朱燁婷 華金渭 盛云杰 王詩語 秦路平 朱 波

三葉青（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg）為葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤，是我國特有的珍稀藥用植物[1]。三葉青主要分布于我國浙江、福建、廣西、云南等地，以地下塊根入藥，具有清熱解毒、活血散結、消炎止痛、祛風化痰、理氣健脾等功效，常用于小兒高熱驚厥、痢疾、支氣管炎、肺炎、咽喉炎、肝炎、病毒性腦膜炎、毒蛇咬傷、扁桃體炎、跌打損傷等疾病的治療[2]。現代藥理學及化學成分研究表明，其主要活性成分為黃酮類[3]、有機酸類[4]、酚類[5]及揮發(fā)油類[6]等，具有增強免疫[7]、保肝護肝[8]、抗腫瘤[9]、抗炎[10]、抗病毒[11]等作用。三葉青現有報道多集中在化學成分分離鑒定[12]、栽培技術[13]、分子標記[14]等方面，而對于以有效成分為主要參考指標評價不同種質三葉青的質量鮮有報道。三葉青野生資源稀缺，近年來各地均開展人工栽培馴化，不同產地的三葉青外觀性狀、藥理活性、產量及價格均差異懸殊，三葉青化學成分的差異會影響三葉青藥材質量以及臨床用藥療效。三葉青中黃酮類和多糖類化合物的含量遠高于其他化學物質，黃酮類具有抗氧化、降血糖、抗菌消炎等多種生理活性[15]。本試驗收集全國三葉青主產區(qū)20個種質資源，建立同時測定塊根中蘆丁、異槲皮苷與山奈酚-3-O-蕓香糖苷的超高效液相色譜（ultra-performance liquid chromatography，UPLC）方法，并分析其與生境因子間的相關性，為三葉青質量控制和資源合理利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料、試劑與儀器 采集浙江、湖南、廣西、江西、湖北、貴州、重慶等8省20個產地新鮮健康三葉青塊根，經浙江中醫(yī)藥大學張巧艷教授鑒定為葡萄科三葉青Tetrastigma hemsleyanum（見表1）。標準品：異槲皮苷（B21529）、山奈酚-3-O-蕓香糖苷（B21133），福林酚試劑（S30000）均購自上海源葉生物科技有限公司，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、碳酸鈉等試劑購自杭州木木生物科技有限公司，色譜級甲醇、乙腈購自上海百靈威化學技術有限公司，其他試劑為分析純。實驗儀器：Waters 超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；Milli-Q-Academic 超純水儀（美國Millipore 公司）；DHG-9031A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海森信試驗儀器有限公司）；D37520 快速離心機（德國Heraeus 公司）；MA110 型電子天平(上海第三分析儀器廠)；RE-2000 旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；YQ-1002C 型超聲波清洗機（上海易凈超聲波儀器有限公司）；FW100 高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市瑞德儀器設備有限公司）。

表1 樣品信息

1.2 蘆丁、異槲皮苷與山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量測定

1.2.1 樣品溶液制備與含量測定 稱取樣品粉末2g至100mL 燒瓶，加入40mL 80%甲醇室溫超聲提取10min，抽濾旋干，用30%甲醇定容至2mL 容量瓶，0.45μm 濾膜過濾，待用。

1.2.2 色譜條件 Waters UPLC 色譜柱，BEHC18（2.1×150mm，1.7μm）；流動相為甲醇與0.1%甲酸水，采用梯度洗脫；柱溫45℃；檢測波長300nm；流速0.25mL/min；進樣量1μL。

1.2.3 線性關系考察 配制質量濃度為0.2mg/mL的蘆丁、異槲皮苷與山奈酚-3-O-蕓香糖苷混合對照品溶液，分別采用原液、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32 稀釋液，在上述色譜條件下測定峰面積，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，結果見表2。

表2 蘆丁、異槲皮苷與山奈酚-3-O-蕓香糖苷線性關系考察

1.2.4 精密度試驗 取同一混合標準品溶液，按照線性關系考察方法測定光密度（optical density，OD）值，連續(xù)測定6 次，測得蘆丁、異槲皮苷與山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）值分別為0.42%、1.10%與0.66%，儀器精密度良好。

1.2.5 重復性試驗 取重慶梁平樣品6 份，按照樣品溶液制備與含量測定方法測定OD 值，得樣品平均蘆丁、異槲皮苷與山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量為0.0160、0.0115、0.0297mg/g，RSD值分別為1.99%、2.01%、1.66%，試驗重復性良好。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗 取重慶梁平樣品，按照“1.2.1”方法制備樣品溶液，室溫避光保存，分別在1、2、4、6、8、10、12、24h 測定OD 值，計算得蘆丁、異槲皮苷與山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量RSD 值分別為0.82%、0.95%、1.10%與1.43%，表明樣品溶液在室溫避光保存24h 內穩(wěn)定。

1.2.7 加樣回收率試驗 取重慶梁平樣品6 份，加入質量分數為0.02mg/mL 的蘆丁、異槲皮苷與山奈酚-3-O-蕓香糖苷混合對照品溶液1mL，按照上述樣品制備方法與色譜條件下測定峰面積，計算加樣回收率（%）=（C-A）/B×100%，A 為樣品各成分含量，B 為加入對照品含量，C 為實際測得含量。結果顯示，蘆丁、異槲皮苷與山奈酚-3-O-蕓香糖苷平均回收率分別為98.39%、101.16%與98.96%，RSD 值分別為3.79%、3.54%與3.35%。見表3。

表3 加樣回收率試驗（n=6）

1.3 清除DPPH 自由基能力測定 精密稱取樣品粉末1g 至水解管，加20mL 甲醇80%超聲10min，過濾定容至25mL 容量瓶，將母液稀釋成25、12.5、10、6.25、5、3.125、2.5、1.25、0.625、0.5mg/mL的樣品溶液，進行清除DPPH 自由基的抗氧化能力測定。配制0.1mol/L 的DPPH 溶液，利用DPPH 溶液特征紫紅色團在波長517nm 下有最大吸收，并在加入抗氧化劑提取物后出現吸收下降的表現，表示其對有機自由基的清除能力。按照公式計算DPPH 清除率，清除率=[1-（A1-A0）/ACK]×100%，A1 為1mL 樣品＋1mL DPPH 的OD 值，A0 為1mL 樣品＋1mL 無水乙醇的OD 值，ACK 為1mL 溶劑＋1mL DPPH 的OD 值。用SPSS 17.0 軟件回歸擬合不同濃度醇溶性成分的清除DPPH 自由基能力函數曲線，采用Probit 模型，以清除DPPH 自由基能力為響應頻率，觀測值匯總為1，樣品濃度為協(xié)變量進行模型分析，以置信限制中概率為0.50 時的濃度作為半抑制率（IC50 值）[16]。

圖1 超高效液相色譜圖

1.4 統(tǒng)計學方法 應用Excel 2007 對數據進行整理與相關性分析；應用SPSS 17.0 軟件處理數據，采用單因素analysis of variance（ANOVA）法分析，兩兩比較采用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD），P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義；應用DPS 9.05 軟件進行系統(tǒng)聚類分析，根據歐氏距離采用類平均法（unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA）[17]。

2 結果與分析

2.1 三葉青中3種黃酮苷含量及清除DPPH 自由基能力比較 不同產地三葉青塊根中蘆丁、異槲皮苷與山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量存在差異（P<0.01），平均含量分別為0.0058、0.0059、0.0127mg/g。其中，廣西田林三葉青蘆丁含量最高，達0.0302mg/g，但有11個樣品未檢測到蘆丁含量；福建建陽三葉青異槲皮苷含量最高，為0.0135mg/g，有4個樣品未檢測到異槲皮苷含量；廣西樂業(yè)三葉青山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量最高，為0.0463mg/g，全部樣品均能檢測到山奈酚-3-O-蕓香糖苷，其變幅為0.0014～0.0463mg/g。不同產地三葉青塊根醇提物對DPPH 自由基均有一定的清除作用，但存在差異，其中浙江景寧與福建建陽三葉青清除DPPH 自由基能力最強，IC50 值均為0.683mg/mL，湖南懷化種質清除DPPH 自由基能力最弱，IC50 值為19.624mg/mL。見表4。

表4 不同產地三葉青蘆丁、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量與IC50 值比較（n=3）

2.2 黃酮苷含量與農藝性狀、生境因子的相關性三葉青塊根中3種黃酮苷含量與塊根農藝性狀、生境因子間存在相關性（見表5），與塊根縱徑、塊根橫徑、塊根重、海拔呈正相關關系，其中異槲皮苷含量與塊莖橫徑呈最大正相關，相關系數達0.7046；與塊根縱橫徑比、經度、緯度呈負相關關系，其中異槲皮苷含量與經度呈最大負相關，相關系數為-0.7151。相關性分析顯示，低經緯度、高海拔地區(qū)種植三葉青，有利于其塊根中黃酮苷含量積累。

表5 三葉青黃酮苷含量與生長性狀、生境因子的相關性分析

2.3 聚類分析 以塊根生長性狀、黃酮苷含量為指標，對20個三葉青樣品進行聚類分析，并按照D2=18.96 的聚類水平將20個三葉青樣品劃分為4 類（見圖2）。第Ⅰ類群共8個種質，以浙江種質為主，分別為浙江蓮都1、浙江蓮都2、浙江慶元、湖南懷化、浙江景寧、浙江遂昌、浙江青田、浙江黃巖，該類群植株葉片小而狹長或寬鈍，顏色深綠背部無柔毛，莖較細，圓柱形，根系較發(fā)達，塊根小，表面多光滑，黃酮苷含量較低；第Ⅱ類群共4個種質，福建建陽、湖北咸豐、江西弋陽與浙江泰順，該類群植株葉片較寬鈍，莖較粗，方形或少圓形，塊根中等大小，表面褶皺或光滑，黃酮苷含量除福建建陽樣品外，其余樣品含量較低；第Ⅲ類群共4個種質，以廣西樣品為主，分別為廣西田林、樂業(yè)、天峨和重慶梁平，該類群三葉青葉片較大而狹長或寬鈍，顏色多淺綠背部有柔毛，莖較粗，方形，根系發(fā)達，塊根大，黃酮苷含量較高；第Ⅳ類群共4個種質，分別為貴州赤水、重慶綦江、廣西鐘山與湖南汝城，該類群三葉青植株形態(tài)與第Ⅲ類群類似，塊根較大，黃酮苷含量較低。

圖2 聚類分析圖

3 小 結

目前市場上三葉青藥材野生資源日益匱乏，人工栽培條件受限，栽培種質混亂，不同產地三葉青在生長性狀、有效成分含量等方面存在差異，故收集并評價不同產地三葉青有效成分含量對三葉青良種選育與高產栽培具有重要意義。藥用植物在長期適應環(huán)境的過程中，通過調控次生代謝產物的積累，抵抗害蟲、物理、化學等生物性與非生物性環(huán)境因子脅迫，其生物學性狀、生態(tài)適應性、農藝性狀、藥效成分等受自身遺傳與環(huán)境因子雙重影響，產地、經緯度、海拔、氣候條件等環(huán)境因子是影響中藥材生長與藥效成分含量積累的重要因素[18]。本實驗結果表明，20個三葉青種質的塊根中蘆丁、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷含量存在差異，其中重慶、福建、廣西三葉青黃酮苷含量較高，貴州次之，浙江、湖北、湖南、江西較低；塊根中黃酮苷含量與塊根生長性狀、生境因子間存在相關性，與塊根縱徑、塊根橫徑、塊根重、海拔呈正相關關系，與塊根縱橫徑比、經度、緯度呈負相關關系，結果提示三葉青優(yōu)良種質篩選可優(yōu)先在低經緯度、高海拔地區(qū)種植的重慶、福建、廣西種質中選擇。

中藥材實際栽培應綜合考慮有效成分含量、藥材產量、種質生態(tài)適應性差異、立地條件優(yōu)劣等多方面因素。單一指標含量高低并不能明確評價藥材質量優(yōu)劣，因此，盡快統(tǒng)一三葉青藥材含量評價指標，建立三葉青藥材化學成分指紋圖譜，并綜合藥效學、藥代動力學等建立三葉青藥材質量評價體系，是促進三葉青產業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的關鍵。綜合生長性狀與黃酮苷含量，初步篩選出重慶綦江、重慶梁平、廣西樂業(yè)、廣西田林、福建建陽5個三葉青優(yōu)良種質，生長勢好，塊根中黃酮苷含量高，下一步可優(yōu)先對初篩優(yōu)良種質進行同一栽培區(qū)域內的大田育種試驗。三葉青分布地域廣，本實驗收集了20個產地種質資源，其中如福建、貴州、江西等地種質，僅收集到1個樣品，代表性弱，后續(xù)工作將加強對福建、貴州、江西等地三葉青的種質資源收集與評價，以期為三葉青種質資源利用與優(yōu)良品種選育提供科學依據。