朱驪，楊俊娟

（鄭州市婦幼保健院婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450000）

胎膜早 破（premature rupture membranes，PROM）定義為分娩前胎膜的破裂，PROM 可以在妊娠37 周或之后或妊娠37 周之前發(fā)生（PPROM或胎膜早破）[1]。在正常情況下，足月妊娠中有8～10%的婦女會經(jīng)歷PROM，PROM 其發(fā)病率全球范圍為2～10%，中國為9.4～10.4%[2]。PROM 可伴有許多嚴重的致命并發(fā)癥，如驚厥，昏迷，腦出血，胎盤早剝，和彌散性血管內(nèi)凝血[3]。因此，PROM 是孕婦和圍生兒死亡的主要原因之一。目前，胎盤缺血和氧化應激理論，血管內(nèi)皮損傷理論，絨毛膜羊膜炎（chorioamnionitis，CAM）理論，免疫理論被認為是PROM的發(fā)病機理[4]。有報道稱，內(nèi)皮功能障礙可誘導PROM 伴CAM，并可作為未來發(fā)生PROM 伴CAM 事件風險的指標[5]。內(nèi)皮功能障礙的表型特征包括細胞黏附分子的上調(diào)，包括細胞間黏附分子-1（ICAM-1）和血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）[6]。已發(fā)現(xiàn)功能性內(nèi)皮的這些表型改變與屏障功能有關(guān)，該屏障功能導致白細胞外滲和繼發(fā)于一氧化氮（NO）等血管擴張劑處理減少的血管平滑肌張力增高[7]。PROM 伴CAM的發(fā)生是通過表達粘附分子誘導的，該粘附分子將炎性單核細胞募集到血管壁中。細胞間單核細胞對內(nèi)皮的粘附表達增加是導致PROM 伴CAM的跡象之一[8]。由于PROM伴CAM 中內(nèi)皮功能障礙與炎癥之間的這種聯(lián)系，內(nèi)皮細胞上發(fā)生的炎癥過程阻斷可能是預防PROM 伴CAM的有益途徑。本研究擬探討PROM患者胎盤組織中ICAM-1與VCAM-1表達水平及臨床意義，為PROM及絨毛膜羊膜炎的診斷及治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取鄭州市婦幼保健院2017年1月-2019年12 月收治的130例胎膜早破產(chǎn)婦為研究對象（病例組）,根據(jù)胎盤病理結(jié)果分為伴有絨毛膜羊膜炎組（CAM 組，64例）和無絨毛膜羊膜炎組（非CAM 組，66例）；納入標準：⑴符合胎膜早破及是否合并絨毛膜羊膜炎標準[9]；⑵自然單胎妊娠；⑶剖宮產(chǎn)：胎位異常、骨盆狹窄剖宮產(chǎn)指征。排除標準：⑴孕婦無全身性疾??；⑵胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩；⑶妊娠期高血壓、糖尿病等病史。同時選取本院同期健康剖宮產(chǎn)單胎自然妊娠產(chǎn)婦130例為正常對照組。本研究得到了鄭州市婦幼保健院一些倫理委員會的批準，并獲得了患者的知情同意。

1.2 VCAM-1、ICAM-1 mRNA水平測定 Quanti-Tect SYBR Green RT-PCR 試劑盒（Qiagen GmbH）在ABI 7500 快速實時PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems;Thermo Fisher Scientific，Inc）進行實時qPCR分析VCAM-1、ICAM-1 mRNA水平,根據(jù)制造商的協(xié)議。PCR 條件如下；94℃下進行1min 變性，在59℃下進行1min 退火，并在72℃下進行1min 延伸32 個循環(huán)，然后在72℃下進行10min。VCAM-1、ICAM-1、GAPDH 由上海生工科技合成，序列如下：VCAM-1 正向引 物：5'-CTCGATCGATCGATGCGCGATCGATCGATCGT-3'，反向引物：5'-CGTGACGATCGATCGATCGATCGAC-3'；ICAM-1 正向引物：5'-CGTAACGTAGCTAGCGATCGATCGATCG-3'，反向引物：5'-CGAGCGAT CGATCGATGGTCGATCGATC-3';GAPDH 正向引 物：5'-CGTAGC TCGATCGCTGCGATCGATCGCTAG-3'，反向引物：5' -CGAGCGTCGATCGATCGAT CGCTAGCT -3'。VCAM-1、ICAM-1 標準化為內(nèi)部對照GAPDH的含量（-ΔΔCq）。每個樣品進行三次重復分析，并計算平均表達水平。

1.3 VCAM-1、ICAM-1蛋白水平測定 進行鏈霉抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶方法用于免疫組織化學染色。將胎盤組織在室溫下于4%多聚甲醛溶液中固定24h，然后包埋在石蠟中，并準備了連續(xù)切片（厚度為4 μM）。將切片在二甲苯I，II和IIII 溶液中分別進行5min 去石蠟處理，并用梯度的乙醇溶液（分別為100%、95%、75%和50%，分別進行5min）再水化，并使用3 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性。%的過氧化氫15min。使用高壓鍋（100°C）用檸檬酸鈉緩沖液（pH 6.0）進行熱介導的抗原修復對切片進行30min的預處理。通過與10%正常山羊血清（目錄號ab7481,Abcam）溫育15min,可以阻斷非特異性免疫球蛋白的結(jié)合。用磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌后,將玻片與抗VCAM-1（1：200；目錄號ab 124773；Abcam）或ICAM-1（1：200；目錄號ab15580；Abcam）的一抗孵育。在室溫下放置60min，然后在室溫下放置生物素偶聯(lián)的二抗（1：1,000；目錄號ab6720，Abcam），持續(xù)30min。在光學顯微鏡（放大倍數(shù)：40）下觀察載玻片。對VCAM-1、ICAM 染色的強度評分如下：0，陰性染色；1，弱陽性；2，中度積極；3，強烈肯定。染色百分比評分如下：0，0%免疫反應性細胞；0，0%免疫反應性細胞；1，免疫反應細胞≤5%；2，5～50%的免疫反應性細胞；3，51-80%的免疫反應細胞；4，>80%的免疫反應性細胞。IHC 分數(shù)乘以染色強度百分比。0～4的分數(shù)表示“陰性”表達，6～12的分數(shù)表示“陽性”表達。

1.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS23.0對數(shù)據(jù)進行錄入、統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差()表示，兩組比較采用t 檢驗，多組比較采用單因素方差分析，事后多重比較采用SNK-q 檢驗，采用ROC 曲線評估診斷價值，檢驗水準α 為0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般情況比較與正常對照組比較，病例組妊娠周數(shù)明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而兩組在年齡、BMI、TG、HDL-C、LDL-C 等一般資料比較上差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。

表1 兩組一般情況比較

2.2 正常胎盤組織、非CAM 胎盤組織、CAM 胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1mRNA水平比較與正常胎盤組織比較,非CAM 胎盤組織、CAM 胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1mRNA表達水平明顯升高（P<0.05）；與非CAM 胎盤組織比較、CAM 胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1mRNA表達水平明顯升高（P<0.05）。見表2。

表2 正常胎盤組織、非CAM 胎盤組織、CAM胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1mRNA 比較

2.3 正常胎盤組織、非CAM 胎盤組織、CAM 胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1蛋白比較與正常胎盤組織比較，非CAM 胎盤組織、CAM 胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1蛋白表達水平明顯升高（P<0.05）;與非CAM 胎盤組織比較、CAM 胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1蛋白表達明顯升高(P<0.05)。見表3。

表3 正常胎盤組織、非CAM 胎盤組織、CAM胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1蛋白比較

2.4 正常胎盤組織、非CAM 胎盤組織、CAM 胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1蛋白陽性表達率比較與正常胎盤組織比較，非CAM 胎盤組織、CAM 胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1蛋白表達陽性率明顯升高（P<0.05）；與非CAM 胎盤組織比較、CAM 胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1蛋白表達陽性率明顯升高（P<0.05）。見表4、圖1。

圖1 VCAM-1、ICAM-1在正常胎盤組織、胎膜早破胎盤組織中表達

表4 正常胎盤組織、非CAM 胎盤組織、CAM 胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1蛋白陽性表達率比較

2.5 VCAM-1、ICAM-1 mRNA 評估胎膜早破ROC曲線受試者工作特征曲線提示，VCAM-1+ICAM-1 mRNA、VCAM-1 mRNA、ICAM-1 mRNA 評估胎膜早破的ROC 曲線下面積 (AUC) 分別為0.893（95%CI：0.853-0.933）,0.814（95%CI：0.769-0.842）,0.799（95%CI：0.761-0.843）；VCAM-1 mRNA、ICAM-1 mRNA 兩者AUC 相近（P>0.05）,皆小于VCAM-1+ICAM-1 mRNA（P<0.05）；VCAM-1+ICAM-1 診斷胎膜早破伴CAM的靈敏度、特異度相近（P>0.05），皆小于VCAM-1+ICAM-1 mRNA（P<0.05）,見表5、圖2。

表5 VCAM-1、ICAM-1 mRNA 評估胎膜早破ROC 曲線

圖2 VCAM-1、ICAM-1 mRNA 評估胎膜早破ROC 曲線

3 討論

PROM 伴CAM的原因仍然不確定，先前妊娠的PROM 史，生殖道感染，產(chǎn)前出血、吸煙、內(nèi)皮功能障礙與PROM 伴CAM的發(fā)生密切相關(guān)。一項臨床研究發(fā)現(xiàn)，在37.1%的樣本中觀察到PROM 伴CAM 史，此外這37.1%的樣本中約有82%內(nèi)皮功能障礙患者，這表明PROM 伴CAM的病史、內(nèi)皮功能障礙是PROM 發(fā)生的危險因素[10]。

PROM 伴CAM 已被證明是一種炎性疾病，氧化應激在其啟動和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。據(jù)報道，包括O2、H2O2和血管炎癥在內(nèi)的ROS 生成增加是內(nèi)皮功能障礙的關(guān)鍵因素。PROM 伴CAM 損傷上調(diào)了細胞粘附分子的表達[11]。一項細胞實驗表明，暴露于H2O2的人胎盤血管內(nèi)皮細胞(PVEC)原代細胞顯示O2-增加，這導致PVEC細胞ICAM-1和VCAM-1 上調(diào)[12]。內(nèi)皮細胞的激活是PROM 伴CAM的早期階段,并且誘導了幾種細胞內(nèi)信號傳導途徑，導致某些蛋白質(zhì)（例如CAMs）的上調(diào)[13]。研究表明，在PROM 伴CAM的早期，循環(huán)單核細胞（MNC）與EC 結(jié)合并遷移到內(nèi)皮下空間，從而促進EC的激活。在此期間，ICAM-1的表達上調(diào)，導致EC 激活和PROM 伴CAM的發(fā)展。白細胞和內(nèi)皮細胞粘附分子的表達對于白細胞通過炎癥反應的遷移極為重要。PROM 伴CAM 早期發(fā)展過程中炎癥反應的重要性通過粘附分子的未調(diào)控表達來表明。隨著使用免疫生化技術(shù)的研究的深入，已發(fā)現(xiàn)多種因素與PROM 伴CAM的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，例如炎癥、細胞凋亡、氧化應激、巨噬細胞和淋巴細胞。ICAM-1在血管內(nèi)皮上表達，并與配體結(jié)合以促進單核細胞和內(nèi)皮細胞之間的牢固粘附[14]。ICAM-1 影響炎癥和免疫反應，并且已經(jīng)與腫瘤細胞和健康細胞的遷移有關(guān)[15]。先前的研究得出假設：ICAM-1 也可能通過保護免受免疫應答觸發(fā)的細胞毒性而在PROM 伴CAM 內(nèi)膜細胞的存活中發(fā)揮作用。此外，ICAM-1 介導淋巴細胞與內(nèi)皮細胞的粘附，據(jù)信可促進淋巴細胞沿內(nèi)皮細胞向炎癥部位的遷移[16]。作者推測，PROM 伴CAM 內(nèi)膜細胞缺乏調(diào)節(jié)可溶性ICAM-1 釋放所需的機制，從而導致ICAM-1的釋放增加，通過阻斷淋巴細胞功能相關(guān)抗原1（sICAM-1）被認為是ICAM-1的拮抗方法，從而降低了識別能力以及對免疫細胞殺傷的敏感性[17]。

VCAM-1 是整聯(lián)蛋白粘附蛋白家族的成員，并且其表達在活化的內(nèi)皮中被上調(diào),在VCAM-1中它促進白細胞通過內(nèi)皮向發(fā)炎的,受感染的組織的運輸。有趣的是，VCAM-1 似乎在免疫攻擊的腫瘤逃逸中也起著作用[18]。在腫瘤細胞中表達的VC AM-1 可能促進T細胞從腫瘤中遷移出來，從而導致腫瘤中T細胞的數(shù)量減少。具體而言，VCAM-1的結(jié)合似乎可以驅(qū)動粘著斑的分解，通過粘著斑激酶的激活來驅(qū)動整聯(lián)蛋白依賴性細胞遷移，并刺激由淋巴細胞功能相關(guān)抗原1 介導的T細胞遷移，類似的機制也可能在PROM 中起作用[19]。此外，ICAM-1在PROM 中高表達，這與PROM 誘導的炎癥因子如IL-1β，IL-6和TNF-α的表達增加密切相關(guān)。另外，VCAM-1在血管內(nèi)皮細胞中表達，介導淋巴細胞,單核細胞和內(nèi)皮細胞之間的粘附并參與許多重要的病理生理過程,并且可能是血管功能障礙或血管疾病進展的重要指標[20]。本研究中，與正常胎盤組織比較，非CAM 胎盤組織、CAM 胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1 mRNA表達水平、蛋白表達水平、蛋白表達陽性率明顯升高；與非CAM胎盤組織比較、CAM 胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1 mRNA和蛋白表達水平、蛋白陽性表達率明顯升高，這與上述討論一致，同時也說明胎膜早破患者胎盤組織中ICAM-1與VCAM-1表達水平升高，ICAM-1與VCAM-1可能與PROM 伴CAM 病理進展密切相關(guān)。ROC 分析表明，VCAM-1+ICAM-1 mRNA聯(lián)合診斷胎膜早破的臨床價值較高，有望用于預測胎膜早破的生物標志物。本研究未通過動物、細胞實驗對ICAM-1、VCAM-1與PROM的關(guān)系進行深入研究，這將在后續(xù)研究中進行。

綜上所述，胎膜早破患者胎盤組織中ICAM-1與VCAM-1mRNA與蛋白表達水平升高，伴絨毛膜羊膜炎胎膜早破患者胎盤組織中VCAM-1、ICAM-1mRNA與蛋白更高，二者有望作為預測胎膜早破/絨毛膜羊膜炎的敏感生物標志物。