邵紅，張林雁，夏立勇，佟海山，李旭陽(yáng)，周玉龍，張旭

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)人文學(xué)院；3.黑龍江省東寧市畜牧獸醫(yī)服務(wù)總站；4.杜爾伯特蒙古族自治縣畜牧技術(shù)服務(wù)中心）

牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）是牛病毒性腹瀉/黏膜病的病原體。BVDV 屬于黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（pestivirus）成員，基因組由大約12.3 kb 的單股正鏈RNA 組成。BVDV基因組是單個(gè)開(kāi)放閱讀框架（ORF），非翻譯區(qū)（UTRs）位于基因組的兩側(cè)。基因組編碼一個(gè)大的多肽，可進(jìn)一步被細(xì)胞和病毒的蛋白酶切割成4 個(gè)結(jié)構(gòu)性的和8 個(gè)非結(jié)構(gòu)性蛋白，這些病毒粒子蛋白編碼的順序?yàn)镹H2-Npro-capsid-Erns-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH[1-2]。根據(jù)不同的分型標(biāo)準(zhǔn)，BVDV 僅有一種血清型和兩種生物型。基于5’-UTR、Npro和E2 基因分型結(jié)果，BVDV分離株被分成2 個(gè)主要基因型BVDV-1 和BVDV-2，以及新出現(xiàn)的HoBi-like 病毒，被稱為BVDV-3[3-4]。BVDV基因組的易變異性導(dǎo)致其基因亞型眾多，BVDV-1 被進(jìn)一步分成18 個(gè)亞型1a-1u，BVDV-2 被分成3 個(gè)亞型2a-2c[5-8]。BVDV 全基因組序列蘊(yùn)含大量的生物信息，是研究其致病機(jī)制和開(kāi)發(fā)新型疫苗工作的前提。

BVDV 能夠感染牛、鹿等多種反芻獸，引起的臨床癥狀復(fù)雜多樣，包括腹瀉、黏膜糜爛潰瘍、血小板減少癥、繁殖障礙、免疫抑制以及持續(xù)感染等[9-12]。尤其是BVDV 引起的持續(xù)感染（PI）牛作為傳染源也可以發(fā)展成黏膜病，給養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失。2010年黑龍江某奶牛場(chǎng)荷斯坦奶牛爆發(fā)黏膜病，病牛表現(xiàn)為嚴(yán)重腹瀉、口腔、食道、胃腸道黏膜糜爛潰瘍，以及全身內(nèi)臟臟器官表現(xiàn)出血綜合癥病變，發(fā)病率20%病死率70%，自病死牛脾臟分離到BVDV HJ-1株，屬于BVDV-1b 基因亞型，而且該病毒能夠誘導(dǎo)MDBK 細(xì)胞發(fā)生自噬[13-15]。目前，已報(bào)道的全基因組序列的BVDV 毒株多來(lái)自于持續(xù)感染動(dòng)物，對(duì)于引起黏膜病及出血性綜合癥高致病性BVDV 毒株基因組信息資源缺乏。因此，研究通過(guò)分段重疊PCR 擴(kuò)增法獲取BVDV HJ-1 株全基因組序列并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探究BVDV HJ-1 株的遺傳多樣性，為BVDV 的診斷、疫苗研制和致病機(jī)理研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株、細(xì)胞和試劑

BVDV HJ-1 株和基因工程菌E.coli DH5α 為實(shí)驗(yàn)室保存[9]。MDBK 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。Trizol Reagent、DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清和反轉(zhuǎn)試劑盒均為T(mén)hermo Fisher Scientific 產(chǎn)品；DNA 膠回收試劑盒為Omega 產(chǎn)品；LA Taq DNA 聚合酶、dNTPs、pMD18-T載體和DNA Marker DL2000 均為T(mén)aKaRa 產(chǎn)品。

1.2 病毒的擴(kuò)增

將分離株病毒BVDV HJ-1 接種于匯合度為70%的MDBK 細(xì)胞，37 ℃吸附1 h，間隔15 min 輕輕搖晃一次，加入維持液適量。37 ℃CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待60%～70%細(xì)胞發(fā)生病變時(shí)收毒，將病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3 次以后，4 000 r·min-1，離心5 min，上清液-80 ℃保存。

1.3 引物的設(shè)計(jì)合成

參考BVDV-1b CP7 毒株全基因序列（GenBank 登錄號(hào)U633479），經(jīng)序列比對(duì)于保守區(qū)設(shè)計(jì)了13 對(duì)特異性的引物，相鄰擴(kuò)增片段間重疊不少于15 bp，見(jiàn)表1。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 病毒RNA 制備及RT-PCR

應(yīng)用制備的BVDV RNA 按照cDNA 合成試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA 后進(jìn)行PCR 反應(yīng)，50 μL 體系：LA Taq Buffer 5 μL，2.5 mM 的dNTPs 5 μL，10 μM 的上下游引物各2 μL，cDNA 2.0 μL，LA Taq DNA 聚合酶（5 U·μL-1）0.2 μL，ddH2O 33.8 μL。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃5 min；94 ℃30 s，退火30 s，溫度見(jiàn)表1，72 ℃120 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃7 min。取5 μL PCR 產(chǎn)物電泳分析結(jié)果。

表1 BVDV HJ-1 株全基因擴(kuò)增引物及退火溫度Table 1 Amplification primers and annealing temperature of BVDV HJ-1 strain

1.5 目的基因克隆測(cè)序

按照Omega 膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)純化PCR 產(chǎn)物，按pMD18-T 載體說(shuō)明書(shū)進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，挑選經(jīng)PCR 鑒定陽(yáng)性重組菌3 株，委托北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序。

1.6 生物信息分析

應(yīng)用DNAMAN 分析軟件對(duì)各測(cè)定片段進(jìn)行拼接，獲得BVDV HJ-1 株全基因組序列（GenBank 登錄號(hào)KU756226.1）并進(jìn)行基因分析。利用MEGA6.0軟件制作進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行親緣性分析。用DNA Star 進(jìn)行全基因核苷酸序列分析，運(yùn)用SWISS-MODEL 在線軟件對(duì)測(cè)序所得到的BVDV HJ-1 株全基因進(jìn)行氨基酸序列的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；運(yùn)用DNAStar MegAlign 分析軟件進(jìn)行核苷酸分析，并且建立進(jìn)化樹(shù)，同時(shí)進(jìn)行同源性分析；運(yùn)用RNA structure 軟件分析分析5’UTR一級(jí)結(jié)構(gòu)與二級(jí)結(jié)構(gòu)的差異；運(yùn)用DNAStar Protean分析軟件分析各種氨基酸含量，并且運(yùn)用ExPaXy 在線軟件對(duì)測(cè)得的結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行疏水性、柔性，以及跨膜區(qū)域的預(yù)測(cè)；使用CBS 網(wǎng)站NetNGlyc 1.0 在線分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)中測(cè)序所得到的結(jié)構(gòu)蛋白片段進(jìn)行糖基化位點(diǎn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 BVDV HJ-1 全基因克隆測(cè)序

病毒的全基因的擴(kuò)增與鑒定：用LA Taq DNA 聚合酶進(jìn)行RT-PCR 克隆獲得覆蓋HJ-1 株全基因組并且相互重疊的13 條目的片段，分別為P1（1 023 bp）、P2（1 305 bp）、P3（1 308 bp）、P4（1 250 bp）、P5（1 278 bp）、P6（1 123 bp）、P7（1 042 bp）、P8（1 517 bp）、P9（1 000 bp）、P10（890 bp）、P11（610 bp）、P12（795 bp）、P13（627 bp）。各目的片段PCR 結(jié)果見(jiàn)圖1，從各圖可見(jiàn)PCR 結(jié)果獲得的目的片段與預(yù)期的大小相符合，分別將各PCR 產(chǎn)物純化后連接到p-MD18-T 載體進(jìn)行測(cè)序。

圖1 覆蓋HJ-1 全基因的13 個(gè)片段（P1-P13）的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 13 Fragments covering the complete genome of BVDV（P1-P13）

2.2 BVDV HJ-1 全基組序列分析

把13 個(gè)BVDV HJ-1 基因組PCR 片段克隆重組菌送至上海生工生物公司測(cè)序，把側(cè)學(xué)正確的基因序列使用Lasergene 分析軟件進(jìn)行組裝出完整基因序列。經(jīng)分析結(jié)果表明，BVDV HJ-1 株全基因長(zhǎng)度為12 282 nt，共編碼3 912 個(gè)氨基酸，其中5’UTR 長(zhǎng)度為368 nt，編碼區(qū)長(zhǎng)11 736 nt，3’UTR 長(zhǎng)度為178 nt，HJ-1 基因組的組成見(jiàn)表2，全基因核苷酸中含有31.9%A、25.6%G、22.3%U 和20.2%C。HJ-1 株全基因編碼的氨基酸中亮氨酸（Leu）含量最高，具體見(jiàn)表3。

表2 BVDV HJ-1 株基因組的組成Table 2 The genomic constitution of the BVDV HJ-1 strain

表3 HJ-1 株BVDV 編碼氨基酸含量分析Table 3 Amino acid composition of BVDV HJ-1 Strain

2.3 BVDV HJ-1 株序列同源性分析

BVDV HJ-1 株的全基因組序列與13 株BVDV參考株進(jìn)行序列比較，結(jié)果HJ-1 株與各參考毒株核苷酸同源性在70.1%～93.5%，其中與BVDV-1b 基因亞型的CP7 株的相似度最高達(dá)到93.5%；與NewYork93、Orengon24V、JZ05-1 和C413 株等差距較大，同源性僅為70.1%～75%，說(shuō)明HJ-1 株屬于BVDV-1b 基因亞型。具體結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 HJ-1 株與GenBank 上病毒株全基因核苷酸同源性比較結(jié)果Fig.2 Result of sequence homology comparing the HJ-1 strains with whole genes from GenBank strains

BVDV HJ-1 株與參考株的各基因片段比較可見(jiàn)，5’UTR 核苷酸同源性為66.9%～96.9%，Npro 核苷酸同源性為70.8%～91.3%，C 核苷酸同源性為70.5%～93.3%，E0 核苷酸同源性為72.0%～93.0%，E1 核苷酸同源性為63.8%～88.5%，P7-NS2 核苷酸同源性為68.5%～91.3%，NS3 核苷酸同源性為75.6%～93.0%，NS4A 核苷酸同源性為49.0%～93.0%，NS4B 核苷酸同源性為49.2%～79.6%，NS5A 核苷酸同源性為66.0%～92.5%，NS5B 核苷酸同源性為71.6%～93.6%，3’UTR 核苷酸同源性為66.2%～95.5%。由表4 可見(jiàn)非結(jié)構(gòu)蛋白相比結(jié)構(gòu)蛋白變化大，并且E1 相對(duì)于E2 變異較大，非結(jié)構(gòu)蛋白中NS3 與NS4A 相對(duì)穩(wěn)定，整個(gè)基因比較5’UTR 和3’UTR 相對(duì)更穩(wěn)定，5’UTR最穩(wěn)定更為保守。

表4 HJ-1 株與參考株的核苷酸同源性比較（%）Table 4 Whole nucleotide sequence comparison of HJ-1 stains with other strains

2.4 BVDV HJ-1 株與參考毒株核苷酸序列進(jìn)化分析

把HJ-1 株與其他12 株BVDV 及1 株CSFV 全基因核苷酸進(jìn)行比對(duì)并繪制進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示HJ-1株與CP7 株進(jìn)化關(guān)系最密切，在同一進(jìn)化分枝，同屬于BVDV-1b 基因亞型，見(jiàn)圖3。

圖3 BVDV HJ-1 株全基因系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of the whole gene of BVDV

2.5 BVDV HJ-1 株結(jié)構(gòu)蛋白的生物學(xué)分析

BVDV HJ-1 株結(jié)構(gòu)蛋白的氨基酸序列理化性質(zhì)的分析：親水性/疏水性是了解蛋白質(zhì)性質(zhì)的一個(gè)重要特征，HJ-1 株結(jié)構(gòu)蛋白的親水性/疏水性為間隔性分布，HJ-1 株結(jié)構(gòu)蛋白主要由四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，共899個(gè)氨基酸組成，各蛋白的氨基酸位置如下：C 蛋白（1-103）、E0（104-330）、E1（331-525）E2（526-889）親水區(qū)域主要在C 蛋白區(qū)域，疏水蛋白主要在E2 蛋白區(qū)域，見(jiàn)圖4。結(jié)構(gòu)蛋白E1-E2 二聚體的形成主要是由于跨膜區(qū)域富含帶電荷的氨基酸殘基，通過(guò)對(duì)氨基酸序列的分析可得到5 個(gè)潛在的跨膜信號(hào)區(qū)域，分別為95-110、390-410、480-510、645-660、870-892。其中3 個(gè)區(qū)域信號(hào)較好分別為95-110、480-510、870-892，形成跨膜螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域，即其中1-94 區(qū)域位于膜內(nèi)區(qū)域，在95-110 區(qū)域形成跨膜螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域，然后進(jìn)入膜內(nèi)區(qū)域，在480-510 和870-892 區(qū)域形成跨膜螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域，在893-899 區(qū)域又進(jìn)入膜內(nèi)，但是870-892 這一區(qū)域的跨膜信號(hào)起到主要的作用，見(jiàn)圖5。

圖4 BVDV HJ-1 株結(jié)構(gòu)蛋白推導(dǎo)氨基酸序列的疏水性Fig.4 Hydrophobic property of BVDV HJ-1 structural protein

圖5 BVDV HJ-1 株推導(dǎo)結(jié)構(gòu)蛋白氨基酸序列跨膜性分析Fig.5 Transmembrane tendency of BVDV HJ-1 structural protein

BVDV HJ-1 株結(jié)構(gòu)蛋白糖基化位點(diǎn)的分析發(fā)現(xiàn)：BVDV 結(jié)構(gòu)蛋白上富含糖基化位點(diǎn)，共有14 個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，見(jiàn)圖6，其中E0 蛋白上8 個(gè)糖基化位點(diǎn)，E1 蛋白上2 個(gè)糖基化位點(diǎn)，E2 蛋白上4 個(gè)糖基化位點(diǎn)，主要的糖基化位點(diǎn)位于E0 和E2 蛋白上，經(jīng)過(guò)與參考毒株的對(duì)比可見(jiàn)，BVDV1 型與BVDV2型結(jié)構(gòu)蛋白的糖基化位點(diǎn)有兩處不同，CSFV 結(jié)構(gòu)蛋白的糖基化位點(diǎn)較少只有3 個(gè)，但是CFSV 在E2 蛋白上的711 位氨基酸糖基化位點(diǎn)與BVDV-1 型和BVDV-2 型相同，BVDV-2 型E0 蛋白相對(duì)BVDV-1型在168 位氨基酸上少了一個(gè)糖基化位點(diǎn)，BVDV-1型E2 蛋白相對(duì)BVDV-1 型在784 位氨基酸上少了一個(gè)糖基化位點(diǎn)，如表5 所示。

表5 HJ-1 株與參考毒株N-糖基化位點(diǎn)分析與比較Table 5 Potential N-linked glycosylation sites of HJ-1 in structural proteins among reference strains

圖6 BVDV HJ-1 株N-糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.6 Predicted N-glycosylation sites of BVDV strain HJ-1

3 討論

實(shí)驗(yàn)通過(guò)MDBK 細(xì)胞增殖BVDV HJ-1 分離株，通過(guò)觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況發(fā)現(xiàn)該毒株能夠在MDBK 上穩(wěn)定的生長(zhǎng)，致使細(xì)胞產(chǎn)生典型的CPE，為一株CP型毒株。并通過(guò)PCR 成功分段擴(kuò)增出覆蓋全基因組的13 段基因序列，組裝出完整的全序列，全長(zhǎng)12 282個(gè)核苷酸。通過(guò)全基因組序列、5’UTR 和Npro序列分析其屬于BVDV-1b 基因亞型。由于HJ-1 分離株基因組高度變異，PCR 擴(kuò)增困難，經(jīng)反復(fù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化引物序列最終才成功獲得目的基因。HJ-1 全基因組含有一個(gè)較大的開(kāi)放閱讀框（ORF），共有11 736 個(gè)核苷酸，可編碼為3 912 個(gè)氨基酸，由于該病毒能引起細(xì)胞病變，可以成功的分化成12 個(gè)成熟的蛋白質(zhì)[14，16]。

5’UTR 是BVDV 病毒完成復(fù)制以及基因組表達(dá)復(fù)制必須的，具有重要的初級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)[16]。運(yùn)用RNA structure 軟件可以很容易的預(yù)測(cè)出二級(jí)結(jié)構(gòu)，BVDV HJ-1 株的5’UTR，I 區(qū)和III b-III e 區(qū)相對(duì)比較保守，毒株之間II 區(qū)的二級(jí)結(jié)構(gòu)差異明顯，變異性較高。IRES 位于III b-III e 區(qū)，介導(dǎo)翻譯的起始，含有至少3 個(gè)突變位點(diǎn)，點(diǎn)突變出現(xiàn)在不同的基因片段上，RNA 病毒的突變率高于DNA 病毒，一般突變率分別為10-3-10-4和10-8-10-11[17-18]。5’UTR 是負(fù)責(zé)翻譯轉(zhuǎn)錄關(guān)鍵區(qū)域，回文結(jié)構(gòu)的突變點(diǎn)可決定了基因的類型和分類[14，19]。HJ-1 株病毒在5’UTR 區(qū)與其他毒株差異顯著，具有獨(dú)特的二級(jí)結(jié)構(gòu)，說(shuō)明HJ-1株是一株獨(dú)特的毒株，其生物學(xué)功能差異有待進(jìn)一步研究。

N-糖基化位點(diǎn)的特征主要為Asn-X-Ser/Thr，結(jié)構(gòu)蛋白在糖基化位點(diǎn)的修飾下能夠完成正確的折疊，傳導(dǎo)信號(hào)，抵消消化酶的作用，并且糖基化位點(diǎn)具有識(shí)別病毒抗原的功能[19]。通過(guò)糖基化位點(diǎn)的分析可得知HJ-1 株與BVDV-1b 型毒株CP7（能引起牛黏膜?。┰谔腔稽c(diǎn)上無(wú)較大差異，而與BVDV2型差異較大。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)BVDV HJ-1 株與豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白中有一個(gè)共同的糖基化位點(diǎn)，可能是BVDV與CSFV 具有共同抗原的原因。研究表明糖基化位點(diǎn)對(duì)于病毒的復(fù)制以及抗原識(shí)別等情況下可以起到重要的作用，糖基化位點(diǎn)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)α-葡萄苷酶阻斷劑，具有抗BVDV 的能力，所以通過(guò)研究糖基化位點(diǎn)變化情況可以更深層次的研究BVDV 感染宿主的機(jī)制，為BVDV 未來(lái)防控計(jì)劃提供理論基礎(chǔ)[19-20]。

總之，完成BVDV HJ-1 株全基因測(cè)序豐富了國(guó)內(nèi)BVDV 基因組信息，全基因序列中含有大量的信息，為構(gòu)建反向遺傳系統(tǒng)，研究病毒致病的分子機(jī)制、基因以及蛋白質(zhì)的功能，BVDV 疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。