鄒帥，李玉芹，馬怡然，齊振華，賈權(quán)威

（湘潭大學(xué)化工學(xué)院，湖南 湘潭 411105）

微藻具有生長周期短、環(huán)境適應(yīng)性強及光合作用效率高等優(yōu)勢，能通過光合作用將CO2轉(zhuǎn)化成糖類、油脂和蛋白質(zhì)等有機物，而油脂是煉制生物柴油的理想原料，因而利用微藻高效固定CO2和積累油脂是一種兼具碳生物減排及生產(chǎn)可再生能源雙贏的有效手段[1-2]。但目前這一技術(shù)工業(yè)化應(yīng)用較為困難，其主要原因是CO2在微藻培養(yǎng)體系中吸收傳質(zhì)效率較低，限制了微藻高效固定CO2和積累油脂[3]。

極地膠球藻Cocccomyxa subellipoideaC-169 是非運動型單細胞綠藻，在適宜條件下可積累58%干重的甘油三酯，全基因組測序已完成，是碳生物減排和生物柴油開發(fā)的優(yōu)良藻株[12]。然而，利用胺類物質(zhì)強化膠球藻細胞固定CO2和積累油脂鮮有報道。本研究旨在考察二乙醇胺對膠球藻生長、固定CO2和積累油脂的影響，確定二乙醇胺最佳作用濃度范圍和膠球藻最佳固定CO2和積累油脂條件，以期為工業(yè)化大規(guī)模微藻CO2生物減排及可再生能源開發(fā)提供新思路。

1 材料和方法

1.1 藻株

膠球藻Cocccomyxa subellipsoideaC-169 為湘潭大學(xué)生物食品系藻菌資源開發(fā)與利用實驗室保藏菌株。

1.2 膠球藻培養(yǎng)

挑取單菌落藻細胞接入改良Basal 培養(yǎng)基[13]，在(28±1)℃，光照強度3000lux，光暗比12h/12h 條件下培養(yǎng)7天獲得種子液，以15%接種比例在無菌狀態(tài)下接入圖1 所示的1.2L 六通道光生物反應(yīng)器，每通道含0.8L Basal培養(yǎng)基及不同濃度二乙醇胺（0、20mg/L、40mg/L、60mg/L、80mg/L、100mg/L），在(28±1)℃，光照強度3000lux，光暗比12h/12h 條件下通氣攪拌培養(yǎng)7 天。通氣氣體為經(jīng)0.22μm 無菌濾膜過濾的純CO2和空氣，通氣量為0.5L/min，CO2體積分?jǐn)?shù)為0.03%、2%、5%、7%、10%。以無二乙醇胺培養(yǎng)膠球藻細胞為對照。

圖1 膠球藻固定CO2和積累油脂實驗簡易裝置

1.3 儀器與設(shè)備

1.4 生物量測定

收集第1.2 節(jié)培養(yǎng)7 天的膠球藻液，6000r/min離心20 min，棄上清液，蒸餾水洗滌藻泥3 次，-80℃超低溫預(yù)凍處理12h后，再真空凍干48h至恒重，稱量膠球藻粉得生物量，以式(1)計算生物量產(chǎn)率。

式中，P 為生物量產(chǎn)率，g/(L?d)；X1、X0分別為培養(yǎng)時間t1和t0測定的生物量濃度，g/L。

1.5 CO2固定效率及氣液傳質(zhì)系數(shù)測定

膠球藻CO2固定效率RCO2采用式(2)計算。

式中，RCO2為膠球藻CO2固定效率，g/(L?d)；CC為膠球藻細胞含碳量；P 為膠球藻生物量產(chǎn)率；MCO2和MC分別為CO2分子和C元素分子量。

將圖1所示生物反應(yīng)器中不含藻細胞培養(yǎng)基以99.99%氮氣曝氣1.5h，再以不同濃度CO2曝氣，培養(yǎng)基溫度為(28±1)℃，測量1h 內(nèi)培養(yǎng)基中溶解CO2濃度變化，時間間隔5min 記錄1 次，式(3)計算傳質(zhì)系數(shù)KLa。

式中，dC/dt 為單位體積培養(yǎng)液中CO2傳遞速率，mol/(min·L)；C*為與CO2分壓平衡的液相CO2濃度，mol/L；C 為液相CO2濃度，mol/L；KLa 為體積傳質(zhì)系數(shù)，min-1。

1.6 油脂含量測定

準(zhǔn)確稱取0.02g（W1）凍干藻粉，加入3mL 水/氯仿/甲醇（體積比為0.5∶2∶1）震蕩20min 充分混勻，10000r/min 離心10min，收集氯仿層，萃取重復(fù)3～5 次，收集氯仿層至已稱重（W2）50mL 離心管中，以0.5mL 1mol/L氯化鉀和1mL超純水清洗萃取管，合并所有清洗液與氯仿層，真空干燥至恒重（W3），以式(4)和式(5)計算油脂含量和產(chǎn)率。

1.7 超微結(jié)構(gòu)表征

以6000r/min 離心20min 收集膠球藻液，磷酸鹽PBS緩沖溶液（pH=7.0）洗滌藻泥。將藻泥重懸于20% DMSO 溶液，在35℃誘導(dǎo)20min。將15μL尼羅紅染色溶液加入1mL懸浮液中誘導(dǎo)10min。采用激光共聚焦對尼羅紅染色含脂細胞器成像，綠色熒光激發(fā)波長為480nm，發(fā)射波長為560～615nm。同步以魏東等[14]方法將藻細胞進行固定、脫水、包埋、聚合、切片后采用透射電鏡捕捉成像。

（2）尺寸的標(biāo)注合理性不高，這主要是指對于換算的標(biāo)準(zhǔn)和繪圖標(biāo)準(zhǔn)的尺寸標(biāo)注不夠準(zhǔn)確到位。這方面的問題主要體現(xiàn)在標(biāo)注的信息缺乏準(zhǔn)確性，也就是說，在實際換算時，存在標(biāo)注換算的比例和方法錯誤的現(xiàn)象，這是直接影響到換算結(jié)果的一類嚴(yán)重的問題。另外，信息標(biāo)注的清晰度不足也是標(biāo)注合理性不高的一個典型體現(xiàn)，這會給實際建筑施工人員對于圖紙的辨別和判斷帶來一定的障礙。

1.8 脂肪酸組成測定

取10mg 藻粉加入100μL 內(nèi)標(biāo)液（1g/L 十九烷酸二氯甲烷溶液），混勻后加入2mL 40g/L的KOHCH3OH 溶液，75℃水浴15min。冷卻后加入2mL BF3-CH3OH 溶液（體積比1∶4），然后75℃水浴15min，待冷卻后加入1mL飽和NaCl溶液和2mL正己烷，渦旋1min，4000r/min 離心8min，取1mL 上清液過0.22μm 濾膜，以Angilent 6890N GC-MS 測定脂肪酸組成。載氣高純氦氣，流速1mL/min，樣品分流比2∶1，進樣量0.2μL，質(zhì)譜掃描范圍33～400u。程序升溫為：初始柱溫110℃保持2min，以5℃/min 升高至220℃保持5min。各峰型鑒定采用NTST05a譜庫自動檢索定性，根據(jù)各峰相對于C19∶0內(nèi)標(biāo)峰面積，計算脂肪酸含量。

1.9 酶活測定

采用比色定量試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）測定膠球藻1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）、碳酸酐酶（CA）、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、乙酰輔酶A 羧化酶（ACCase）活性。

2.0 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）表示，數(shù)據(jù)分析采用Origin 8和SPSS 18.0軟件進行，利用SPSS 18.0軟件對各組實驗數(shù)據(jù)的顯著性差異分析，顯著水平為p<0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同CO2濃度對膠球藻固定CO2和積累油脂的影響

如圖2 所示，膠球藻生物量隨著CO2濃度升高呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。在CO2體積分?jǐn)?shù)為2%時達到最大值0.59g/L。CO2體積分?jǐn)?shù)增加至5%時，生物量下降，其值顯著性低于CO2體積分?jǐn)?shù)2%時的生物量，說明膠球藻細胞在體積分?jǐn)?shù)5%CO2條件下生長受到抑制。持續(xù)增加CO2體積分?jǐn)?shù)至7%甚至10%時，這種生長抑制效應(yīng)更為顯著，生物量值與體積分?jǐn)?shù)0.03%、5%和7% CO2條件相比，分別降低了17.5%、22.5%和12.5%，尤其較體積分?jǐn)?shù)2%CO2減少了約58%。不同濃度CO2對膠球藻固碳效率呈現(xiàn)與生物量一致的先上升后下降變化趨勢，在體積分?jǐn)?shù)2%CO2條件下固定效率最佳，其值為137.55mg/(L·d)，是體積分?jǐn)?shù)0.03%CO2的1.24倍，并顯著性高于體積分?jǐn)?shù)5%～7%的高CO2條件下的固定效率。油脂含量在低濃度（體積分?jǐn)?shù)0.03%）CO2和高濃度（體積分?jǐn)?shù)7%、10%）CO2誘導(dǎo)下無顯著性變化，相較而言，體積分?jǐn)?shù)2%和5%CO2條件下油脂含量顯著性增加，尤其體積分?jǐn)?shù)2%CO2條件下油脂含量高達56%，是體積分?jǐn)?shù)5%和其他CO2條件下的1.19～1.4倍。此外，膠球藻在體積分?jǐn)?shù)2%CO2條件下的油脂產(chǎn)率為47.20mg/(L·d)，顯著高于0.03%、5%、7%和10%CO2條件下的27.98mg/(L·d)、32.9mg/(L·d)、27mg/(L·d)和23.43mg/(L·d)。綜 上 所述，膠球藻生長、固定CO2和積累油脂的最適宜CO2體積分?jǐn)?shù)為2%，這與魏東等[14]報道的2% CO2能顯著提高膠球藻細胞油脂積累效率研究結(jié)果一致，但本實驗生物量和油脂產(chǎn)率低于其報道的4.67g/L 生物量和77.49mg/(L·d)脂肪酸產(chǎn)率，與小球藻、柵藻、鹽生杜氏藻和聚球藻藻株的固定CO2和積累油脂效率也有差距[17]。這些差異可能是由于培養(yǎng)體系CO2供給模式以及碳源供給種類不同而引起。然而，在相同單一CO2碳源培養(yǎng)條件下，膠球藻固定CO2和積累油脂效率明顯優(yōu)于報道的布朗葡萄藻（B.braunii）和柵藻（S.quadricauda）等藻株[15,18]，證實了膠球藻在固定CO2和積累油脂方面具有較好的潛力。

圖2 不同CO2體積分?jǐn)?shù)對膠球藻生物量及固定CO2和積累油脂的影響

2.2 不同二乙醇胺濃度作用對膠球藻固定CO2和積累油脂的影響

盡管膠球藻在固定CO2和積累油脂方面具有一定的潛力，但獲得的固定CO2和積累油脂效率距工業(yè)化應(yīng)用尚仍存在差距。培養(yǎng)體系中CO2溶解傳質(zhì)效率是微藻高效固定CO2和積累油脂的決定因素。如前所述，利用胺類物質(zhì)將培養(yǎng)體系中CO2轉(zhuǎn)化為HCO-3，提高培養(yǎng)體系CO2溶解效率，從而加強微藻固碳積脂頗受關(guān)注[6,8-11]。

在2.1節(jié)中體積分?jǐn)?shù)2%CO2基礎(chǔ)上進一步考察了不同DEA濃度對膠球藻固定CO2及積累油脂的影響。如圖3所示，隨著DEA濃度增加膠球藻生物量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。當(dāng)DEA 濃度由0 增加至40mg/L 時，膠球藻生物量顯著提高，在DEA 為40mg/L 時達到最大值0.97g/L，相較于對照組生物量增加了1.64 倍。當(dāng)DEA 為60mg/L 時，生物量值與40mg/L DEA 處理組相比無顯著差異。而DEA 濃度為80mg/L 和100mg/L 時的膠球藻生物量，較DEA 濃度60mg/L 生物量顯著降低（p<0.05），生物量由0.96g/L 降至0.54g/L。這表明膠球藻在適宜濃度DEA作用下，可捕獲更多的CO2為膠球藻細胞利用促進生長代謝，而高濃度DEA 對膠球藻生長產(chǎn)生抑制作用，這可能是高濃度DEA 會在藻細胞產(chǎn)生毒性和胺腐蝕效應(yīng)。這一現(xiàn)象與Cardias 等[11]研究結(jié)果一致，添加172.2mg/L DEA喂養(yǎng)Spirulinasp.顯著促進生長，而高于172.2mg/L濃度的DEA顯著抑制了藻體細胞生長。不僅如此，不同濃度DEA作用下膠球藻對CO2固定效率差異顯著，在0～40mg/L濃度范圍內(nèi)CO2固定效率顯著上升，DEA 濃度為40mg/L時CO2固定效率達到最大值為225.98mg/(L·d)，較無DEA 處理組固定效率提高了64.8%。當(dāng)DEA濃度提高至60～80mg/L時，CO2固定效率顯著下降，由225.98mg/(L·d)降至126.95mg/(L·d)。說明適宜濃度的DEA 在藻培養(yǎng)體系中可促進膠球藻細胞的固定效率。王兆印等[10]和Cardias等[11]將DEA用于藻培養(yǎng)體系發(fā)現(xiàn)適合DEA 濃度顯著提高了氣液傳質(zhì)系數(shù)，增大了CO2氣液傳質(zhì)速率，從而使藻細胞生物量和CO2固定效率較未添加DEA 細胞提高25.6%和41.2%。本研究中無DEA 處理組測得KLa值為0.054/min，而在40mg/L DEA條件下的KLa值增加至0.073/min，因而DEA 提高了膠球藻培養(yǎng)體系氣液傳質(zhì)系數(shù)，增強了CO2傳質(zhì)效率，使體系中能被膠球藻利用的無機碳增多，藻細胞固定CO2和積累油脂效率提高。

圖3 不同DEA濃度對膠球藻固定CO2及積累油脂的影響

在DEA 作用下，膠球藻油脂含量隨著DEA 濃度的升高呈先上升后下降趨勢，膠球藻在40mg/L DEA 處理組油脂含量最高為64.33%，較無DEA 處理細胞油脂含量提高了1.37倍，顯著促進了藻細胞的油脂合成積累。為進一步明確DEA 對膠球藻細胞積累油脂的促進作用，對不同DEA 濃度作用下的膠球藻細胞進行了共聚焦激光和透射電鏡表征。由圖4 可知，經(jīng)40mg/L DEA 處理的膠球藻細胞脂質(zhì)熒光強度顯著強于其他濃度DEA誘導(dǎo)的藻細胞，證實40mg/L DEA處理的膠球藻細胞脂質(zhì)含量最高，與上述實驗結(jié)果一致。此外，膠球藻細胞透射結(jié)果可以看出，在無DEA 處理條件下的膠球藻細胞油脂滴和淀粉顆粒分別占據(jù)了整個細胞的一半體積。隨著DEA 濃度的增加，尤其在40mg/L DEA 處理條件下，淀粉顆粒大小和數(shù)量顯著萎縮，以電子密集點形式存在的脂質(zhì)體聚合成群，占據(jù)細胞體積的一半以上，說明脂質(zhì)含量顯著提高。而在100mg/L高濃度DEA 處理條件下，淀粉顆粒聚集成團，幾乎占據(jù)了整個細胞體積，僅能看到一些零散脂質(zhì)點，這與激光共聚焦脂質(zhì)熒光結(jié)果顯示了一致性。此外，不同DEA 對膠球藻油脂產(chǎn)率的影響與生物量變化趨勢一致，在DEA 濃度為40mg/L 時，油脂產(chǎn)率達到最大值59.9mg/(L·d)，較無DEA 處理組油脂產(chǎn)率提高了74.7%。以上結(jié)果表明在體積分?jǐn)?shù)2%CO2條件下，添加40mg/L DEA進一步促進了膠球藻細胞生長，固定CO2和積累油脂效率也顯著提高。因此，40mg/L DEA 是強化膠球藻固定CO2和積累油脂的最佳濃度。

圖4 不同DEA濃度對膠球藻細胞超微結(jié)構(gòu)的影響

2.3 二乙醇胺作用對膠球藻細胞中固定CO2和積累油脂關(guān)鍵酶活性的影響

碳酸酐酶CA 是一種含鋅金屬酶，具有維持酸堿平衡、CO2及碳酸鹽轉(zhuǎn)運等功能，并且是碳濃縮過程中催化CO2水合生成HCO-3的關(guān)鍵限速酶，其活性強弱直接影響細胞內(nèi)CO2轉(zhuǎn)化HCO-3的效率[19]。研究報道顯示，CA 酶在低CO2濃度條件下活性相對較高，可促進CO2轉(zhuǎn)運進入細胞中進而被核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶RuBisCO 固定利用，而在較高CO2濃度下（如工業(yè)煙道氣）活性相對較低，在一定程度上限制了碳濃縮固定[20]。研究者們后續(xù)依據(jù)CA 酶活特性通過基因工程策略調(diào)控CA 酶活來提高微藻固定CO2和積累油脂效率，如Wei 等[21]將微擬球藻細胞中的CA 酶基因進行敲除構(gòu)建基因工程藻株，在相對高濃度的5%CO2培養(yǎng)體系中固定CO2和積累油脂效率提高了41%；Lin 等[20]將CA 酶基因克隆表達轉(zhuǎn)化普通小球藻株，其轉(zhuǎn)基因藻株在相對低的體積分?jǐn)?shù)1% CO2培養(yǎng)體系中固碳效率、生物量產(chǎn)量和脂質(zhì)積累均獲得大幅度提升。而本研究中在相對較低的體積分?jǐn)?shù)2%CO2條件下，DEA和無DEA處理的膠球藻細胞中CA酶活性均隨著培養(yǎng)時間增加呈現(xiàn)先上升后下降趨勢[圖5(a)]。在DEA 處理膠球藻細胞中，CA 酶活在培養(yǎng)至第7 天時達到最大值150.65U/L，是未添加DEA 處理細胞CA酶活性的1.08倍，證實外源添加DEA 可顯著增強CA活性，大量的CO2被催化生成HCO-3，促進了膠球藻生長。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶PEPC是C4光合作用途徑關(guān)鍵酶之一，其主要功能是催化磷酸烯醇式丙酮酸的β-C羧基化并生成草酰乙酸，與乙酰輔酶A羧化酶ACCase 之間存在底物競爭[24]。Allen 等[25]在報道中指出下調(diào)膠球藻細胞中PEPC活性，可加強碳流向脂類合成路徑的分配比率，有效促進細胞脂質(zhì)積累。不僅如此，有研究者通過敲除或沉默表達三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）和萊茵衣藻（C. reinhardtii） 中 的PEPC 基 因，有 效 證 實PEPC 表達下調(diào)在藻細胞油脂合成積累過程中起正調(diào)控作用[26-28]。由圖5(c)可以看出，DEA 加入膠球藻細胞中PEPC 活性降低，在培養(yǎng)至第7 天時酶活值僅為22.01U/L，盡管無DEA 處理組細胞中PEPC活性水平也相對較低，其值為24.01U/L，但整體上高于40mg/L DEA+2%CO2細胞中PEPC活性[圖5(c)]。因此，可以推測PEPC 活性降低驅(qū)使固定的碳流向油脂合成積累路徑，在一定程度上促進了膠球藻胞內(nèi)油脂的富集。

圖5 二乙醇胺對膠球藻碳酸酐酶、核酮糖二磷酸羧化酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、乙酰輔酶A 羧化酶活性影響

乙酰輔酶A羧化酶ACCase屬生物素依賴型酶，催化乙酰輔酶A生成丙二酸單酰輔酶A，是脂肪酸合成過程中的限速酶。研究報道顯示，在小球藻、聚球藻、等鞭金藻等藻種屬中過表達ACCase 酶基因，可有效促進藻細胞內(nèi)油脂含量的提高[28-29]，甚至在轉(zhuǎn)ACCas 基因的小球藻（C. vulgaris）細胞中油脂含量較對照組提高了6倍，以及不飽和脂肪酸神經(jīng)酸C24∶1含量提高了9倍。不僅如此，ACCase活性的提高可催化生成更多的丙二酰輔酶A來抑制脂肪酸氧化，從而提高脂肪酸含量[24]。而在40mg/L DEA 作用下膠球藻細胞中ACCase 酶活性隨著培養(yǎng)時間的增加逐漸增強，培養(yǎng)至第7 天時，ACCase活性達到最大值181.94U/L[圖5(d)]，是無DEA處理細胞中ACCase 最大酶活的1.06 倍。因此，在DEA作用下，ACCase 酶活提高驅(qū)使大量固定的碳流向油脂路徑。

2.4 二乙醇胺作用對膠球藻細胞脂肪酸組分的影響

藻細胞中脂肪酸組成和比例直接影響藻基生物柴油的十六烷值、氧化穩(wěn)定性及低溫冷凝等燃料特性。由表1可知，2%CO2和DEA+2%CO2作用膠球藻細胞脂肪酸均以C16和C18為主，但其各脂肪酸比例顯著不同。如無DEA作用細胞中棕櫚酸C16∶0和硬脂酸（C18∶0）含量顯著高于DEA 作用藻細胞；C18∶2 在DEA 細胞中未檢測到，而在無DEA 作用細胞中含量為12.39%。整體上，DEA 作用對膠球藻細胞中脂肪酸影響包括：①使C16～C18脂肪酸比例占總脂肪酸的92%，是無DEA作用細胞的1.11倍；②使單不飽和脂肪酸油酸C18∶1 比例高達50%以上，高于無DEA 作用細胞中11.59%含量，并且顯著高于Peng 等[30]報道的以2%CO2為碳源的膠球藻細胞中的15.57%比例，甚至遠高于Yu 等[31]粗甘油碳源作用膠球藻細胞中3.88%的含量；③為滿足EN 14214 和ASTM D-6751 生物柴油燃料標(biāo)準(zhǔn)，脂質(zhì)中亞麻酸C18∶3 含量需低于12%，而DEA 作用細胞中的C18∶3 比例（1.99%）滿足這一標(biāo)準(zhǔn)。因而DEA 作用的膠球藻細胞是優(yōu)良脂肪酸制造者。此外，研究指出脂質(zhì)中飽和脂肪酸SFAs 和單不飽和脂肪酸MUFAs 比例較高或以多不飽和脂肪酸PUFAs含量為主，會降低藻基生物燃料氧化穩(wěn)定性和低溫冷凝特性，而脂質(zhì)中若MUFAs 比例高于SFAs 和PUFAs 兩者含量，可賦予藻基生物燃料優(yōu)越的燃料性能[4]。本研究中DEA處理細胞中MUFAs比例高達56.65%，高于SFAs 和PUFAs 兩者含量43.35%，因而能顯著提高轉(zhuǎn)酯化生物柴油產(chǎn)品的十六烷值和碘值，是煉制高質(zhì)量生物柴油的理想原料。

表1 二乙醇胺作用對膠球藻細胞脂肪酸組分的影響

3 結(jié)論

二乙醇胺DEA 強化膠球藻（C.subellipsoidea）C-169固定CO2和積累油脂結(jié)果提示，40mg/L DEA作用將培養(yǎng)體系CO2與培養(yǎng)基間的氣液傳質(zhì)系數(shù)提高至0.073/min，使得體系可利用無機碳源比例增加，同時上調(diào)膠球藻胞內(nèi)CO2固定路徑調(diào)控酶RubisCO 和CA、脂肪酸路徑調(diào)控酶ACCase 活性以及下調(diào)ACCase競爭路徑調(diào)控酶PEPC活性，從而協(xié)同強化了膠球藻固定CO2和積累油脂，使固定CO2和積累油脂效率提高至225.98mg/(L·d)和59.9mg/(L·d)，且40mg/L DEA 作用膠球藻中C16～C18脂肪酸比例高達92%，單不飽和脂肪酸占比（56.65%）高于飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸（43.35%），是煉制藻基生物柴油的理想原料，研究結(jié)果為利用微藻進行CO2生物減排及可再生能源開發(fā)提供新思路和理論依據(jù)。