張雪峰，張麗莉，李明暉

急性腸梗阻是因任何原因引起的部分或全部腸內(nèi)容物通過(guò)障礙，是臨床最常見(jiàn)的急腹癥[1]。小兒腸梗阻臨床表現(xiàn)為腹痛、嘔吐、腹脹、肛門停止排便排氣，嚴(yán)重影響患兒生長(zhǎng)發(fā)育，嚴(yán)重者可并發(fā)腸壞死，升高病死率。研究顯示，梗阻導(dǎo)致腸壞死的發(fā)生可能與腸道黏膜功能障礙造成腸道菌群環(huán)境改變有關(guān)，通過(guò)探討相關(guān)機(jī)制可能為急性腸梗阻腸壞死的治療帶來(lái)新契機(jī)[2]。A2B腺苷受體(A2BAR)參與調(diào)節(jié)機(jī)體多種生理及病理過(guò)程，包括刺激內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)炎性因子釋放、調(diào)節(jié)腸道氯離子分泌等[3]。緊密連接蛋白為緊密連接復(fù)合體重要組成蛋白，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)為引起感染性休克和組織損傷的重要炎癥介質(zhì)，二者與急性腸梗阻腸壞死患兒細(xì)菌移位存在明顯關(guān)系[4]。本研究通過(guò)分析65例急性腸梗阻腸壞死患兒的臨床資料，探討A2BAR、緊密連接蛋白、TNF-α在急性腸梗阻腸壞死患兒中的表達(dá)及與腸上皮細(xì)胞凋亡的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取我院2015年4月—2020年2月行手術(shù)治療的急性腸梗阻腸壞死患兒65例作為研究組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合急性腸梗阻腸壞死的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②年齡2～14歲；③入組前未接受過(guò)相關(guān)治療者；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他系統(tǒng)疾病者；②患有盆、腹腔巨大腫塊者；③患有彌漫性腹膜炎伴腸梗阻者；④患有腹部疝或橫膈疝者；⑤合并心腦血管或造血系統(tǒng)等嚴(yán)重疾病者。研究組中男34例，女31例；年齡2～14(5.31±2.43)歲；急性腸套疊23例，紫癜合并腸套疊15例，腹內(nèi)疝13例，腸扭轉(zhuǎn)6例，粘連性腸梗阻腸絞窄5例，嵌頓性腹股溝斜疝3例。另選擇同期于我院行腸切除吻合術(shù)治療的消化道畸形患兒30例作為對(duì)照組，入院前均未合并其他疾病，其中男16例、女14例，年齡2～11(5.26±2.35)歲。2組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2檢測(cè)方法

1.2.1樣本收集：收集65例術(shù)中切除的部分腸管作為研究標(biāo)本，近端約0.5 cm×0.5 cm采用蛋白免疫印跡法處理，其余腸管相應(yīng)處理后采用免疫組織化學(xué)染色法測(cè)定A2BAR、緊密連接蛋白。

1.2.2A2BAR、緊密連接蛋白檢測(cè)：將術(shù)中標(biāo)本切為4 μm薄片，脫蠟、水化、高壓修復(fù)后滴加3%過(guò)氧化氫溶液，常溫下滅活內(nèi)源性酶，封閉，滴入A2BAR抗體3 μg/ml、緊密連接蛋白抗體(1∶300)，4℃過(guò)夜后滴加二抗，DAB顯色，常規(guī)脫水后封片待測(cè)。選用PBS液代替一抗為陰性對(duì)照，半定量分析切片(每張切片在400倍鏡下隨機(jī)選擇3～4個(gè)視野)，陽(yáng)性表達(dá)呈棕黃色顆粒，檢測(cè)陽(yáng)性反應(yīng)產(chǎn)物的灰度值。見(jiàn)圖1。

圖1 急性腸梗阻腸壞死患兒A2BAR、緊密連接蛋白免疫組織化學(xué)染色圖(DAB顯色，蘇木素復(fù)染，×400)A.A2BAR，B.緊密連接蛋白，A2BAR為A2B腺苷受體

1.2.3TNF-α檢測(cè)：所有患兒在入院時(shí)及術(shù)后1周抽取靜脈血液3 ml，3000 r/min離心10 min后分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定TNF-α濃度。

1.3腸上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)檢測(cè) 采用原位末端標(biāo)記法檢測(cè)AI。病理切片常規(guī)脫蠟入水，將切片放入新配制的3%過(guò)氧化氫溶液中10 min。蒸餾水洗滌3次，每次2 min。標(biāo)本滴加新稀釋的蛋白酶K中消化15 min，按TdT∶DIG-d-UTP∶標(biāo)記緩沖液為1∶1∶18比例配制混合液，混勻。TBS液反復(fù)沖洗，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染。最后TBS液沖洗，蒸餾水洗滌，脫水，透明，封片。光學(xué)顯微鏡觀察，以400倍放大切片，棕黃色顆粒呈現(xiàn)于細(xì)胞核中提示細(xì)胞凋亡。每張切片按順序選擇5～10個(gè)視野，共計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，以TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)算AI，AI=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

2 結(jié)果

2.1A2BAR、緊密連接蛋白及TNF-α表達(dá) 研究組A2BAR灰度值、緊密連接蛋白灰度值及AI低于對(duì)照組(P<0.05，P<0.01)。與對(duì)照組術(shù)前比較，研究組術(shù)前血清TNF-α水平顯著升高(P<0.05)；術(shù)后7 d，研究組血清TNF-α水平較術(shù)前顯著降低(P<0.05)，但與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 手術(shù)治療的急性腸梗阻腸壞死和消化道畸形患兒A2BAR灰度值、緊密連接蛋白灰度值、TNF-α、AI比較

2.2A2BAR灰度值、緊密連接蛋白灰度值、TNF-α與AI的相關(guān)性分析 A2BAR灰度值、緊密連接蛋白灰度值與AI呈正相關(guān)(P<0.01)，TNF-α與AI呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)，見(jiàn)表2和圖2。

表2 急性腸梗阻腸壞死患兒A2BAR灰度值、緊密連接蛋白灰度值、TNF-α與AI的相關(guān)性分析

圖2 急性腸梗阻腸壞死患兒A2BAR灰度值、緊密連接蛋白灰度值、TNF-α與AI的相關(guān)性分析散點(diǎn)圖A2BAR為A2B腺苷受體，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，AI為凋亡指數(shù)

3 討論

既往研究指出，急性腸套疊、腸扭轉(zhuǎn)及嵌頓疝是導(dǎo)致小兒急性腸梗阻腸壞死的主要原因[6]，嚴(yán)重者可引發(fā)中毒性休克甚至全身炎癥反應(yīng)綜合征、全身多器官衰竭等，危及患兒生命[7]。由于急性腸梗阻腸壞死病情變化快，需早期做出診斷并處理。

腸屏障是機(jī)體重要的屏障結(jié)構(gòu)，對(duì)于穩(wěn)定腸道內(nèi)環(huán)境平衡和阻礙致病菌及毒素進(jìn)入體內(nèi)等具有重要作用[8]。目前已有研究表明，小兒急性腸梗阻發(fā)生時(shí)細(xì)菌或其產(chǎn)物穿過(guò)腸屏障進(jìn)入其他器官[9]。但是，目前臨床對(duì)于不同病理?xiàng)l件下腸屏障功能變化的作用機(jī)制仍存有爭(zhēng)議[10]。有學(xué)者提出，腸黏膜損傷后可引發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，而炎性因子TNF-α等又會(huì)導(dǎo)致腸道內(nèi)缺氧，進(jìn)而對(duì)腸黏膜屏障功能產(chǎn)生影響[11]。本文研究組術(shù)前TNF-α水平顯著升高，原因在于腸黏膜損傷激活體內(nèi)絲裂原活化蛋白激酶活性，促進(jìn)大量炎性因子釋放，進(jìn)而加重炎癥反應(yīng)。

A2BAR作為腺苷的一種亞型，與炎性因子分泌、血管松弛及肥大細(xì)胞增生均有著密切聯(lián)系，現(xiàn)已成為國(guó)內(nèi)外研究的焦點(diǎn)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，急性血液阻滯和缺氧可誘導(dǎo)腸道內(nèi)A2BAR表達(dá)升高，進(jìn)而加速各種條件下受損黏膜自我修復(fù)過(guò)程[13-14]。此外，A2BAR還具有調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能、抑制促炎因子TNF-α分泌的作用[15]。本文鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，研究組腸黏膜上皮細(xì)胞膜表面A2BAR表達(dá)更為顯著，并且在腸黏膜上皮細(xì)胞的多個(gè)位置廣泛表達(dá)；同時(shí)A2BAR灰度值低于對(duì)照組，表明急性腸梗阻腸壞死患兒腸管內(nèi)A2BAR表達(dá)升高。

研究表示，緊密連接蛋白可形成緊密的封閉帶，以維持細(xì)胞兩端不同的形態(tài)或功能和細(xì)胞內(nèi)外的水平衡，并可參與細(xì)胞間信號(hào)的傳送調(diào)節(jié)[16]。本研究顯示，急性腸梗阻腸壞死患兒腸管緊密連接蛋白灰度值明顯降低，推測(cè)其參與了小兒急性腸梗阻腸壞死的病理生理過(guò)程[17]。進(jìn)一步分析其可能作用機(jī)制：腸內(nèi)血液循環(huán)受阻、缺氧時(shí)p-p38MAPK活化轉(zhuǎn)錄因子升高促進(jìn)了促炎細(xì)胞因子的分泌，此類因子激活后可與相應(yīng)的腸上皮細(xì)胞表面特異性死亡受體結(jié)合并活化，通過(guò)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)腸黏膜細(xì)胞的程序性凋亡起到激活作用，從而達(dá)到減少腸黏膜相關(guān)細(xì)胞數(shù)量的效果[10,18]。

為進(jìn)一步探討A2BAR、緊密連接蛋白及TNF-α異常表達(dá)在急性腸梗阻腸壞死中的作用機(jī)制，本研究采用Pearson相關(guān)分析觀察急性腸梗阻腸壞死患兒A2BAR、緊密連接蛋白及TNF-α與AI的關(guān)系，結(jié)果顯示A2BAR灰度值、緊密連接蛋白灰度值與AI呈正相關(guān)，TNF-α與AI呈負(fù)相關(guān)。表明A2BAR、緊密連接蛋白及TNF-α與急性腸梗阻腸壞死患兒腸上皮細(xì)胞大量凋亡關(guān)系密切，提示臨床可將三者作為治療靶點(diǎn)，以保障患兒腸黏膜屏障功能的完整性作為臨床治療的新方向[19]。

綜上，A2BAR、緊密連接蛋白及TNF-α在急性腸梗阻腸壞死患兒中異常表達(dá)，且與患兒腸上皮細(xì)胞大量凋亡關(guān)系密切，臨床需重視患兒A2BAR、緊密連接蛋白及TNF-α水平監(jiān)測(cè)，以改善其預(yù)后。