孫敬文 尹晗 安雪暉 何世欽3 孫月 陳禹竹

摘要 [目的]研究木質(zhì)素對土壤微生物的影響，為木質(zhì)素后期的資源化利用提供一定的基礎(chǔ)資料。[方法]采集農(nóng)田土壤進行培養(yǎng)試驗，設(shè)置空白對照和木質(zhì)素處理組，培養(yǎng)結(jié)束后提取土壤DNA，結(jié)合定量PCR和高通量測序等技術(shù)，研究木質(zhì)素對土壤微生物的影響，對微生物的群落組成及多樣性進行分析。[結(jié)果]定量PCR結(jié)果表明，木質(zhì)素的加入減少了細菌16S rRNA基因豐度，且顯著降低了真菌18S rRNA基因豐度。高通量測序結(jié)果顯示，Alpha多樣性分析上，細菌的空白對照多樣性指數(shù)均高于木質(zhì)素處理，真菌則相反，但均未達顯著水平;PCoA分析表明，木質(zhì)素的加入對細菌和真菌群落均產(chǎn)生了顯著影響，不同處理間的群落結(jié)構(gòu)差異較大。在門水平上對微生物群落組成分析表明，木質(zhì)素的加入顯著提高了細菌中γ-變形菌、擬桿菌、厚壁菌的相對豐度，降低了酸桿菌、放線菌、δ-變形菌的相對豐度;真菌中明顯增加了擔子菌、被孢霉菌的相對豐度，而降低了子囊菌的相對豐度。[結(jié)論]木質(zhì)素的加入對土壤中細菌、真菌的數(shù)量及群落結(jié)構(gòu)均產(chǎn)生了一定影響?？傮w上，木質(zhì)素不利于土壤微生物群落的生長繁殖和代謝。由于對木質(zhì)素的利用能力不同，不同微生物呈現(xiàn)出了不同的效果。

關(guān)鍵詞 木質(zhì)素;土壤微生物;定量PCR;高通量測序

中圖分類號 S 154.3? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）18-0156-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.18.038

開放科學（資源服務(wù)）標識碼（OSID）：

Effect of Exogenous Lignin on Farmland Soil Microorganisms

SUN Jing-wen1，YIN Han1，AN Xue-hui2 et al

（1. PowerChina Roadbridge Group Co.， Ltd.， Beijing 100048; 2. School of Civil Engineering， Tsinghua University， Beijing 100084）

Abstract [Objective] To study the effect of lignin on soil microorganisms， and to provide some basic information for the utilization of lignin as a resource in future. [Method] Collecting the farmland soil for cultivation experiment， control group and lignin treatment group were set up. Soil DNA was extracted after cultivation. Combined with methods such as quantitative PCR and high-throughput sequencing， the effects of lignin on the composition and diversity of soil microorganism and communities were studied. [Result] Quantitative PCR results showed that the addition of lignin reduced the gene expression abundance of bacterial 16S rRNA， and reduced the abundance of fungal 18S rRNA gene expression significantly. The results of high-throughput sequencing showed that in the Alpha diversity analysis， the diversity index of bacteria for the control group was higher than that of lignin treatment group， while that of fungi was the opposite， but they did not reach a significant level. The PCoA analysis showed that the addition of lignin had an effect on bacteria and fungi. The communities all had a significant impact， and the community structure differed greatly among different treatments. The analysis of the microbial community composition at the phylum level showed that the addition of lignin significantly increased the relative abundance of Gammaproteobacteria， Bacteroides， and Firmicutes for the bacteria， and reduced Acidobacteria， Actinobacteria， and Deltaproteobacteria. For the fungi， the relative abundance of Basidiomycota and Mortierellomycota was increased significantly， but the relative abundance of Ascomycota was decreased. [Conclusion] The addition of lignin has a certain impact on the copy number of microorganisms and community structure of bacteria and fungi in the soil. On the whole， lignin is not conducive to the growth and metabolism of soil microbial communities. Due to the different utilization capacity of lignin， some microorganisms show different effects.

Key words Lignin;Soil microorganism;Quantitative PCR;High-throughput sequencing

基金項目 中電建路橋集團有限公司科技項目“海綿型城市廣場透水鋪裝與雨水花園關(guān)鍵技術(shù)開發(fā)”。

作者簡介 孫敬文（1983—），男，山東德州人，工程師，從事巖土工程管理研究。*通信作者，碩士，從事環(huán)境微生物研究。

收稿日期 2021-01-08

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，在土壤有機質(zhì)分解、土壤營養(yǎng)轉(zhuǎn)化和循環(huán)、植物生長的促進或抑制以及各種土壤物理過程中，發(fā)揮重要作用[1]。土壤微生物在生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化中占有重要地位，當土壤環(huán)境發(fā)生變化時，微生物能快速作出反應(yīng)，是土壤環(huán)境質(zhì)量評價不可缺少的重要生物學指標[2]。土壤微生物會與所種植物根系形成一個穩(wěn)定的動態(tài)系統(tǒng)，在這個系統(tǒng)中它們相互作用、相互影響。植物根系為土壤微生物提供養(yǎng)分，土壤微生物反過來也促進植物根系的發(fā)育，從而促進了植物的生長[3]。合理利用土壤微生物，充分發(fā)揮土壤微生物的優(yōu)勢，對促進植物生長、提高作物產(chǎn)量的作用是不可估量的。

木質(zhì)素是一種存在于大部分陸地植物木質(zhì)部中的復(fù)雜

高分子化合物，是植物骨架的主要成分，在自然界非常豐富，在數(shù)量上僅次于纖維素[4]。木質(zhì)素的來源非常廣泛，由于其是植物的主要成分，我國又是一個農(nóng)業(yè)大國，每年會產(chǎn)生大量的植物纖維性廢棄物，包括秸稈、雜草、落葉等，都含有木質(zhì)素[5]。工業(yè)木質(zhì)素的來源主要是紙漿生產(chǎn)的副產(chǎn)物，分為堿木質(zhì)素和木質(zhì)素磺酸鹽兩大類[6]。近年來，人們開始逐漸開發(fā)和利用木質(zhì)素，已發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素可以作為土壤的改良劑和修復(fù)劑[7]，也可以作為肥料與氮肥配施[8]。另外，其作為共代謝底物時，也可以刺激土壤微生物促進多環(huán)芳烴污染物的降解[9]。但目前，人們對木質(zhì)素的利用才開始，利用率仍較低，在實際修復(fù)及應(yīng)用中也存在一定的局限性[9-10]。因此全面了解木質(zhì)素的作用機制，以及更合理地利用木質(zhì)素對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護都具有重要意義。筆者通過設(shè)立培養(yǎng)試驗，添加木質(zhì)素處理組，并利用定量PCR和高通量測序等技術(shù)，研究外源添加木質(zhì)素對土壤微生物基因豐度、群落組成及多樣性的影響，評估木質(zhì)素對土壤微生物的影響，以期為后續(xù)木質(zhì)素的資源化利用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品

采集江蘇省南京市西南郊農(nóng)田表層土壤，土樣放置于室溫下自然風干，過2 mm篩。土壤基本理化性質(zhì)：pH 6.84，有機質(zhì)含量12.7 g/kg，總氮1.3 g/kg，全磷0.57 g/kg，全鉀19.3 g/kg。

1.2 主要試劑與儀器

堿木質(zhì)素（Lignin），美國Sigma-Aldrich試劑公司;引物，上海英駿生物技術(shù)有限公司;FastDNA SPIN Kit for Soils試劑盒，美國MP Biomedicals公司;Top Green qPCR SuperMix（SYBR Green），北京全式金生物技術(shù)有限公司。

熒光定量基因擴增儀，德國Analytik Jena公司;NanoDrop超微量分光光度計，美國Thermo Fisher公司;Illumina MiSeq高通量測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.3 試驗設(shè)計

利用黑麥草盆栽進行培養(yǎng)試驗，設(shè)置空白對照組和木質(zhì)素處理組，每個處理4個重復(fù)。每盆加入2 kg土壤，處理組在土壤中加入木質(zhì)素，充分混勻使其終濃度為8 g/kg。培養(yǎng)90 d后，收集土壤樣品，每盆用不銹鋼土鉆隨機取5個點混合，置于-20 ℃保存以供微生物分析。

1.4 土壤DNA提取

取0.5 g土壤，使用FastDNA SPIN Kit for Soils試劑盒，按照試劑盒說明書進行操作。并用NanoDrop儀器測定DNA的濃度和純度，提取完成后保存于-20 ℃。

1.5 定量PCR

采用定量PCR方法測定樣品中細菌16S rRNA基因和真菌18S rRNA基因。土壤樣品總DNA稀釋至10-1濃度，作為定量模板，定量PCR反應(yīng)體系（20 μL）：Top Green qPCR SuperMix（SYBR Green）10 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.4 μL，ddH 2O 7.2 μL，模板DNA 2.0 μL。采用細菌16S rRNA基因序列PCR通用引物Eub338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和Eub518R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）[11]，擴增目的片段。定量PCR擴增程序：95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環(huán);72 ℃ 10 min。采用真菌18S rRNA基因序列PCR通用引物nu-SSU-0817（5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′）和nu-SSU-1536（5′-ATTGCAATGCYCTATCCCCA-3′）[12]，擴增目的片段。定量PCR擴增程序：94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環(huán);72 ℃ 10 min。

1.6 高通量測序數(shù)據(jù)分析

高通量測序得到的原始數(shù)據(jù)使用QIIME（V1.9.1）和USEARCH（V8.1.1861）流程進行分析，序列經(jīng)拼接、過濾和質(zhì)控后，在97%相似性水平劃分操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU），細菌序列通過與SILVA數(shù)據(jù)庫（https：//www.arb-silva.de）比對確定系統(tǒng)學分類，真菌序列通過與Unite數(shù)據(jù)庫（http：//unite.ut.ee/）比對確定系統(tǒng)學分類，得到每個樣品的OTUs和物種注釋的基本分析結(jié)果，同時對物種注釋在各個分類水平上進行組成結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計分析。再對OTUs豐度、多樣性指數(shù)等進行分析。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20、Graphpad Prism 8.0，Excel 2016和R-Studio進行整理、分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因豐度

定量PCR測定結(jié)果見圖1。2種處理中，細菌16S rRNA的基因拷貝數(shù)均在1.6×109 copies/g左右，木質(zhì)素處理下的細菌16S rDNA基因拷貝數(shù)略少于對照，但未達顯著水平;對照處理中的真菌18S rRNA基因拷貝數(shù)為8.43×106 copies/g，木質(zhì)素處理下的真菌18S rRNA基因拷貝數(shù)為3.78×106 copies/g，木質(zhì)素處理顯著降低了真菌18S rRNA基因拷貝數(shù)。

2.2 微生物群落分析

在細菌16S rRNA基因的高通量測序中，2種處理8個樣品一共獲得20萬條序列，經(jīng)質(zhì)量控制，單個樣品的序列數(shù)在11 920～36 307，在97%序列相似性水平獲得9 139個OTU。在真菌18S rRNA基因的高通量測序中，2種處理8個樣品一共獲得45萬條序列，經(jīng)質(zhì)量控制，單個樣品的序列數(shù)在42 154～73 266，在97%序列相似性水平獲得1 750個OTU。

2.2.1 微生物群落的Alpha多樣性分析。

對2種處理的樣品在97%相似性閾值水平下的Alpha多樣性分析指數(shù)進行統(tǒng)計，結(jié)果見圖2。對2種處理得到的細菌Alpha多樣性分析發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素處理下各樣品的多樣性指數(shù)均小于空白對照。而真菌Alpha多樣性分析則相反，木質(zhì)素處理下各樣品的多樣性指數(shù)均高于空白對照。2組樣品均未達顯著水平。

2.2.2 微生物群落的PCoA分析。

在OUT水平上基于Bray-Curtis距離對對照組與木質(zhì)素處理組進行了PCoA分析。由圖3可知，細菌群落中，對照組的樣品能夠緊密地聚集在一起，且明顯與木質(zhì)素處理的樣品分開（P<0.05）;真菌群落中對照組與木質(zhì)素處理組的樣品分布較為集中，且2組樣品能明顯地分開（P<0.05）。木質(zhì)素的加入使微生物的群落組成發(fā)生了變化，說明木質(zhì)素會對微生物群落產(chǎn)生影響。

2.2.3 微生物在門水平上的相對分布。

對細菌中相對豐度大于1%的門進行分析，結(jié)果見圖4A。在對照處理中，主要細菌門類包括γ-變形菌（Gammaproteobacteria）、酸桿菌（Acidobacteria）、α-變形菌（Alphaproteobacteria）、放線菌（Actinobacteria），分別占24.28%、21.75%、14.73%、9.61%。加入木質(zhì)素的處理明顯提高了γ-變形菌、擬桿菌（Bacteroidetes）、厚壁菌（Firmicutes）的相對豐度，分別達45.73%、8.77%、3.14%;明顯降低了土壤中酸桿菌、放線菌、δ-變形菌（Deltaproteobacteria）的相對豐度，分別為12.14%、4.06%、2.93%。

對真菌中相對豐度大于2%的門進行分析，結(jié)果見圖4B。在對照處理中，主要真菌門類包括子囊菌（Ascomycota）、被孢霉菌（Mortierellomycota）、梳霉菌（Kickxellomycota）、擔子菌（Basidiomycota），分別占比73.38%、14.09%、4.73%、2.35%。木質(zhì)素的加入明顯增加了擔子菌、被孢霉門的相對豐度，達12.37%、20.32%;降低了子囊菌的相對豐度，為55.13%。

2.2.4 LefSe分析。

將木質(zhì)素處理與對照處理進行LefSe分析，結(jié)果見圖5。圖中的結(jié)點從內(nèi)圈至外圈代表細菌的各分類水平（界、門、綱、目、科、屬），不同顏色代表在各自處理中顯著富集的菌屬。木質(zhì)素處理與對照處理相比，其顯著富集的結(jié)點達109個，包含53個變形菌、20個擬桿菌、19個厚壁菌、8個酸桿菌、5個BRC1、2個Armatimonadetes、2個Nitrospirae。其中相對豐度大于1%的科（Family）主要包括Burkholderiaceae、Methylophilaceae、Pseudomonadaceae、Prolixibacteraceae、Lentimicrobiaceae、Koribacteraceae、Enterobacteriaceae等，在木質(zhì)素處理中分別占比13.84%、4.82%、4.72%、2.07%、1.94%、1.58%、1.55%、1.47%、1.39%、1.01%。

3 結(jié)論與討論

土壤微生物是土壤中的主要成分，它們參與土壤有機質(zhì)分解、腐殖質(zhì)合成、養(yǎng)分轉(zhuǎn)化等重要過程。木質(zhì)素可以用作土壤改良劑、修復(fù)劑和肥料等，也被認為是具有修復(fù)潛力的污染土壤生物刺激材料。該研究通過盆栽培養(yǎng)試驗，對空白對照和木質(zhì)素處理的土壤微生物進行了研究。

結(jié)果表明，木質(zhì)素的加入對細菌、真菌的數(shù)量以及群落結(jié)構(gòu)均產(chǎn)生了一定的影響。木質(zhì)素降低了細菌的基因豐度，且顯著降低了真菌的基因豐度。木質(zhì)素對細菌和真菌的數(shù)量顯示出抑制作用，對細菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)也產(chǎn)生了很大的影響。張杰[13]利用Biolog Eco板法研究了木質(zhì)素等5種處理對土壤微生物的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素會對土壤微生物性狀和生化功能產(chǎn)生抑制作用，不利于土壤微生物的繁殖和代謝。

從微生物群落分析可以看出，木質(zhì)素對一些微生物產(chǎn)生抑制作用的同時，也促進了部分微生物的快速生長和繁殖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素明顯提高了細菌中γ-變形菌、擬桿菌、厚壁菌的相對豐度和真菌中擔子菌、被孢霉菌的相對豐度，這可能與木質(zhì)素的降解過程有關(guān)。已發(fā)現(xiàn)細菌γ-變形菌綱假單孢菌屬（Pseudomonas），如Pseudomonas putida[14]，厚壁菌門芽孢桿菌屬（Bacillus），如Bacillus atphaeus[15]、Bacillus ligniniphilus[16]等具有木質(zhì)素降解能力。通過LefSe的分析，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素處理顯著富集了Burkholderiaceae、Methylophilaceae、Pseudomonadaceae、Prolixibacteraceae、Lentimicrobiaceae、Koribacteraceae、Enterobacteriaceae等細菌，其中Burkholderiaceae和Methylophilaceae已被證實屬于甲基營養(yǎng)菌[17-19]，也可能參與木質(zhì)素的自身代謝過程，是木質(zhì)素的潛在降解菌。真菌是迄今為止發(fā)現(xiàn)的參與木質(zhì)素代謝的最活躍微生物，根據(jù)真菌對木質(zhì)素的降解類型可以分為白腐菌（Phanerochaetc chrysosporium）、褐腐菌（Cyathus stecoreus）和軟腐菌（Erwinia carotovora）[20]，白腐菌[21]和褐腐菌[22]屬于擔子菌綱，而軟腐菌多屬于子囊菌綱。木質(zhì)素的加入可能促進了能利用這類碳源的潛在降解菌的富集，顯著提高了這部分微生物的豐度。

另一方面，由于這類降解菌的富集，促進了土壤中木質(zhì)素的分解，木質(zhì)素結(jié)構(gòu)復(fù)雜含有多種活性官能團，其在分解過程中會產(chǎn)生大量酚酸類等小分子物質(zhì)[23-24]，這類物質(zhì)常被認為是會對植物自身產(chǎn)生毒害作用的自毒物質(zhì)[25]，這些物質(zhì)會在土壤中與微生物互作，進而改變土壤生態(tài)環(huán)境，這類物質(zhì)的產(chǎn)生可能也是導(dǎo)致部分微生物群落豐度減少的原因。尹淇淋等[26]研究發(fā)現(xiàn)，酚酸類物質(zhì)的自毒作用會影響土壤微生物活性和土壤理化性質(zhì)，劉曉珍等[27]研究發(fā)現(xiàn)菊花連作障礙引起的酚酸物質(zhì)的積累會對土壤微生物產(chǎn)生影響，使微生物區(qū)系發(fā)生改變。

此外，筆者所在課題組在前期試驗過程中發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素的加入會導(dǎo)致土壤一定程度的板結(jié)，這一現(xiàn)象會影響土壤的吸水、吸氧、營養(yǎng)物質(zhì)吸附和通透能力等，會使土壤中的好氣性微生物的活動受到抑制，影響這部分微生物的生長和代謝。

目前，對木質(zhì)素的研究仍存在一定的局限性，今后研究中可采用在種的水平上對土壤微生物的群落組成進行分析，進一步研究木質(zhì)素對土壤微生物的作用，為木質(zhì)素的資源化利用提供更多的科學依據(jù)。

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