朱文佳 歐陽(yáng)雅聲 邸麗 盧巖 王敏 文欣玫 朵建英 欒沁榕 李存江 笪宇威

肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)是一種漸進(jìn)性、致死性神經(jīng)系統(tǒng)變性病，是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病中最常見的類型，年發(fā)病率約為(2～3)/10萬(wàn)[1]。ALS主要臨床核心癥狀為上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元同時(shí)受累表現(xiàn)，如肌無(wú)力、肌萎縮、肌束顫動(dòng)、腱反射活躍或亢進(jìn)、病理征陽(yáng)性等。目前該病發(fā)病機(jī)制尚不明確，主要涉及基因易感[2]、谷氨酸興奮性毒性[3]、氧化應(yīng)激損傷[4]、線粒體功能障礙[5]以及異常蛋白聚集[6]等。ALS患者在出現(xiàn)臨床癥狀或體征前，肌電圖檢查可能發(fā)現(xiàn)廣泛失神經(jīng)及神經(jīng)再支配現(xiàn)象。骨骼肌是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的效應(yīng)器及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性的靶器官，從病理上骨骼肌主要分為Ⅰ型(慢收縮型)和Ⅱ型(快收縮型)。研究結(jié)果顯示，脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性常導(dǎo)致Ⅱ型肌纖維首先受累，而Ⅰ型肌纖維受累較輕，甚至出現(xiàn)輕度肥大[7]。

臨床發(fā)現(xiàn)，ALS患者電生理改變是建立在病理改變的基礎(chǔ)上，但患者在不同疾病階段以及不同疾病進(jìn)展速度下骨骼肌病理改變是否存在差異尚不清楚。本研究回顧性分析了散發(fā)性ALS(sporadic ALS，sALS)患者癥狀前期和癥狀期骨骼肌病理改變特點(diǎn)，并探討了骨骼肌病理改變與疾病進(jìn)展速率的相關(guān)性。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象回顧性分析2011年4月至2018年3月就診于首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的sALS患者29例，其中男18例，女11例。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)行肌肉活檢提示神經(jīng)源性損害；(2)隨訪時(shí)符合世界神經(jīng)病學(xué)聯(lián)盟的修訂版ALS診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]中的“臨床確診(clinically definite)”或“臨床很可能(clinically probable)”標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)除外其他可導(dǎo)致骨骼肌神經(jīng)源性損害的疾病。

1.2 方法

1.2.1臨床資料采集：包括性別、年齡、病程、活檢部位肌力(徒手肌力法，0～5級(jí))、ALS功能評(píng)分量表修訂版(ALS functional rating scale-revised，ALSFRS-R)、疾病進(jìn)展速率(progression rate，PR)評(píng)估。PR計(jì)算公式：PR=(48-ALSFRS-R評(píng)分)/疾病病程(月)。

1.2.2分組：(1)根據(jù)患者活檢部位肌力異常情況分為癥狀前期(活檢部位肌力=5級(jí))和癥狀期(活檢部位肌力<5級(jí))；(2)根據(jù)患者PR中位數(shù)分為緩慢進(jìn)展組(PR≤中位數(shù))和快速進(jìn)展組(PR>中位數(shù))。

1.2.3骨骼肌病理檢：取肱二頭肌或三角肌組織標(biāo)本，經(jīng)異戊烷及液氮冰凍包埋處理后置-80℃冰箱備用。行組織切片(片厚8 μm)，行HE、GT染色觀察角形萎縮肌纖維及小組樣萎縮情況，行NADH、SDH染色觀察靶及靶樣纖維，行ATPase染色(pH分別為4.2、9.5)觀察群組化及兩型肌纖維分布情況，每種染色取2張切片，選擇染色成像較好的切片置光學(xué)顯微鏡下觀察患者3束不同肌束內(nèi)分別出現(xiàn)角形萎縮肌纖維數(shù)目、小組樣萎縮、群組化及靶纖維數(shù)目，均以最高值進(jìn)行分級(jí)。計(jì)算角形萎縮肌纖維中Ⅰ型和Ⅱ型肌纖維百分比(Ⅰ型或Ⅱ型角形萎縮肌纖維數(shù)/角形萎縮肌纖維總數(shù)×100%)以及群組化中Ⅰ型和Ⅱ型肌纖維各自群組化百分比(Ⅰ型或Ⅱ型肌纖維群組化數(shù)/群組化總數(shù)目×100%)。

(1)肌纖維萎縮程度分級(jí)：①無(wú)小組樣萎縮：僅有散在的角形萎縮肌纖維；②輕度小組樣萎縮：1束肌纖維內(nèi)成組的角形萎縮肌纖維為3～15個(gè)；③重度小組樣萎縮：肌束內(nèi)成組的角形萎縮肌纖維大于15個(gè)。

(2)角形萎縮肌纖維中，兩型肌纖維受累分布：①Ⅰ型肌纖維萎縮為主：Ⅰ型萎縮肌纖維比例達(dá)60%及以上；②Ⅱ型肌纖維萎縮為主：Ⅱ型萎縮肌纖維比例達(dá)60%及以上；③兩型肌纖維均等受累：兩型肌纖維萎縮所占比例無(wú)明顯差別。

(3)肌纖維群組化分級(jí)：①Ⅰ型肌纖維群組化為主：Ⅰ型肌纖維群組化數(shù)目比例占群組化肌纖維比例達(dá)60%及以上；②Ⅱ型肌纖維群組化為主：Ⅱ型肌纖維群組化數(shù)量比例達(dá)60%及以上；③兩型肌纖維均等：兩類肌纖維群組化現(xiàn)象無(wú)明顯差別。

(4)靶纖維化程度分級(jí)：①無(wú)靶纖維化：3束肌纖維中均未見靶及靶樣肌纖維；②輕度靶纖維化：每束肌纖維內(nèi)靶樣纖維數(shù)目小于等于15個(gè)；③重度靶纖維化：每束肌纖維內(nèi)靶樣纖維數(shù)目大于15個(gè)。

1.2.4神經(jīng)再生支配代償程度：小組樣萎縮代表著失神經(jīng)改變，而群組化現(xiàn)象為神經(jīng)再支配改變。根據(jù)上述分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，分別將小組樣萎縮程度分為無(wú)(1分)，輕度(2分)和重度(3分)，將群組化程度分為無(wú)(1分)，低(2分，Ⅰ型/Ⅱ型肌纖維群組化數(shù)量比例小于60%)以及高(3分，Ⅰ型/Ⅱ型肌纖維群組化數(shù)量≥60%)。按下列公式計(jì)算神經(jīng)再生支配代償程度：神經(jīng)再生支配代償程度=群組化程度/小組樣萎縮程度。神經(jīng)再生支配代償程度<1提示患者代償較差，≥1提示患者代償良好。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用卡方檢驗(yàn)和Fisher精確概率法；符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。以P<0.05表示差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征比較29例sALS患者PR中位數(shù)0.75分/月，四分位數(shù)間距為1.40分/月，以中位數(shù)0.75分/月為界分組，其中緩慢進(jìn)展組15例，快速進(jìn)展組14例。與快速進(jìn)展組比較，緩慢進(jìn)展組病程更短，ALSFRS-R評(píng)分更高，PR更慢(均P<0.05)，而兩組間性別構(gòu)成、發(fā)病年齡、起病部位及活檢部位肌力正常者占比比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05)。結(jié)果見表1。

表1 兩組sALS患者臨床資料比較

2.2 骨骼肌病理改變29例患者HE及GT染色均可見肌纖維大小不等，角形萎縮的肌纖維呈散在或小組樣分布(圖1A、B)。部分患者病理切片NADH染色可見靶纖維(圖1C)。ATP酶染色(pH值4.2)可見萎縮的肌纖維累及兩型或/和群組化現(xiàn)象(圖1D)。

2.3 不同疾病階段肌纖維的萎縮及群組化癥狀前期(n=9)和癥狀期(n=20)患者Ⅰ、Ⅱ型肌纖維均存在失神經(jīng)改變，偶可見Ⅰ型或Ⅱ型肌纖維萎縮為主的病理改變。癥狀前期和癥狀期患者間發(fā)生不同類型肌纖維萎縮患者構(gòu)成無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。癥狀前期患者骨骼肌纖維均存在群組化現(xiàn)象，癥狀期患者存在肌纖維群組化患者占85%，兩組患者發(fā)生不同類型肌纖維群組化者構(gòu)成無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見表2～3。

注：sALS：散發(fā)性肌萎縮側(cè)索硬化圖1 某例sALS患者左側(cè)肱二頭肌肌肉活檢病理學(xué)檢查結(jié)果(HE染色)：角形萎縮肌纖維呈散在分布 注：sALS：散發(fā)性肌萎縮側(cè)索硬化圖2 某例ALS患者左側(cè)三角肌肌肉活檢病理學(xué)檢查結(jié)果：角形萎縮肌纖維呈小組樣分布(A，HE染色)，肌纖維中靶及靶樣纖維(B，NADH染色)，肌纖維高度群組化(C；ATPase染色，pH4.2)

表2 不同疾病階段sALS患者骨骼肌小組樣萎縮構(gòu)成比較〔n(%)〕

表3 不同疾病階段sALS患者骨骼肌群組化構(gòu)成比較〔n(%)〕

2.4 PR與骨骼肌病理改變的關(guān)系29例患者中，出現(xiàn)小組樣萎縮患者25例(86.2%)，出現(xiàn)靶纖維的患者12例(41.4%)，出現(xiàn)群組化的患者26例(89.7%)。緩慢進(jìn)展組(n=15)和快速進(jìn)展組(n=14)出現(xiàn)小組樣萎縮、群組化及靶纖維改變的患者分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。結(jié)果見表4。

表4 兩組sALS患者骨骼肌病理改變特點(diǎn)〔n(%)〕

2.5 神經(jīng)再生支配代償程度與PR的關(guān)系緩慢進(jìn)展組神經(jīng)再生支配代償程度良好者占比高于快速進(jìn)展組，神經(jīng)再生支配代償程度更高(P<0.01，P<0.05)。結(jié)果見表4。

3 討論

該研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是癥狀前期還是癥狀期，sALS患者Ⅰ、Ⅱ型肌纖維均存在失神經(jīng)損害(角形萎縮肌纖維呈小組樣分布)及神經(jīng)再生支配(靶纖維化及群組化)的病理改變，而癥狀前期患者及緩慢進(jìn)展組患者骨骼肌纖維均存在群組化現(xiàn)象提示神經(jīng)再生支配良好。不同疾病階段sALS患者發(fā)生Ⅰ、Ⅱ型肌纖維萎縮及群組化者的構(gòu)成比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這與既往部分研究結(jié)果相符，也印證了ALS是一種急、慢性失神經(jīng)并存神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。此外，該研究結(jié)果顯示，不同PR患者間出現(xiàn)小組樣萎縮、靶纖維及群組化的患者分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展緩慢患者的神經(jīng)再生支配的程度明顯升高，提示神經(jīng)再生支配程度較失神經(jīng)對(duì)ALS患者的疾病進(jìn)展的影響可能更大。在患者失神經(jīng)程度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的情況下，神經(jīng)再生程度高的患者，其骨骼肌萎縮無(wú)力癥狀更輕，ALSFRS-R評(píng)分下降少，PR更慢[9-10]。電生理研究顯示運(yùn)動(dòng)單位數(shù)目估計(jì)(motor unit number estimation，MUNE)下降快的患者ALSFRS-R評(píng)分下降也快[11-12]，表明神經(jīng)再生支配與ALS的疾病進(jìn)程相關(guān)。

既往研究結(jié)果顯示，SOD1G93A小鼠存在選擇性運(yùn)動(dòng)單位丟失，支配Ⅱ型肌纖維的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元更易發(fā)生變性，且這種選擇性損害在ALS小鼠終身存在，而支配Ⅰ型肌纖維的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元?jiǎng)t會(huì)再生代償支配失神經(jīng)的骨骼肌[13]。上述現(xiàn)象可能與支配運(yùn)動(dòng)單位的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有關(guān)，支配快運(yùn)動(dòng)單位的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的胞體大，軸索直徑寬，神經(jīng)支配率高，對(duì)能量的需求量大，進(jìn)而導(dǎo)致其抗損傷能力弱[14]。然而一項(xiàng)針對(duì)6例小樣本ALS患者的尸檢研究發(fā)現(xiàn)，ALS患者角形萎縮肌纖維可累及兩型，有輕度的肌纖維群組化，并非選擇性Ⅱ型運(yùn)動(dòng)單位受累，偶可見輕度Ⅰ型或Ⅱ型肌纖維占優(yōu)勢(shì)[15]。該研究發(fā)現(xiàn)，在sALS患者的不同臨床階段不存在Ⅱ型運(yùn)動(dòng)單位更易受損的情況，這與Hegedus等[13]研究結(jié)果顯示的SOD1G93A小鼠Ⅱ型肌纖維選擇性受累且受累程度更重的結(jié)果不符。其原因可能與ALS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜而SOD1G93A小鼠模型發(fā)病機(jī)制較單一有關(guān)。SOD1G93A小鼠的發(fā)病機(jī)制主要是氧化應(yīng)激障礙，其出現(xiàn)選擇性Ⅱ型肌纖維的運(yùn)動(dòng)單元丟失可能與兩型肌纖維的活性氧代謝相關(guān)，Ⅱ型肌纖維中的H2O2含量是Ⅰ型纖維的3倍[16-17]，但Ⅰ型肌纖維中的超氧化物歧化酶1型[18]及過(guò)氧化氫酶[19]的活性較Ⅱ型肌纖維的活性更高。因此，當(dāng)SOD1基因突變致超氧化物歧化酶功能障礙時(shí)，Ⅱ型肌纖維更易遭受氧化應(yīng)激損傷。該研究未發(fā)現(xiàn)Ⅱ型肌纖維更易受損及Ⅰ型肌纖維明顯代償增多現(xiàn)象。

綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)sALS患者骨骼肌并無(wú)選擇性肌纖維受累現(xiàn)象，并且神經(jīng)再生支配代償程度越高的患者疾病進(jìn)展更加緩慢，提示可從促進(jìn)骨骼肌神經(jīng)再生支配的角度著手，探索延長(zhǎng)ALS患者生存期的藥物靶點(diǎn)。