朱峰，李揚(yáng)，方正

（南陽醫(yī)學(xué)高等?？频谝桓綄籴t(yī)院，河南 南陽 473000）

膽道閉鎖（Biliary Atresia，BA）是新生兒阻塞性黃疸最為常見的原因，本病發(fā)生率約1/10000。BA 病理特點(diǎn)是是病變累及肝內(nèi)外膽管系統(tǒng)，發(fā)生進(jìn)行性膽管破壞[1]。成功的肝門空腸吻合術(shù)（Kasai手術(shù)）能夠使膽汁得以引流，使部分患兒得以存活[2]。但由于進(jìn)行性肝臟纖維化、膽汁郁積性肝硬化和門脈高壓的出現(xiàn)，多數(shù)患兒須選擇肝臟移植[3]。進(jìn)行性肝纖維化是制約Kasai 手術(shù)效果的一大瓶頸，阻止肝纖維化的發(fā)展將會(huì)顯著提高Kasai 手術(shù)的療效。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1 ）蛋白能夠調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡[4-6]。最新研究報(bào)道，白細(xì)胞衍生趨化因子2（leukocyte cell-derived chemotaxin 2，LECT2）的表達(dá)與肝纖維化關(guān)系密切相關(guān)[7]。為探究TGFβ1、LECT2在BA 肝纖維化中的表達(dá)水平及診斷價(jià)值，本研究收集2019年2 月-2020年8 月期間我院收治的50例膽道閉鎖患兒及30例膽管擴(kuò)張癥患兒的臨床資料，并進(jìn)行LECT2及TGF-β1 檢測(cè)分析，探究TGF-β1、LECT2在膽道閉鎖肝（BA）纖維化中的表達(dá)水平及診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年2 月-2020年8 月期間我院收治的50例膽道閉鎖患兒及30例膽管擴(kuò)張癥患兒的臨床資料，另外選擇肝功能正常、無感染性疾病、腹腔鏡探查術(shù)病檢無肝膽疾病的肝臟組織的28例患兒作為對(duì)照組，分別作為膽道閉鎖組（n=50）、膽管擴(kuò)張組（n=30）、對(duì)照組（n=28）。膽道閉鎖組男性為29例，女性為21例；年齡1～3.5歲，平均2.03±0.83 歲。膽管擴(kuò)張組男性為18例，女性為12例；年齡1～3 歲,平均1.86±0.94 歲。對(duì)照組男性為15例，女性為13例；年齡1～3.6 歲，平均1.93±0.74 歲。3 組性別對(duì)比無明顯差異(P＞0.05),具可比性。

1.2 肝臟纖維化分級(jí) 手術(shù)中取肝臟組織標(biāo)本，在病理科進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片、脫蠟及HE 染色，顯微鏡下觀察。根據(jù)Ohkuma' s 分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)將肝臟組織纖維化程度分為I～ IV 級(jí),具體標(biāo)準(zhǔn)如下：I 級(jí)：管區(qū)輕度纖維化；II 級(jí)：鄰近門管區(qū)的輕度橋接纖維化；III 級(jí)：伸向鄰近門管區(qū)的重度橋接纖維化；IV 級(jí)：肝硬化、假小葉形成。

1.3 方法術(shù)中取各組患兒肝右葉前緣為活檢標(biāo)本，對(duì)術(shù)中獲取的肝組織樣本需立即采用10%甲醛溶液固定，脫水后石蠟包埋，切成厚度約為4 μm的薄片，80°C 烤片90min。染色前經(jīng)二甲苯脫蠟、然后置于pH6.0的檸檬酸鈉溶液中經(jīng)微波爐高溫15min，進(jìn)行抗原修復(fù)。恢復(fù)室溫后用pH 7.3的磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）震蕩沖洗3 次，4min/次。羊血清封閉抗原30min，甩干羊血清滴加一抗：LECT2（1:300），并置于4°C 冰箱過夜。第二天所有切片恢復(fù)室溫后再次用PBS 沖洗，滴加HRP 二抗結(jié)合30min，PBS 沖洗3 次后滴加1:1的DAB 混合液，顯微鏡下觀察顯色，蘇木精染核，固定后透明封片。所有切片均在光學(xué)顯微鏡下觀察取圖并利用ImageproPlus 6.0 軟件進(jìn)行半定量分析。LECT2 染色的每張切片在100 倍顯微鏡下按隨機(jī)數(shù)字表法留取5 個(gè)不同視野圖片，ImageproPlus6.0 軟件分析時(shí)記錄其平均光密度值（Average OpticalDensity，AOD），即每個(gè)視野的肝組織陽性細(xì)胞光密度總和/陽性面積。

1.4 免疫組化陽性標(biāo)準(zhǔn) HE及免疫組化染色將已包埋肝臟蠟塊切成4μm 厚切片分別經(jīng)HE、免疫組化染色（采用S-P 兩步法）,由經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生在100 倍、400 倍光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織細(xì)胞發(fā)育、肝纖維化程度。免疫組化陽性標(biāo)準(zhǔn)：⑴定性分析,根據(jù)染色強(qiáng)度分為無棕黃色（陰性）、淡棕黃色（弱陽性）、棕黃色（陽性）、棕褐色（強(qiáng)陽性）[8]。⑵半定量分析，根據(jù)肝組織切片內(nèi)陽性細(xì)胞總光密度值/陽性細(xì)胞所占面積求得平均光密度值（AOD）[9]。每張切片內(nèi)讀取任意5 張視野，用同一計(jì)算機(jī)成像系統(tǒng)留取相同倍數(shù)顯微鏡下圖片，圖像分析軟件IPP 6.0 分析每張圖片,計(jì)算TGF-β1、LECT2的AOD[10]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 工具進(jìn)行處理，計(jì)量資料用（）表示，計(jì)數(shù)資料采用（例,率）表示,比較分別采用t、χ2檢驗(yàn),相關(guān)性分析進(jìn)行Spearman 秩相關(guān)分析，多因素Logistic 回歸分析兩者與病情嚴(yán)重程度關(guān)系，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 纖維化程度 50例膽道閉鎖組，I 級(jí)為8例，II級(jí)為12例，III 級(jí)為16例，IV 級(jí)為14例。30例CBD 組織組的肝組織中未見纖維化，均為0 級(jí)，膽擴(kuò)組肝內(nèi)細(xì)胞胞質(zhì)微著色，門管區(qū)少許纖維組織增粗。正常對(duì)照組肝組織內(nèi)細(xì)胞胞質(zhì)清亮、排列緊密，纖維細(xì)胞少見，無纖維組織增生。

2.2 對(duì)比各組TGF-β1 免疫組化染色結(jié)果 結(jié)果見表1，P＜0.05。

表1 對(duì)比各組TGF-β1 免疫組化染色結(jié)果

2.3 對(duì)比各組LECT2 免疫組化染色結(jié)果 見表2及圖1。

表2 對(duì)比各組LECT2 免疫組化染色結(jié)果

圖1 膽道閉鎖組不同分級(jí)（TGF）-β1、LECT2 變化趨勢(shì)圖

2.4 評(píng)估診斷效能 以嚴(yán)重程度為因變量，賦值如下：I 級(jí)、II 級(jí)、III 級(jí)、IV 級(jí)分別為1、2、3、4,LECT2、TGF-β1 指標(biāo)納入回歸方程,病情輕重概率模型為L(zhǎng)ogit（P）＝（-2.954）＋1.644BNP ＋1.843TGF-β1?；仡櫺则?yàn)證該方程靈敏度為88.32%,特異性為89.42%，總正確率為90.65%，（P＜0.05）。

3 討論

膽道閉鎖的手術(shù)效果取決于患兒年齡、閉鎖類型、肝臟纖維化的嚴(yán)重程度及術(shù)后并發(fā)癥等多種因素進(jìn)行性肝纖維化是影響手術(shù)效果的重要因素。研究肝臟纖維化發(fā)生的機(jī)制，防止肝纖維化是國內(nèi)外學(xué)者所面臨的重大課題。

本研究膽道閉鎖組TGF-β1 陽性率較膽管擴(kuò)張組及對(duì)照組高（P＜0.05），TGF-β1表達(dá)水平較膽管擴(kuò)張組及對(duì)照組高（P＜0.05），I 級(jí)～I(xiàn)I 級(jí)患者TGF-β1表達(dá)水平明顯升高，III 級(jí)～I(xiàn)V 級(jí)者TGFβ1表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），提示，在纖維化早期TGF-β1表達(dá)水平明顯升高，在晚期TGF-β1表達(dá)水平明顯下降,晚期表達(dá)下降的原因在于，BA 肝硬化期TGF-β1 mRNA的轉(zhuǎn)錄受到抑制,其含量減少、促纖維化作用減弱。有的學(xué)者[11]研究認(rèn)為，BA患兒肝硬化時(shí)期由于肝內(nèi)纖維組織增生、血運(yùn)紊亂等導(dǎo)致TGF-β1蛋白大量減少，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

LECT2 主要由肝細(xì)胞合成和分泌,肝損傷后，LECT2在匯管區(qū)周圍和損傷邊界的分泌增加，可通過促進(jìn)肝竇內(nèi)皮毛細(xì)血管化加劇肝纖維化[12]。與該報(bào)道一致的是，本研究結(jié)果顯示，I 級(jí)～I(xiàn)V 級(jí)患者隨著纖維化程度升高，LECT2表達(dá)水平逐漸升高（P＜0.05），提示，在纖維化程度升高，TGF-β1表達(dá)水平升高，而且相關(guān)性也證實(shí)兩者間存在正向相關(guān)性，r=0.832，P＜0.05。LECT2 也在BA 肝纖維化患兒肝臟中表達(dá)增加，且隨著肝纖維化程度加重，LECT2的表達(dá)由匯管區(qū)逐漸蔓延至整個(gè)肝小葉[11]。但是，LECT2 影響在BA 肝纖維化中并未發(fā)現(xiàn)[13-14]。肝竇內(nèi)皮毛細(xì)血管化是由于LECT2的過表達(dá)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMPs）的表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)和血管內(nèi)皮鈣粘素的累積,增加的血管內(nèi)皮鈣粘素增強(qiáng)了內(nèi)皮細(xì)胞間連接，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的成管、遷移及門脈血管生成，刺激肝竇內(nèi)皮失去正?？紫?干擾肝臟代謝促進(jìn)肝纖維化[15,16]。

綜上所述，在纖維化程度升高，TGF-β1表達(dá)水平升高；在纖維化早期TGF-β1表達(dá)水平明顯升高，在晚期TGF-β1表達(dá)水平明顯下降，是評(píng)估BA患者肝纖維化程度的有效指標(biāo)。