唐 嘉， 楊 宇， 楊 凱， 和占星， 金顯棟， 亐開興*， 王 昕*

(1. 陜西省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.云南省草地動(dòng)物科學(xué)研究院，昆明 650212)

中甸牦牛是云南省迪慶州高原藏區(qū)獨(dú)有的牦牛品種，是高寒地區(qū)的役、乳、肉兼用型地方優(yōu)良品種[1-2]。中甸牦牛適應(yīng)高山自然氣候環(huán)境，主要生活在海拔3 000～4 300 m高原和高山垂直帶，具有耐嚴(yán)寒、耐低氧、耐放牧、耐粗飼、采食能力強(qiáng)等優(yōu)良特點(diǎn)[3-4]。牦牛養(yǎng)殖業(yè)是高度適應(yīng)高寒生態(tài)條件的特定生態(tài)養(yǎng)殖模式，是廣大農(nóng)牧民世代經(jīng)營并賴以生存和發(fā)展的基礎(chǔ)產(chǎn)業(yè)，發(fā)展牦牛業(yè)對(duì)提高藏區(qū)人民生活水平、繁榮藏區(qū)經(jīng)濟(jì)和文化傳承等具有重要作用。但其目前仍存在生產(chǎn)性能低、牧場(chǎng)載畜力下降、新技術(shù)推廣遲緩等問題[3,5]，中甸牦牛的基礎(chǔ)研究薄弱。

低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)是一種基本的螺旋-環(huán)-螺旋蛋白，由α和β兩種蛋白質(zhì)的異質(zhì)體組成，是在研究低氧誘導(dǎo)的EPO(促紅細(xì)胞生成素，erythropoietin)基因表達(dá)時(shí)被發(fā)現(xiàn)的[6]。HIF-1α基因受缺氧信號(hào)的調(diào)控，是HIF-1的活性亞基；HIF-1β亞基在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)，起結(jié)構(gòu)性作用。HIF-1α亞基在翻譯后會(huì)被降解，因而在正常氧飽和度下的細(xì)胞中基本檢測(cè)不到HIF-1α亞基的表達(dá)；而在缺氧狀態(tài)下，HIF-1α亞基的降解被抑制，α和β亞基形成有活性的HIF-1，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄[7-9]。通過氧分壓對(duì)HIF-1活性的控制是通過改變HIF-1α亞基的水平來實(shí)現(xiàn)的[8,10]。HIF-1缺氧誘導(dǎo)的特異性和敏感性在哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)錄因子中獨(dú)一無二，作為急、慢性缺氧生理反應(yīng)的重要介導(dǎo)因子，HIF-1是介導(dǎo)這些反應(yīng)的包括心臟和血管的系統(tǒng)發(fā)育所必需的。無論是在細(xì)胞還是在機(jī)體的局部水平，HIF-1都是低氧信號(hào)傳遞的重要樞紐，而HIF-1α被認(rèn)為是細(xì)胞低氧感應(yīng)所必需的核心轉(zhuǎn)錄因子[8,10-12]。

牦牛具有很多生理學(xué)特征使它們適應(yīng)高海拔地區(qū)的生活，包括心肺體積大、覓食能力強(qiáng)、對(duì)外界環(huán)境敏感和能量代謝高等，在天然的低氧環(huán)境經(jīng)過長期的進(jìn)化也形成了特有的耐低氧適應(yīng)機(jī)制，牦牛對(duì)低氧環(huán)境在分子層面上做出的適應(yīng)性和調(diào)控是極其復(fù)雜多樣的[13-14]。然而高原地區(qū)常年缺草缺料，牦牛產(chǎn)業(yè)處于傳統(tǒng)“夏肥-秋壯-冬困-春乏”的惡性循環(huán)中，尋求草料豐富的農(nóng)區(qū)進(jìn)行異地育肥勢(shì)在必行，可大幅度提高牦牛生產(chǎn)力，縮短飼養(yǎng)周期，同時(shí)改善牛肉品質(zhì)，獲取較高的養(yǎng)殖效益[5,15]。本試驗(yàn)為了比較中甸牦牛HIF-1α基因在不同飼養(yǎng)條件下的心臟、肝臟、肺臟、腎臟、背脂、胰臟和眼肌等組織器官中的差異表達(dá)水平，以揭示牦牛這一高原土著哺乳動(dòng)物的耐低氧、高海拔及對(duì)不同飼養(yǎng)條件下的分子適應(yīng)機(jī)制，為探討異地馴養(yǎng)牦牛的生產(chǎn)問題提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集 樣本采自于高山放牧海拔>3 200 m云南省香格里拉市(年均氣溫5.8 ℃)的成年中甸牦牛7頭(>5歲，年均氣溫5.8 ℃)和異地圈養(yǎng)于1 910 m昆明小哨示范牧場(chǎng)1.5年以上(年均氣溫14.92 ℃)育肥的中甸牦牛2頭(>3.5歲)。屠宰后取其心臟、肝臟、肺臟、腎臟、背脂、胰臟和眼肌等組織器官，剪碎后放入凍存管進(jìn)液氮罐保存，帶回實(shí)驗(yàn)室-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑 RNAiso Plus購自寶生物工程(大連)有限公司(Cat. No.9109)；DEPC水購自Sigma公司(Cat. No.V900882)。熒光定量PCR相關(guān)試劑：反轉(zhuǎn)錄試劑iScriptTM cDNA Synthesis Kit購自BIO-RAD公司(Cat. No.170-8891)；熒光染料SsoFastTMEvaGreen Supermix購自BIO-RAD公司(Cat. No.172-5201AP)。

1.1.3 主要儀器 超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1FD)購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；高速冷凍離心機(jī)(75005440)購自Thermo Fisher Scientific公司；凝膠成像系統(tǒng)(Tanon-1600)購自天能科技有限公司；電泳儀(DYY-7C)購自北京六一儀器廠；移液器(KA0052521)購自DRAGON公司；熒光定量PCR儀(580BR 12007)購自BIO-RAD公司、恒溫水浴鍋(HWS12)購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)NCBI GenBank中公布的HIF-1α基因序列(NC_037337.1)和以GAPDH基因(NM_001034034)為內(nèi)參設(shè)計(jì)引物(表1)用于PCR檢測(cè)，引物由昆明碩擎生物科技有限公司合成。

表1 引物信息表

1.2.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 剪取100 mg左右解凍組織樣品加入到研磨器中，待組織樣品研碎后加入1 mL RNAiso Plus(TRIZOL)，震蕩使其緩沖液與樣本均勻混合。將離心管橫放在架子上，4 ℃靜置20 min后，12 000 r/min離心10 min。取上清(600～800 μL)，取上清過程中盡量不要吸到組織碎片，加入200 μL氯仿，在震蕩器上震蕩混勻后，4℃靜置10 min，12 000 r/min離心15 min。離心結(jié)束后，用移液器小心吸取上層無色溶液(400～600 μL)于無RNase的1.5 mL離心管中，加入與上清等體積的異丙醇，上下顛倒充分搖勻，4 ℃靜置10 min，12 000 r/min離心10 min，使RNA沉淀于離心管底部。小心倒去上清，向離心管內(nèi)加1 mL 75%乙醇進(jìn)行洗滌，顛倒混勻后4 ℃靜置10 min，12 000 r/min離心10 min。棄去上清，輕甩，用吸水紙吸干離心管壁上的液體，可以在底部看到RNA沉淀，根據(jù)沉淀的大小，用不同體積的DEPC水(50～100 μL)溶解。將溶解后的RNA分裝到PCR管后凍存于-80 ℃。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(iScriptTM cDNA Synthesis Kit)說明書，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系如表2所示。

表2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng) 反應(yīng)體系如下：SYBR 10 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，cDNA 1.5 μL，DEPC水6.9 μL，反應(yīng)總體系為20 μL。熒光定量PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性90 s；95 ℃變性15 s，95 ℃～55 ℃梯度退火20 s；循環(huán)35次；收集溶解曲線65 ℃升高到95 ℃，每5 s升高0.5 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

首先計(jì)算HIF-1α基因的相對(duì)表達(dá)量，再采用SAS 9.2軟件的GLM程序分析不同器官組織和不同飼養(yǎng)條件對(duì)中甸牦牛HIF-1α基因相對(duì)表達(dá)量的影響，模型如下：

Yijkl=μ+ti+aj+tak+eijkl

其中：Yijkl為HIF-1α基因相對(duì)表達(dá)量；μ為總體均值效應(yīng)；ti為不同組織器官效應(yīng)；aj為不同飼養(yǎng)條件效應(yīng)；tak為不同組織器官和不同飼養(yǎng)條件的互作效應(yīng)；eijkl為隨機(jī)殘差效應(yīng)。結(jié)果用“最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并進(jìn)行多重比較；P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 HIF-1α基因在不同飼養(yǎng)條件下及不同組織器官中的表達(dá)分析

由表3可看出，HIF-1α基因在不同飼養(yǎng)條件下的中甸牦牛不同組織器官相對(duì)表達(dá)量的最小二乘方差分析結(jié)果表明，不同組織器官的HIF-1α基因相對(duì)表達(dá)量有極顯著的差異(P<0.01)，異地飼養(yǎng)對(duì)HIF-1α基因相對(duì)表達(dá)量有顯著影響(P<0.05)。

表3 不同飼養(yǎng)條件下中甸牦牛不同組織器官HIF-1α基因相對(duì)表達(dá)量的最小二乘分析

由圖1可見，通過比較HIF-1α基因在不同飼養(yǎng)條件下及不同組織器官中的相對(duì)表達(dá)量，HIF-1α基因的相對(duì)表達(dá)量在高山放牧的中甸牦牛肝臟中顯著高于圈養(yǎng)育肥的(P<0.05)，其余組間差異不顯著(P>0.05)。

圖1 中甸牦牛HIF-1α基因在不同飼養(yǎng)條件下及不同組織器官中的表達(dá)量

2.2 HIF-1α基因在不同組織器官中的表達(dá)分析

由表4看出，HIF-1α基因在中甸牦牛不同組織器官中相對(duì)表達(dá)量的最小二乘均值(LSM)及多重比較結(jié)果表明，HIF-1α基因在中甸牦牛的肝臟、腎臟、心臟和背脂中表達(dá)量較其它組織器官的高(P<0.05)，肝臟中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于腹脂、眼肌、肺臟、胰臟中(P<0.01)，腎臟、心臟中的表達(dá)量極顯著高于肺臟、胰臟中(P<0.01)，顯著高于腹脂、眼肌中(P<0.05)；在肺臟、胰臟、眼肌和腹脂之間的表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)，以胰臟、肺臟和眼肌的表達(dá)量最少。

表4 中甸牦牛不同組織器官HIF-1α基因相對(duì)表達(dá)量的最小二乘分析

2.3 HIF-1α基因在不同飼養(yǎng)條件下的表達(dá)分析

由表5看出，HIF-1α基因在不同飼養(yǎng)條件的中甸牦牛中相對(duì)表達(dá)量的LSM及多重比較結(jié)果表明，HIF-1α基因在高山放牧的中甸牦牛中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于圈養(yǎng)育肥的中甸牦牛，是異地圈養(yǎng)表達(dá)量的1.7倍(P<0.05)。

表5 不同飼養(yǎng)條件下中甸牦牛HIF-1α基因相對(duì)表達(dá)量的最小二乘分析

3 討論

HIF-1α是作為低氧應(yīng)答信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因，通過調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)水平，還能介導(dǎo)能量代謝、細(xì)胞生長和凋亡、血管新生、氧的攝取和運(yùn)輸?shù)缺磉_(dá)，以及氧平衡狀態(tài)的調(diào)節(jié)。常氧狀態(tài)下，HIF-1α經(jīng)泛素化后迅速被蛋白酶降解，而在低氧高寒條件下HIF-1α在核內(nèi)迅速積累，與HIF-1β結(jié)合形成功能性轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體HIF-1，呈高度表達(dá)，是維持低氧條件下氧平衡的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子[10-11,16-18]。通過研究高原動(dòng)物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性機(jī)制，有人發(fā)現(xiàn)機(jī)體并不依賴某些器官功能的變化，更主要的是通過調(diào)整細(xì)胞代謝、低氧誘導(dǎo)因子HIF-1α信號(hào)通路的基因表達(dá)等分子水平的改變而適應(yīng)高原環(huán)境，所進(jìn)化的適應(yīng)性機(jī)制主要有肌紅蛋白(Mb)及血紅蛋白(Hb)含量增加、血紅蛋白氧親和力增加、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及舒張因子(EDRF)含量增加、細(xì)胞代謝及內(nèi)呼吸適應(yīng)等[11,16-18]。研究發(fā)現(xiàn)，低氧應(yīng)答信號(hào)通路中的重要基因HIF-1α在牦牛以及藏族人群中都受到劇烈的正向選擇，表明該基因在高海拔適應(yīng)性中具有重要作用[19-20]。高原地區(qū)地理位置獨(dú)特、自然環(huán)境惡劣，因而牦牛需要克服低氧、低溫、高紫外線輻射等惡劣因素，除了生理形態(tài)上適應(yīng)，其基因組也發(fā)生了極大的變化[21]。

HIF-1α基因mRNA表達(dá)為揭示高原土著哺乳動(dòng)物的適應(yīng)性機(jī)制提供了分子基礎(chǔ)，在各種哺乳動(dòng)物如藏羚羊、高原鼠兔、鼴鼠、牦牛等的不同組織中廣泛表達(dá)，具有組織特異性[22-31]。在各種組織中的HIF-1α基因表達(dá)水平不一，對(duì)于藏羚羊，HIF-1α基因表達(dá)以肺臟最高，顯著高于藏綿羊和平原綿羊，而通過馴化的藏綿羊的基因表達(dá)水平也顯著低于藏羚羊[23]，馬崗鵝HIF-1α基因表達(dá)以肺臟和胰腺較高[24]。而在牦牛的報(bào)道中，HIF-1α基因在麥洼牦牛肝臟和腦中高度表達(dá)[25]，在青海家牦牛睪丸和脾臟中的表達(dá)量高于其他組織器官[26]，而在甘南牦牛中其在心臟中表達(dá)量高于骨骼肌和肝臟，肝臟中的表達(dá)量在三者中最低[27]。本研究首次建立中甸牦牛HIF-1α基因表達(dá)差異的檢測(cè)方法，高山放牧和異地飼養(yǎng)的中甸牦牛在不同組織器官中均有表達(dá)，在肝臟、腎臟、心臟中顯著高表達(dá)，在眼肌、胰臟和肺臟中的表達(dá)量較少。因此，推測(cè)不同高原土著動(dòng)物的HIF-1α基因在組織中表達(dá)的特異性可能對(duì)于維持體內(nèi)HIF-1α高水平有一定的調(diào)節(jié)作用，而且不同高原土著動(dòng)物中HIF-1α基因的組織差異性較大，其遺傳機(jī)制需進(jìn)一步研究。

本研究通過將原本在海拔>3 200 m、年均氣溫5.8℃的迪慶州高山放牧的中甸牦牛異地圈養(yǎng)于海拔1 910 m、平均氣溫14.9 ℃小哨示范牧場(chǎng)，通過比較二者HIF-1α基因的相對(duì)表達(dá)量，首次發(fā)現(xiàn)高山放牧的中甸牦牛中顯著高于圈養(yǎng)育肥(昆明飼養(yǎng)時(shí)間>1.5年)的表達(dá)水平，相差1.7倍多，跟鼴鼠的低氧調(diào)節(jié)機(jī)制接近[31]；同時(shí)，發(fā)現(xiàn)高山放牧的中甸牦牛HIF-1α基因在肝臟的相對(duì)表達(dá)量顯著高于圈養(yǎng)育肥的水平。本研究結(jié)果與藏雞胚胎的表達(dá)模式不一樣[32]，與短時(shí)間(7 d)飼喂的高原鼠兔的表達(dá)水平也相去甚遠(yuǎn)[33]。本研究結(jié)果可能從一個(gè)側(cè)面反應(yīng)了中甸牦牛適應(yīng)異地飼養(yǎng)的分子變化水平，但要全面綜合探討高原動(dòng)物不同組織器官中HIF-1α基因表達(dá)差異，有待考慮更多基因的表達(dá)水平。

4 結(jié)論

作為低氧應(yīng)答信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因，HIF-1α基因在中甸牦牛不同組織器官中廣泛表達(dá)且具有組織特異性，其在不同海拔飼養(yǎng)條件的相對(duì)表達(dá)量具有顯著差異。