輔助基因組注釋、開發(fā)分子標記等提供了重要數(shù)據(jù),也對于理解豹貓的基因表達調(diào)控,開展保護遺傳學研究奠定了基礎。

本研究基于豹貓6個組織的大量轉錄本從頭組裝了豹貓轉錄組,能更全面地體現(xiàn)豹貓基因表達情況,組裝質(zhì)量良好:N50長度為2 660 bp,42.24%的轉錄本長度超過1 000 bp。研究顯示,越長的轉錄本序列越完整,組裝質(zhì)量越高,更容易獲得較多關于基因的信息(Mengetal.,2015)。與發(fā)表的東北虎Pantheratigrisaltaica肺轉錄組(319 bp)和6個組織合并轉錄本(332 bp)(Luetal.,2016)、小尾寒羊和杜泊羊骨骼肌轉錄組(735 bp和706 bp)(張春蘭,2016)、梭子蟹Portunustrituberculatus雌性(954 bp)和雄性(823 bp)(Wangetal.,2018)轉錄組序列平均長度相比,豹貓轉錄組質(zhì)量更高。GO、KOG和KEGG注釋結果顯示出豹貓各組織表達不同生理功能相關的多種基因。僅有42.44%(114 517條)的豹貓轉錄本具有注釋信息,超過50%的轉錄本無法比對到現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫,這可能是由于豹貓的基因組和蛋白質(zhì)相關信息仍不完善,大量轉錄本可能是豹貓?zhí)赜械霓D錄本,深入研究這些新轉錄本可揭示豹貓獨特的生理、遺傳特征。

豹貓6個組織的TSI分布顯示,TSI<0.15的管家基因最少,僅17條(0.01%),60.34%的轉錄本TSI>0.85,其表達具有高度組織特異性。這顯示盡管共有同一個基因組,但豹貓在不同組織中的基因轉錄和表達卻存在很大差異,以保障不同組織執(zhí)行不同的生理功能。Su等(2002)統(tǒng)計老鼠45個正常組織、Yanni等(2005)統(tǒng)計人類Homosapiens12種組織的TSI也顯示,TSI值為0.9~1.0的高組織特異性表達基因最多,這與本研究結果一致。但不同的是,人類中57%、老鼠中56%的基因都屬于中等組織特異性表達,即0.15≤TSI≤0.85。這可能是由于轉錄本注釋質(zhì)量的差異。人和老鼠具有高質(zhì)量基因組,轉錄本注釋完善,而豹貓缺乏相關的基因組和蛋白質(zhì)信息,本研究從頭組裝的轉錄本高達26萬余條,許多轉錄本并非全長基因,存在大量難以注釋的短序列。

為進一步了解這些組織特異性表達的基因是否也是高表達的基因,統(tǒng)計了豹貓每個組織中表達量最高的前10條轉錄本。共計39個高表達的基因中,26個都屬于在特定組織高表達的基因,這些基因都是與該組織特定功能密切相關的重要基因。如肝臟中特異高表達的RBP4與肝臟的脂肪降解功能相關,人的多組織基因表達圖譜也顯示該基因在肝臟和脂肪中特異表達(Fagerbergetal.,2014)。肺中特異高表達的SFTPC編碼肺表面活性物質(zhì)蛋白C,它通過降低覆蓋肺部的液體的表面張力來維持肺組織的穩(wěn)定性,SFTPC突變能引發(fā)嬰幼兒間質(zhì)性肺病,其過表達可抑制肺癌細胞的增殖(Hayasakaetal.,2018;Lietal.,2019)。大腦中特異高表達的PCP4與神經(jīng)元的功能相關,小鼠胚胎發(fā)生過程中PCP4的過表達誘導神經(jīng)元提前分化成熟,而在成年期過表達會導致小鼠學習障礙(Mouton-Ligeretal.,2014;Reneltetal.,2014)。此外我們還鑒定了不同組織共同高表達的基因。如COX1編碼細胞色素c氧化酶Ⅰ,是線粒體呼吸鏈的末端組分,該酶可將電子從還原的細胞色素c轉移到分子氧,并有助于維持線粒體內(nèi)膜的電化學梯度(Baklouti-Gargourietal.,2013),為ATP合成酶合成ATP提供電化學梯度(Dennerlein & Rehling,2015),是細胞呼吸過程中重要的功能基因。COX1在心臟、肝臟、腎臟、大腦和骨骼肌中都是表達量前10的基因,在肺中的表達量也相對較高,證明該基因在各個組織中均發(fā)揮重要生理功能。TMSB4是一種廣泛分布于真核細胞中的多功能肽,與細胞的移動性、分化能力及細胞分裂密切相關(Kuzan,2016)。TMSB4是肺、腎臟和大腦組織中共同高表達的基因,Du等(2015)發(fā)現(xiàn)其在大熊貓血液中也是高表達的基因之一,它可能也是維持細胞基本生理功能的重要基因。心臟和骨骼肌都屬于肌肉組織,具有收縮性,本研究還鑒定到6條僅在心臟和骨骼肌中高表達轉錄本,這些轉錄本可能和肌肉組織的收縮功能密切相關。之前人類不同組織的基因表達譜研究也顯示心臟和骨骼肌的表達譜相似性高(Shmuelietal.,2003)。此外腎臟和肝臟組織共同高表達的轉錄本有4條,這可能源于肝臟和腎臟之間有密切相關的生理功能。

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