賀琳，張苗苗，吳紫璇，孫立強，楊克軍

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319）

干旱和鹽堿等非生物逆境是限制植物生長和減少作物產(chǎn)量的主要環(huán)境因素[1-2]。植物為了生存，在長期的進化過程中形成了復(fù)雜而高效的應(yīng)答機制，從分子、細胞、生理和生化水平做出適應(yīng)性調(diào)整，以抵御不利環(huán)境[2]。在植物應(yīng)答非生物逆境過程中，轉(zhuǎn)錄因子起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中規(guī)模最大、種類最豐富的轉(zhuǎn)錄因子之一，其通常又被稱為AREB（ABA-reactive element binding factor）或ABF（ABRE-binding factors）[3]。

bZIPs 家族基因在植物抵御非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，大部分bZIP 基因如ABF2/AREB1，ABF4/AREB2 和ABF3 可以被ABA、干旱和鹽誘導(dǎo)表達[4-5]。一些bZIP 基因的過表達可以提高植物對非生物脅迫的耐受性。例如，ABF3 和ABF4 蛋白通過上調(diào)ABA 和逆境相關(guān)基因表達進而提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對干旱的耐受性[6]。擬南芥bZIP 基因AtTGA4 通過改善硝酸鹽的運輸和同化，提高轉(zhuǎn)基因植物的抗旱性[7]。AtABF3 在苜蓿（Medicago sativa）中過表達降低了葉片的蒸騰速率和活性氧的積累，增強了葉片對干旱、鹽和氧化脅迫的耐受性[8]。OsbZIP23 在水稻中的過表達顯著提高了水稻的抗旱性、耐鹽性以及對ABA 的敏感性[9]。OsbZIP72 在水稻中的過表達可以提高ABA 響應(yīng)基因的表達水平，轉(zhuǎn)基因植物對ABA的敏感性提高，抗旱性增強[10]。干旱和ABA 處理誘導(dǎo)了棉花GhABF2 的表達，但高鹽抑制了GhABF2 的表達，干旱和鹽處理后過表達GhABF2 的棉花脯氨酸含量、超氧化物歧化酶活性和過氧化氫酶活性均顯著高于野生型[11]。玉米ABP9 基因能夠被ABA、H2O2、干旱和鹽誘導(dǎo)表達，過表達ABP9 基因的擬南芥對干旱、鹽、冷和氧化脅迫等多種非生物逆境表現(xiàn)出較強的耐受性[12]。雖然目前關(guān)于bZIP 轉(zhuǎn)錄因子在鹽、旱和冷逆境下的功能研究較多，但是關(guān)于bZIP轉(zhuǎn)錄因子在植物抵御鹽堿復(fù)合脅迫過程中的功能的報道相對較少。

Jakoby 等[13]根據(jù)堿性結(jié)構(gòu)域及保守結(jié)構(gòu)域，將擬南芥的75 個bZIP 類轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員分為A、B、C、D、E、F、G、H、I 和S 類10 個亞家族。其中，A 亞族bZIPs 在種子和植物組織對ABA 和逆境脅迫的響應(yīng)信號網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮重要作用。例如，Ying 等[14]發(fā)現(xiàn)AbZIP 轉(zhuǎn)錄因子ZmbZIP72 在擬南芥中過表達可增強植物的抗旱性和耐鹽性，提高種子對ABA 和滲透脅迫的敏感性。大豆bZIP 基因GmbZIP44，GmbZIP62和GmbZIP78 分別屬于S、C 和G 亞家族，三者在擬南芥中過表達，均能提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽和低溫脅迫的耐受性[15]。B 亞家族的兩個成員AtbZIP17（At2g40950）和AtbZIP28（At3g10800）參與調(diào)控鹽脅迫反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫反應(yīng)[16-17]。F 亞家族是個小亞家族，其成員（F-bZIPs）主要參與調(diào)控植物的缺鋅脅迫反應(yīng)[18-19]。擬南芥僅含有3 個F-bZIPs 基因（At4g35040，At2g16770，At3g51960），其中At3g51960（AtbZIP24）在鹽脅迫網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮負面調(diào)節(jié)作用[20]。有報道指出玉米中有4 條F-bZIPs 基因（GRMZM-2G000171，GRMZM2G055413，GRMZM2G175870，G -RMZM2G033230）[21]，但是迄今功能均未見報道。鑒于此，研究首先采用實時定量PCR 研究F-ZmbZIPs 的表達模式，發(fā)現(xiàn)ZmbZIP76（GRMZM2G055413）可以同時被ABA 和NaHCO3脅迫誘導(dǎo)表達。進而對轉(zhuǎn)基因材料進行深入分析，NaHCO3處理后，與野生型株系相比，ZmbZIP76 轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長顯著增加，脯氨酸水平和活性氧清除能力顯著提高，相反，ZmbZIP76 轉(zhuǎn)基因擬南芥體內(nèi)的過氧化氫含量和丙二醛（MDA）含量顯著降低。研究結(jié)果表明ZmbZIP76 轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控轉(zhuǎn)基因植物的多種生理過程來增強其對鹽堿脅迫的耐受性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

野生型擬南芥（哥倫比亞型）為黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)作物逆境功能組學(xué)實驗室保存。為了獲得過表達ZmbZIP76 的擬南芥株系，構(gòu)建過表達載體35S：ZmbZIP76，轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。挑取活化的EHA105（35S：ZmbZIP76）單菌落培養(yǎng)至OD600 為0.6～0.8，離心沉淀菌體。配制侵染液：5%Sugar+100 μM AS+100 μL·L-1Triton X-100+0.02% Silwet L-77+2 ng·L-16-BA+沉淀后的菌體，補充去離子水使農(nóng)桿菌的OD600 為0.8。侵染擬南芥花序，收集T0 代種子在含有50 mg·L-1卡那霉素的1/2MS 培養(yǎng)基上篩選，獲得T1 代苗，對其進行DNA 水平檢測，檢測成功的株系培養(yǎng)至T3代用于功能研究。

1.2 基因表達分析

為了分析ZmbZIP76 基因在鹽堿脅迫下的表達模式，用100 mM NaHCO3的溶液處理二葉時期的合344 玉米自交系土壤苗0，12，24 和72 h。不同處理條件下的幼苗根和葉分開取樣，液氮速凍，用TRIzol 法提取RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄酶（FastQuant RT kit，TIANGEN，China）反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 模板。以ZmActin1（GRMZM2G126010）為內(nèi)參，所用引物序列見表1。反應(yīng)體系為10 μL：SYBR Premix Ex TaqTmⅡ（TaKaRa公司）5 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，cDNA模板1 μL，無菌雙蒸餾水2 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃3 min；95 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，40 個循環(huán)。每個處理3 次重復(fù)。采用2-ΔΔCt方法計算各基因表達量，利用SPSS18.0 進行差異顯著性分析。

表1 熒光定量PCR 引物序列Table 1 Primers of fluorescent quantitative PCR

1.3 生長表型分析

利用10% NaClO對不同株系（WT、OE3 和OE16）的擬南芥種子進行消毒。將消毒后的種子均勻播種于1/2 MS 培養(yǎng)基上，在22±2 ℃，光照強度100 μmol·m-2·s-1，光照周期為16 h 光照/8 h 黑暗的人工氣候室中培養(yǎng)，1 周后將長勢相同的幼苗移栽到含有NaHCO3（0、6 mM）的1/2 MS 培養(yǎng)基表面進行豎直培養(yǎng)，脅迫1 周后對相同處理條件下OE 株系與WT 株系之間根長的差異進行統(tǒng)計分析（P<0.05，one-way ANOVA）。每個株系每個處理至少50 株苗，實驗進行3 次獨立的生物學(xué)重復(fù)。

1.4 生理指標的測定

選取1 周苗齡的野生型株系（WT）、過表達株系（OE3 和OE16）分別置于含有0、6 mM NaHCO3的1/2 MS 培養(yǎng)基上培養(yǎng)1 周，分別測定不同株系不同處理后的超氧化物歧化酶活性（SOD）、過氧化物酶活性（POD）、H2O2含量、脯氨酸含量和丙二醛（MDA）含量。SOD 和POD 活性分別采用氮藍四唑（NBT）光化還原法和愈創(chuàng)木酚法測定[22]；H2O2含量測定參考Ve likova 等[23]；脯氨酸含量采用磺基水楊酸提取，茚三酮比色法[24]；MDA 含量采用硫代巴比妥酸比色法（TBA）測定[25]。實驗進行3 次獨立的生物學(xué)重復(fù)，利用SPSS 軟件對相同處理條件下OE 株系與WT 株系之間生理指標的差異進行統(tǒng)計分析（P<0.01，one-way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米ZmbZIP76 基因在ABA 和NaHCO3 脅迫下的表達分析

ABA 和NaHCO3處理的各個時間點ZmbZIP76在根中均顯著上調(diào)表達，NaHCO3處理12 h 后表達量最高，是對照的17.7 倍，隨后表達量開始降低，ABA 處理24 h 后表達量最高，為對照的7.7 倍，隨后表達量有所降低（圖1）。ABA 和NaHCO3處理下ZmbZIP76 在葉中的表達模式極為相似，都是在脅迫處理的24 h 開始出現(xiàn)顯著增加的表達量，在處理的72 h 表達量達到最高峰，ABA 和NaHCO3處理72 h時ZmbZIP76 的表達量分別是對照的5.9 倍和8.6 倍（圖1）。

圖1 NaHCO3 和ABA 處理下ZmbZIP76 基因在玉米葉和根中的表達Fig.1 The expression of ZmbZIP76 gene in leaves and roots of maize under NaHCO3 and ABA treatments

2.2 ZmbZIP76 基因過表達對擬南芥根長的影響

為了比較NaHCO3脅迫下ZmbZIP76 過表達株系與WT 株系根長的差異，將1 周大小長勢一致的不同株系的幼苗分別轉(zhuǎn)移到含有0、6 mM NaHCO3的1/2 MS 培養(yǎng)基上豎直培養(yǎng)1 周，測量根長并拍照。結(jié)果如圖2 所示，正常生長條件下，野生型株系和過表達株系根長無顯著差異，但是經(jīng)過6 mM NaHCO3處理后，過表達株系OE3 和OE16 的根長分別是野生型株系根長的1.4 和1.45 倍（P<0.05，one-way ANOVA test），說明過ZmbZIP76 過表達提高了擬南芥幼苗對NaHCO3脅迫的耐受性。

圖2 NaHCO3 處理下ZmbZIP76 轉(zhuǎn)基因擬南芥根長Fig.2 The root length of ZmbZIP76 transgenic Arabidopsis under NaHCO3 treatment

2.3 ZmbZIP76 基因過表達對植物抗氧化防御系統(tǒng)的影響

正常生長條件下，野生型株系和ZmbZIP76 過表達株系（OE3 和OE16）體內(nèi)SOD 和POD 活性未見顯著差異，然而，在NaHCO3脅迫下，OE3 和OE16 體內(nèi)SOD 活性分別是野生型植物的1.94 倍和1.97 倍，OE3 和OE16 體內(nèi)POD 活性分別是野生型植物的2.1 倍和2 倍（圖3）。鹽堿脅迫條件下ZmbZIP76 過表達株系中SOD 和POD 活性顯著高于野生型擬南芥（P<0.01，one-way ANOVA test），表明ZmbZIP76 基因?qū)OD 和POD 酶活具有正向調(diào)控作用。H2O2含量測定進一步顯示，NaHCO3脅迫條件下過表達株系OE3 和OE16 體內(nèi)H2O2含量顯著低于野生型株系（圖3），進一步證明ZmbZIP76 基因通過促進植物體內(nèi)活性氧的清除來提高植物對鹽堿脅迫的耐受性。

圖3 NaHCO3 脅迫下ZmbZIP76 轉(zhuǎn)基因擬南芥活性氧清除能力Fig.3 The reactive oxygen scavenging ability of ZmbZIP76 transgenic Arabidopsis under NaHCO3 stress

2.4 ZmbZIP76 基因過表達對植物脯氨酸含量的影響

正常生長條件下，野生型株系和ZmbZIP76 過表達株系（OE3 和OE16）體內(nèi)脯氨酸含量未見顯著差異，然而，在NaHCO3脅迫下，OE3 和OE16 中脯氨酸含量分別是野生型株系的1.54 倍和1.46 倍（圖4）。ZmbZIP76 過表達株系中脯氨酸含量顯著高于野生型（P<0.01，one-way ANOVA test），表明鹽堿脅迫條件下ZmbZIP76 通過正向調(diào)控植物體內(nèi)脯氨酸的合成進而提高植物耐鹽堿性。

圖4 NaHCO3 脅迫下ZmbZIP76 轉(zhuǎn)基因擬南芥脯氨酸含量Fig.4 The proline content of ZmbZIP76 transgenic Arabidopsis under NaHCO3 stress

2.5 ZmbZIP76 基因過表達對植物MDA 含量的影響

正常生長條件下，野生型株系和ZmbZIP76 過表達株系（OE3 和OE16）體內(nèi)MDA 含量未見顯著差異，然而，在NaHCO3脅迫下，ZmbZIP76 過表達株系中MDA 含量顯著低于野生型（P<0.01，one-way ANOVA test），OE3 和OE16 中MDA 含量分別較野生型株系下降了37.6%和39%（圖5）。

圖5 NaHCO3 脅迫下ZmbZIP76 轉(zhuǎn)基因擬南芥MDA 含量Fig.5 The MDA content of ZmbZIP76 transgenic Arabidopsis under NaHCO3 stress

3 討論

bZIP 轉(zhuǎn)錄因子在多種生物學(xué)過程以及非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，然而，大部分關(guān)于bZIPs 的報道集中于擬南芥和水稻中，玉米中關(guān)于bZIP 的報道有但相對較少。從玉米中分離了一條能夠同時響應(yīng) ABA 和 NaHCO3脅迫的bZIP基因GRMZM2G055413，命名為ZmbZIP76，證明了其在鹽堿脅迫下的正向調(diào)控功能。

ABA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，包括轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)的許多基因都可以響應(yīng)ABA 信號，如DREB/CBF，MYB，bHLH，ERF，bZIP 和NAC[26]。轉(zhuǎn)錄因子通過與靶基因啟動子中順式元件相互作用，在響應(yīng)ABA 信號中發(fā)揮重要作用[27]。其中，bZIP 是最大的轉(zhuǎn)錄因子基因家族之一，在調(diào)控依賴于ABA 的植物逆境反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。目前，擬南芥中bZIP 轉(zhuǎn)錄因子參與的ABA 信號模式已經(jīng)建立，PYR/PYL/RCARs→PP2C→SnRKs→AREBs→靶基因。其中，PYR/PYL/RCARs 是ABA 受體蛋白。PP2C（protein phosphatase 2C）是絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，可以負調(diào)控ABA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及多種逆境脅迫轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[28]。SnRK（sucrose non-fermenting 1-related protein kinase）是廣泛存在于植物中的Ser/Thr類蛋白激酶，可以與PP2Cs 發(fā)生相互作用從而導(dǎo)致自身失活和去磷酸化。非脅迫條件下，PP2Cs 可與SnRKs 結(jié)合，使其發(fā)生去磷酸化作用而失活[29]。逆境脅迫下，ABA 可以和受體PYR/PYL/RCAR 形成復(fù)合物，該復(fù)合物會阻斷PP2C 介導(dǎo)的SnRKs 的失活，未失活的SnRKs 激酶可以通過磷酸化bZIP 轉(zhuǎn)錄因子將其激活，bZIP 轉(zhuǎn)錄因子進一步通過識別ABRE 元件最終激活A(yù)BA 信號相關(guān)靶基因的表達[29]。研究發(fā)現(xiàn)ZmbZIP76 可以同時被ABA 和NaHCO3誘導(dǎo)表達，值得注意的是，ZmbZIP76 在兩種處理下的表達模式極為相似，其表達量在根中均是先升高再降低，在葉中都是于脅迫處理的24 h 開始顯著增加，在處理的72 h 達到表達的最高峰（圖1），表明ZmbZIP76參與調(diào)控的植物鹽堿脅迫反應(yīng)很可能依賴于ABA途徑，即ZmbZIP76 轉(zhuǎn)錄因子可能通過調(diào)節(jié)ABA 信號來提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽堿脅迫的耐受性。

非生物脅迫條件下，有效的抗氧化系統(tǒng)是植物抵抗逆境的一個主要途徑[30]。鹽脅迫條件下ThbZIP1基因在煙草中過量表達，可以提高過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，增加可溶性糖和可溶性蛋白的含量，還可以促進活性氧的消除[31]。玉米中發(fā)現(xiàn)的bZIP 轉(zhuǎn)錄因子ABP9 通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的ROS 水平提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對多種逆境的耐受性[12]。研究發(fā)現(xiàn)NaHCO3脅迫下ZmbZIP76 過表達株系（OE3 和OE16）中SOD 和POD 活性顯著高于野生型，H2O2含量顯著低于野生型株系（圖3），表明NaHCO3脅迫條件下ZmbZIP76 基因可以通過提高抗氧化防御系統(tǒng)中關(guān)鍵酶SOD 和POD 的活性，加速對活性氧的清除。類似的是，Qu 等發(fā)現(xiàn)微藻ChbZIP1轉(zhuǎn)錄因子通過對活性氧清除系統(tǒng)的調(diào)節(jié)來提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對鹽堿脅迫的耐受性[32]。

逆境下植物體內(nèi)高水平的ROS 積累會引起膜脂過氧化，從而產(chǎn)生大量MDA，因此逆境下植物體內(nèi)ROS 和MDA 含量通常具有正向關(guān)性，MDA 含量既可以直接用于衡量膜系統(tǒng)受損程度，又可以間接用于反應(yīng)植物體內(nèi)ROS 的含量。研究發(fā)現(xiàn)NaHCO3脅迫條件下ZmbZIP76 過表達株系中MDA 含量和ROS含量均顯著低于野生型（圖3 和圖5），表明ZmbZIP76 的過表達可以通過加快ROS 的清除，減輕膜系統(tǒng)的損傷來提高轉(zhuǎn)基因擬南芥對NaHCO3脅迫的耐受性。與此一致的是，Bi 等報道TabZIP15 的過表達使小麥體內(nèi)H2O2含量和MDA 含量顯著降低，轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出提高的耐鹽性[33]。Wu 等發(fā)現(xiàn)野生大豆GsbZIP67 基因通過降低MDA 含量和提高POD活性從而來增強苜蓿對鹽堿脅迫的耐受性[34]。

脯氨酸在植物抵御非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，在遭受逆境時，植物體內(nèi)的脯氨酸濃度會增加，以此調(diào)節(jié)細胞內(nèi)外滲透壓防止細胞受損。逆境條件下一些bZIP 轉(zhuǎn)錄因子可以同時調(diào)控抗氧化防御系統(tǒng)和脯氨酸的合成。例如，甘薯bZIP 轉(zhuǎn)錄因子IbbZIP1 的過表達在干旱和鹽脅迫下不但提高了植物體內(nèi)SOD 活性，減少了H2O2含量，還增加了脯氨酸含量，最終增強了IbbZIP1 轉(zhuǎn)基因擬南芥在干旱和鹽脅迫下的耐受性[35]。相類似的是，研究發(fā)現(xiàn)鹽堿脅迫條件下ZmbZIP76 過表達株系中脯氨酸含量顯著高于野生型，SOD 和POD 活性也顯著高于野生型，H2O2含量則顯著低于野生型株系（圖3 和圖4），表明玉米bZIP 轉(zhuǎn)錄因子同樣可以通過正向調(diào)控抗氧化防御系統(tǒng)和脯氨酸合成來提高植物對鹽堿脅迫的耐受性。由此可見，逆境相關(guān)bZIP 轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控的植物抗逆生理反應(yīng)在物種間具有相似性。

4 結(jié)論

ZmbZIP76 既可以受ABA 誘導(dǎo)表達，又可以受NaHCO3誘導(dǎo)表達，且在兩種處理下表達模式相似。鹽堿脅迫下，與野生型株系相比，ZmbZIP76 轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長顯著增加，脯氨酸含量、SOD 和POD活性顯著提高，過氧化氫含量和MDA 含量顯著降低。研究證實了ZmbZIP76 轉(zhuǎn)錄因子是鹽堿脅迫下的正向調(diào)節(jié)因子，研究結(jié)果將為進一步利用轉(zhuǎn)基因手段培育玉米抗/耐品種提供理論依據(jù)和基因準備。