馮世武, 張寶良，馬 強

(甘肅省家畜繁育改良管理站，甘肅 武威 733000)

引言

1951年以來冷凍精液技術大量用于生產(chǎn)實踐，本世紀隨著居民生活水平的提升，毛驢的營養(yǎng)價值、藥理作用逐漸被發(fā)掘出來[1]。相比其它肉類產(chǎn)品擁有較高的脂肪酸、氨基酸、礦物質(zhì)，而熱量、脂肪和膽固醇低。驢皮是制備名貴中藥阿膠原料，孕驢血清中促性腺激素制做的絨毛膜促性腺激素成品藥劑可治療不孕不育。驢奶與人奶成分及其相似，增加免疫力的同時抗氧化，保持器官活力。甘肅是重度貧困地區(qū)，脫貧方式單一，結合近年來興起的毛驢養(yǎng)殖，探索出一條“養(yǎng)驢致富”的脫貧攻艱之路由為必要。立足甘肅省家畜繁育改良管理站長期從事冷凍精液生產(chǎn)、推廣良種凍精的優(yōu)勢條件；結合甘肅基本省情，研發(fā)驢冷凍精液制作，推進全省養(yǎng)驢農(nóng)戶地方品種改良、增加農(nóng)戶經(jīng)濟效益、加快畜牧業(yè)發(fā)展，實現(xiàn)脫貧致富。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

1.1.1 種公驢飼養(yǎng)管理 優(yōu)秀的種公驢是驢冷凍精液制作的前提，全省范圍內(nèi)收購被毛光滑漆黑、活動性強、食欲飲水良好、四肢健全、肌肉豐滿的公驢，飼養(yǎng)于甘肅省家畜繁育改良管理站養(yǎng)殖基地。依據(jù)《不同階段驢的飼養(yǎng)管理標準》中成年種公驢標準：日糧按粗蛋白18%～20%，粗纖維0%～4%，鈣0.8%～1.8%，磷0.5%～1.0%；干草為體重1%，精料0.5%。早中晚定時、定人、定量先精后粗投喂；投喂量隨季節(jié)、溫度、體重的變化及時調(diào)整[2]；寒冷冬季提高能量飼料占比，炎熱夏季降低能量以及蛋白飼料占比；采精前2 h內(nèi)不喂草，每頓更換不同草料(苜蓿、燕麥、羊草)；自由飲水，冬季氣溫0 ℃以下時水槽安裝加熱裝置，飲水槽水溫10 ℃以上，每日按時清潔水槽；每頭種公驢每日運動至少1 h，保證驢床舒適干燥，夏季鋪膠墊，冬季鋪褥草；驢舍周圍環(huán)境定時消毒，及時治療種公驢疾?。?2-24月齡種公驢每年一次修蹄，24月齡以上種公驢每年兩次修蹄。

1.1.2 種公驢納入標準 公驢體重400 kg以上，10月齡以上，睪丸發(fā)育良好，附睪明顯，性欲旺盛，可正常下鞭，完成射精的公驢，并抽取8 μL原精至于400倍顯微鏡下，①精子密度≧20×106/mL；②精子活力≧65 %；③存活率≧70 %。同時滿足上述三種指標確定為合格種公驢，納入采精對象。

1.1.3 種公驢排除標準 屬于先天生殖器官畸形公驢，如睪丸萎縮、隱睪等；年齡小于2歲或大于10歲；患有傳染病引起的公驢繁殖障礙者，如布魯氏菌等[3]；公驢從未爬跨，不能采精，且難以調(diào)教者。

1.1.4 公驢采精 驢為季節(jié)性發(fā)情，3月上旬至入冬，4、5、6月份為發(fā)情旺季，發(fā)情周期1周左右。本實驗選取4月份前兩周母驢發(fā)情最明顯時期，以發(fā)情母驢為胎驢，誘導公驢爬跨射精。采精員先讓公驢空爬一次，等待種公驢性欲旺盛，陰莖下漏堅挺，種公驢前肢爬上母驢時，迅速靠近種公驢左手拖住公驢陰陰莖，右手拿假陰道與公驢成40～60度角，雙手配合將公驢陰莖引入假陰道口內(nèi)，等待公驢完成射精，公驢緩慢趴下，采精員右手緊握假陰道，待公驢四肢著地時取下假陰道遠離公驢，并打開活塞放氣以便精液快速流入集精杯，快速送入實驗室，更換假陰道采集下一頭種公驢精液。

1.1.5 臨床指標觀察 采精前對所有試驗對象進行體溫和體重的測量，觀察并記錄其精神狀態(tài)，采食量，飲水量，體毛光澤度和是否有自淫，血精，采精液結晶等現(xiàn)象。

1.1.6 儀器 載玻片、蓋玻片、溫度計、500 mL燒杯、200 mL量筒、500 mL容量瓶、移液器搶、假陰道、集精杯、凡士林、恒溫水浴箱、精液性狀板、細管專用剪、吸水紙、電子分析天平等由甘肅省家畜繁育改良管理站實驗室提供；相差顯微鏡、電視顯微錄像系統(tǒng)、載物臺恒溫裝置、精子密度測定儀、細管精液分裝機、精液冷凍程控儀、液氮罐、低溫平衡柜購于德國Minitu公司。

1.1.7 試劑 Ⅰ組普蒂迪爾公牛稀釋液(購自法國CRYO-VET)、Ⅱ組特里拉迪爾公豬稀釋液(購自法國CRYO-VET)、Ⅲ組仙女座馬稀釋液(購自德國Minitu公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 驢精液分離 將采集的驢精液用四層醫(yī)用紗布過濾，1∶ 1加入離心保護液，裝入在250 mL無菌塑料離心瓶中，1 850 r/min離心9 min分離精清。用移液槍吸取精清并廢棄，最后2～3 mL精清抽打數(shù)次與精子混均，一并吸出置錐形瓶內(nèi)。

1.2.2 精子質(zhì)量實驗室檢查 將離心后的精液抽取5 μL至于顯微鏡38 ℃載物臺檢測活力(活力≧65 %)；稱重后用密度儀測量精液密度、稀釋量、細管印刷量；稀釋后分裝，4 ℃平衡4 h；放入程控儀冷凍，隨機抽取3支置于38 ℃溫水解凍，并檢測活力。

1.2.3 各類稀釋液抗凍性對比 挑選6頭離心后活力為(7.0±0.50)%的種公驢精液，測量精液密度、稀釋量、細管印刷量后，每頭驢原精均分為3等份，分別用普蒂迪爾公牛稀釋液、特里拉迪爾公豬稀釋液、仙女座馬稀釋液三種稀釋液稀釋(稀釋液與蒸餾水配伍比例為常用比例1∶ 1∶ 5)，置于同等條件下封裝、平衡和冷凍，并解凍測活力。

1.2.4 稀釋液配比濃度對比 將1.2.3 中抗凍效果最好稀釋液，按 1∶ 0.75、1∶ 1.5、1∶ 3、1∶ 6不同比例分別配制。挑選6頭離心后活力為(7.0±0.50)%的種公驢精液，均分為4等份，分別用上述比例稀釋液稀釋，同等條件下封裝、平衡和冷凍，并解凍測活力。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 將記錄的數(shù)據(jù)錄入Excel 2010制成電子表格，錄完入后再由他人核查數(shù)據(jù)，保證數(shù)據(jù)的高度精確。導入SPSS 21.0對數(shù)據(jù)資料經(jīng)計算雙側t檢驗S-N-K輸出，試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標準差”表示。本文表格中數(shù)據(jù)為每種稀釋液中6頭精液活力計算平均值所得，不同稀釋液配比濃度同樣只計算平均值。

2 結果

2.1 一般臨床癥狀觀察

種公驢在采精期間未見明顯病癥，采精前后體重為(409.29±41.21) kg、(411.68±36.43) kg，P=0.536>0.05；采精前后體溫為(37.4±1.21) ℃、(37.3±1.29) ℃，P=0.378>0.05，體溫、體重差異均不顯著，說明采精不會對實驗動物造成影響。

2.2 各類稀釋液凍精解凍活力比較

將3種稀釋液稀釋冷凍6頭種公驢原精，解凍后精子活力雙側t檢驗S-N-K法輸出，由表1 看出，組Ⅱ與組Ⅰ、組Ⅲ相比精子活力明顯偏高(P<0.01)，說明組Ⅱ稀釋液抗凍性明顯優(yōu)于Ⅰ組、Ⅲ組；組Ⅱ與組Ⅰ、組Ⅲ相比精子畸形率顯著降低(P<0.05)，說明組Ⅱ稀釋液在冷凍過程中對精子生理結構的保護作用強于Ⅰ組、Ⅲ組。

表1 各組精液平均指標比較

2.3 配比濃度凍精解凍活力比較

表2，組1∶ 3與其它3組對比精子活力明顯提高(P<0.01)，說明Ⅱ組稀釋液在配伍比例為1∶ 3時最適合凍精復蘇，能最大限度保存精子生殖功能;組1∶ 1.5、組1∶ 3與其它Ⅱ組對比精子畸形率顯著降低(P<0.05)，但組1∶ 1.5、組1∶ 3精子畸形率差異不明顯，說明Ⅱ組稀釋液在配伍比例為1∶ 3與1∶ 1.5都能最大限度保護精子生理結構，降低畸形精子的發(fā)生率。

表2 各組精液平均指標比較

3 討論

3.1 驢冷凍精液制作

精液由精子和精液分兩部分，其體積取決于副性腺分泌的精清[4]。公畜副性腺由精囊腺、前列腺、尿道球腺組成，驢是馬屬動物副性腺發(fā)達射精液量較多(>100 mL)，但精子密度小不能直接稀釋冷凍，必須將精子、精清分離。將采集的驢精液1 850 r/min離心9min分離精清[5-9]。離心后加入稀釋液方可冷凍，目前沒有國際、國內(nèi)標準，參照《牛冷凍精液生產(chǎn)技術規(guī)程》標準號：NY/T 1234-2018開展驢冷凍精液研發(fā)工作，活力檢測、精液封裝、平衡冷凍以牛冷凍精液制作方法為暫時標準。

3.2 驢稀釋液配方

冷凍精液稀釋液配方多種多樣，目前市場并無成品驢專用稀釋液，結合已有的稀釋液找出適合驢稀釋液配方。鄧雙義研究表明丙三醇(俗稱甘油)保護精子細胞膜的結構和通透性，降低精子的畸形率[10]。稀釋液中加入的甘油比例不同導致精子畸形發(fā)生率不同，但甘油濃度超過4%增大了稀釋液滲透壓，精細胞脫水破壞細胞結構。甘油一定程度上保護了精子細胞膜完整性。

4 結論

對比普蒂迪爾公牛稀釋液、特里拉迪爾公豬稀釋液、仙女座馬稀釋液3種稀釋液凍精解凍活力發(fā)現(xiàn)，特里拉迪爾公豬稀釋液在冷凍過程中能明顯降低驢精子的畸形率，提升精子活力；對比特里拉迪爾公豬稀釋液不同配比濃度結果表明，該稀釋液在配伍比例(稀釋液與蒸餾水比值)為1∶ 3時最適合凍精復蘇，能最大限度保存精子生殖功能，因此特里拉迪爾公豬稀釋液更適合于公驢精子冷凍過程。