丁治云，梁作輝，方會(huì)娟，龍亭

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)人民醫(yī)院/鄭州人民醫(yī)院皮膚科，河南 鄭州 450003；2.玉溪市人民醫(yī)院皮膚科，云南 玉溪 653100；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)人民醫(yī)院/鄭州人民醫(yī)院病理科，河南 鄭州 450003）

成纖維細(xì)胞大量增殖以及膠原過(guò)度沉積是增生性瘢痕與瘢痕疙瘩的共同病理基礎(chǔ)。已有研究發(fā)現(xiàn)，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞普遍存在DNA 甲基化以及組蛋白乙?；?上述病理變化與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)[1]。甲基化結(jié)合蛋白2（methylation binding protein 2，MECP2）、組蛋白去乙?；?（histone deacetylase 6，HDAC6）分別屬于MECP 家族與HDAC 家族成員，兩者均在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著關(guān)鍵作用[2]。在大部分情況下，HDAC6 作為重要的協(xié)同因子，促使MECP2與某高甲基化啟動(dòng)子相結(jié)合，共同抑制基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[3]。新近研究發(fā)現(xiàn)，MECP2、HDAC6 廣泛存在纖維化的肺組織的成纖維細(xì)胞中，通過(guò)下調(diào)HDAC6的表達(dá)水平，能夠顯著減少皮膚成纖維細(xì)胞含量[4]。上述研究均提示MECP2、HDAC6 是纖維化形成過(guò)程的重要環(huán)節(jié)。本研究比較了瘢痕組織及正常皮膚中MECP2、HDAC6表達(dá)水平，以期進(jìn)一步探明其在瘢痕形成過(guò)程中的作用，為瘢痕的治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從2018年3 月-2020年3 月收治的90例瘢痕患者獲取瘢痕組織標(biāo)本。瘢痕患者納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴符合《現(xiàn)代瘢痕學(xué)》第2 版[5]標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí);⑵年齡≥18 歲;Ⅳ瘢痕部位為胸部、肩部及上肢；⑷瘢痕生長(zhǎng)時(shí)間≥3 個(gè)月；⑸均未接受過(guò)相關(guān)治療；⑹均自愿參加研究。其中男58例,女32例，年齡18～67 歲，平均（31.93±13.54）歲。根據(jù)瘢痕標(biāo)本組織學(xué)形態(tài)分為正常瘢痕組(29例)、增生性瘢痕組（25例）、瘢痕疙瘩組（36例）。另從28例上瞼松弛患者獲取手術(shù)切除組織作為正常皮膚標(biāo)本，其中男19例，女9例，年齡26～64 歲，平均（35.95±11.21）歲。瘢痕標(biāo)本組織學(xué)形態(tài)鑒別標(biāo)準(zhǔn)：參照《現(xiàn)代瘢痕學(xué)》（第2 版）[5]。正常瘢痕：瘢痕形態(tài)扁平，外觀略微粗糙，可伴有輕微色素加深或減退，無(wú)不適癥狀；增生性瘢痕：瘢痕明顯高于皮膚，質(zhì)地堅(jiān)硬，外觀形狀不規(guī)則，呈現(xiàn)暗紅色或紫紅色，并引起瘙癢；瘢痕疙瘩：瘢痕高于皮膚，質(zhì)地堅(jiān)硬，厚度高低不平，呈現(xiàn)粉紅色或紫紅色，并出現(xiàn)疼痛、灼熱、瘙癢感等癥狀。

1.2 方法 ⑴采用蛋白質(zhì)印跡法（WB 法）檢測(cè)MECP2、HDAC6在各標(biāo)本中的表達(dá)水平，具體方法：將標(biāo)本研磨后裂解提取組織總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度以及上樣量，電泳處理后經(jīng)一抗、二抗孵育，洗膜后置入顯影儀曝光拍照，采用美國(guó)Media Cybernetics公司Image pro plus6.0f 進(jìn)行圖像分析。⑵采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測(cè)各標(biāo)本MECP2、HDAC6 mRNA的表達(dá)。具體方法：提取總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 濃度，按照Protocol 加樣，反應(yīng)完成后置于冰上冷卻后進(jìn)行cDNA 擴(kuò)增，采用分光光度計(jì)測(cè)定cDNA 濃度，最后利用每個(gè)樣品所得CT 值計(jì)算△CT及2（-△CT）值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料多組間比較采用F 檢驗(yàn)，事后兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各標(biāo)本MECP2、HDAC6蛋白表達(dá)情況 各標(biāo)本MECP2、HDAC6蛋白表達(dá)水平存在明顯差異（P＜0.05），見表1。

表1 各標(biāo)本MECP2、HDAC6蛋白水平比較

2.2 各樣本MECP2 mRNA、HDAC6 mRNA的表達(dá)各樣本MECP2 mRNA、HDAC6 mRNA表達(dá)量存在明顯差異（P＜0.05），見表2。

表2 各樣本MECP2 mRNA、HDAC6 mRNA的表達(dá)

2.3 增生性瘢痕MECP2、HDAC6蛋白表達(dá)隨時(shí)間（月）的變化情況增生性瘢痕0～3m、4～6m MECP2、HDAC6表達(dá)水平高于7～12m（P＜0.05），見表3、圖1。

表3 增生性瘢痕MECP2、HDAC6蛋白表達(dá)隨時(shí)間的變化情況

圖1 增生性瘢痕MECP2、HDAC6蛋白表達(dá)隨時(shí)間的變化情況

3 討論

瘢痕是皮膚創(chuàng)口自我修復(fù)形成的產(chǎn)物，在皮膚組織修復(fù)過(guò)程中各個(gè)階段發(fā)生異常均可出現(xiàn)病理性瘢痕，主要表現(xiàn)為增生性瘢痕與瘢痕疙瘩。目前瘢痕的臨床治療仍是較大難題，缺乏適用于不同類型瘢痕的統(tǒng)一治療方案，且治療效果欠理想。因此，如何預(yù)防瘢痕的形成，盡可能避免出現(xiàn)病理性瘢痕，具有重要意義。

MECP 是一類能夠與甲基化-CpG 二核苷酸發(fā)生反應(yīng)的蛋白家族。已有研究發(fā)現(xiàn),在纖維化病變的肝臟、肺、心臟等器官的成纖維細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)MEC P2表達(dá)水平明顯增加[6,7]。在組織發(fā)生纖維化過(guò)程中，MECP2 主要作為一種重要的轉(zhuǎn)錄抑制因子,通過(guò)對(duì)與纖維化形成相關(guān)的各種負(fù)性調(diào)控因子，包括PPAR-γ、TSC1/TSC2 等進(jìn)行負(fù)性調(diào)控，從而促進(jìn)了組織的纖維化病理變化[8,9]。有研究采用SiRNA-MECP2 下調(diào)MECP2的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各種與纖維化病變相關(guān)的細(xì)胞因子的水平同樣明顯降低，組織的纖維化進(jìn)程明顯延緩[10]。HDAC與組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（HAT）兩者共同對(duì)組蛋白乙酰化程度進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而影響靶基因的表達(dá)[11]。已有研究報(bào)道，在纖維化的肺組織中HDAC6的表達(dá)水平升高,應(yīng)用HDAC 抑制劑后能夠顯著降低組織的纖維化[12]。這提示MECP2與HDAC6蛋白表達(dá)升高在組織纖維化中起著正向促進(jìn)作用,下調(diào)此兩者的表達(dá)水平有助于抑制組織纖維化,這為阻斷瘢痕纖維化進(jìn)程提供了重要的思路。

本研究結(jié)果顯示，正常皮膚標(biāo)本MECP2與HDAC6蛋白以及mRNA的表達(dá)水平均明顯低于瘢痕標(biāo)本，且隨著瘢痕嚴(yán)重程度的增加，MECP2與HDAC6蛋白以及mRNA表達(dá)逐漸升高，即瘢痕疙瘩水平＞增生性瘢痕水平＞正常瘢痕水平＞正常皮膚水平,具有顯著性差異（P＜0.05）。按瘢痕形成時(shí)間(月)程度來(lái)看,增生性瘢痕0～3m、4～6m 時(shí)MEC P2、HDAC6表達(dá)水平高于7～12m（P＜0.05）。進(jìn)一步觀察增生性瘢痕MECP2與HDAC6表達(dá)隨時(shí)間變化情況，結(jié)果顯示，增生性瘢痕處于不同生長(zhǎng)時(shí)期時(shí)MECP2與HDAC6蛋白的表達(dá)也有差異，當(dāng)增生性瘢痕處于早期 (0～3M)和增生期 (3～6M)時(shí)MECP2與HDAC6蛋白的表達(dá)量最高且未見明顯差異,但當(dāng)增生性瘢痕處于穩(wěn)定期(6～12M)和消退期(12M)時(shí)MECP2與HDAC6蛋白的表達(dá)量明顯減少，這進(jìn)一步證實(shí)MECP2與HDAC6蛋白在瘢痕形成與加重過(guò)程中的重要作用。分析其原因可能是由于在瘢痕形成過(guò)程中，MECP2表達(dá)量明顯升高，對(duì)某些啟動(dòng)子高甲基化基因產(chǎn)生抑制作用，從而促進(jìn)皮膚纖維化的進(jìn)展[13]。研究證明，MECP2不僅可作為評(píng)價(jià)組織甲基化程度的指標(biāo)，也可作為瘢痕纖維程度的重要評(píng)估指標(biāo)[14]。同樣，HDAC6在不同嚴(yán)重程度瘢痕中表達(dá)水平的差異不僅可作為評(píng)估組蛋白乙?；潭鹊闹笜?biāo)，也可反映瘢痕纖維化嚴(yán)重程度[13]。說(shuō)明組蛋白去乙?；揎椩谌梭w病理性瘢痕形成過(guò)程中扮演著重要的角色,HDAC6蛋白在瘢痕疙瘩中的高表達(dá)也說(shuō)明組蛋白去乙?；瘏⑴c的表觀遺傳學(xué)調(diào)控是瘢痕防治的重要切入點(diǎn)。

綜上所述，MECP2與HDAC6蛋白在不同組織形態(tài)的瘢痕中的表達(dá)增加，提示在瘢痕形成過(guò)程中DNA 甲基化及組蛋白乙?；^(guò)程發(fā)揮著重要的促纖維化作用，但此二者的具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。