白銀陽，熊芳，張昀，陳潔，徐麗爽，汪敏

環(huán)境雌激素對男性生殖健康的影響越來越受到社會的關(guān)注。塑料制品雙酚A（bisphenol A，BPA）是一種與人類生活密切相關(guān)，并對人類生殖健康產(chǎn)生廣泛影響的環(huán)境雌激素[1-2]。美國的一項調(diào)查研究顯示，90%的人群尿液中都能檢測到BPA。BPA易通過血胎和血腦屏障，在人羊水、母體和胎兒血、胎盤和母乳中均可檢測到[3]，同時胎兒肝臟的解毒代謝功能不健全，使得圍生期對BPA的生殖毒性作用尤其敏感[4]。大量文獻報道，低劑量BPA暴露能夠損害雄性動物生精功能[4-5]，而關(guān)于圍生期低劑量BPA對睪丸生精過程的影響鮮有報道。

睪丸的精子發(fā)生包括從精原細胞到初級精母細胞的有絲分裂和精母細胞到精子細胞的減數(shù)分裂兩個階段。生精細胞的有絲分裂和減數(shù)分裂受到許多調(diào)節(jié)蛋白的調(diào)控。睪丸周期蛋白cyclins及其激酶cdks基因（cdk1和cdk2）對于生精細胞分裂過程的調(diào)控至關(guān)重要[6]。精子發(fā)生過程還受下丘腦-垂體-睪丸軸的調(diào)控，下丘腦促性腺激素釋放激素（gonadotrophin-releasing hormone，GnRH）神經(jīng)元的活性主要受到下丘腦弓狀核（ARC）kisspeptin神經(jīng)元的正向調(diào)控[7]。本文以母鼠圍生期即妊娠第10天到分娩后第7天作為低劑量BPA的暴露時間窗，建立子代雄鼠模型，研究BPA對子代雄鼠生精過程早期的影響，通過觀察下丘腦視前區(qū)（POA）-GnRH和ARCkiss1的表達以及睪丸生精相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白的表達探討B(tài)PA影響生精過程的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物成年雌、雄性SD大鼠（體質(zhì)量250～300 g）購自上海斯萊克實驗動物中心[許可證：SCXK（滬）2007-0005]，飼養(yǎng)條件：恒定溫度（22～25 ℃）、恒定濕度（40%～50%），12 h人工照明。雌性∶雄性=1∶1合籠，置于特定帶托盤的交配籠，每日清晨觀察托盤中有無乳白色陰道栓，發(fā)現(xiàn)陰道栓者定義為妊娠第0天。

1.2 主要試劑配制BPA和實驗用茶油購自美國Sigma公司。小鼠抗kisspeptin抗體購自日本Takeda藥品公司，小鼠抗GnRH抗體購自美國Millipore公司，均為單克隆抗體，適合免疫組織化學法實驗。羊抗小鼠生物素標記二抗購自美國Bioworld公司；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime PCR）試劑盒購自日本Takara公司；蘇木素、伊紅購自國藥集團化學試劑有限公司；激素放射性免疫試劑盒購于北京北方生物技術(shù)研究所。

1.3 BPA染毒

1.3.1 分組和BPA劑量妊娠母鼠隨機分為2組，每組10只。根據(jù)現(xiàn)在對低劑量研究的熱點及相關(guān)文獻報道[8]，本研究確定妊娠母鼠暴露BPA的劑量為2 μg/（kg·d）。需要說明的是，出生前后是大鼠下丘腦kisspeptin神經(jīng)元分化形成的關(guān)鍵時期，為探討B(tài)PA作用于子代雄鼠的中樞機制，本研究確定母鼠的BPA染毒時間為妊娠第10天至分娩后第7天。再者，本文“低劑量”BPA[2 μg/（kg·d）]是妊娠母鼠和分娩后母鼠（哺乳期）的每日染毒劑量，子代“BPA染毒”劑量、特別是通過母乳間接接觸BPA的實際劑量本文并未探究。

1.3.2 BPA染毒處理妊娠第10天開始至分娩后第7天，一組妊娠母鼠每日皮下注射BPA（其雄性子代鼠為BPA染毒組），另一組妊娠母鼠每日皮下注射等體積的溶劑橄欖油（其雄性子代鼠為對照組）。本文預實驗動態(tài)觀察睪丸發(fā)育結(jié)果顯示，大鼠支持細胞大約在出生后18 d完成增殖，睪丸生精小管內(nèi)粗線期精母細胞在出生后21 d開始形成，圓形精子細胞在出生后24 d開始出現(xiàn)。因此，子代雄鼠分別在第一波生精發(fā)生的關(guān)鍵時期即出生后18、21、24 d（PND18/21/24）進行取材研究（每組每個時間點各10只）。

1.4 標本采集

1.4.1 腦組織每組10只雄性子代大鼠，稱重后用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉后仰臥位固定，直接取出腦組織，液氮速凍后置于-20 ℃冰凍切片機（CM1510S，德國Leica公司）上進行修飾，借助于體視顯微鏡分離下丘腦，分別切約2 mm×2 mm×2 mm的包含POA和ARC核團的腦組織，保存于-80 ℃冰箱。大致的核團定位方法：POA（前囟點前0.6 mm至前囟點后0.48 mm）和ARC（前囟點后1.8 mm至前囟點后3.96 mm），這些標志和參數(shù)在實際操作時可參考。

1.4.2 睪丸組織充分暴露視野，取出睪丸并稱質(zhì)量，一側(cè)放入Bouin液中固定，以觀察組織形態(tài)；另一側(cè)睪丸于冰上迅速去包膜，-20 ℃冰箱冷凍后切分為5 mm×5 mm×5 mm的小塊，液氮速凍后保存于-80 ℃，用于mRNA測定。

1.5 睪丸組織學睪丸用Bouin液固定，石蠟包埋，用石蠟切片機切片厚度為5 μm，切片貼于載玻片上。常規(guī)HE染色后光鏡觀察組織形態(tài)。并統(tǒng)計以下指標。

1.5.1 生精小管直徑在放大10倍物鏡下，隨機選取200個生精小管，測量其直徑。

1.5.2 圓形精子細胞數(shù)量和管腔率在放大20倍物鏡下，“S”形移動視野，選取20個測試視野，統(tǒng)計5張切片，計數(shù)總管腔數(shù)目、含圓形精子細胞的管腔數(shù)目和圓形細胞數(shù)量，圓形精子細胞管腔率=含圓形精子細胞的管腔數(shù)目/總管腔數(shù)目。

1.5.3 各級生精細胞體積采用“121個點”數(shù)點法檢測支持細胞和各級生精細胞的體積。在放大100倍物鏡下，選取5張切片，每張切片隨機選擇20個規(guī)則圓形或橢圓形的生精小管。用含有121個交叉點的目鏡觀察，計數(shù)交叉點落在支持細胞和各級生精細胞胞核上以及管腔內(nèi)的個數(shù)，并計算它們占總點數(shù)（121個點）的比例（點比率），支持細胞和各級生精細胞體積等于總睪丸體積（等于睪丸質(zhì)量）乘點比率[9]。睪丸各級生精細胞體積可作為細胞數(shù)量的指標。

1.6 激素測定采用放射免疫方法測定檢測血漿中黃體生成激素（luteinizing hormone，LH）、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）以及睪酮（testosterone，T）和雌二醇（estradiol，E2）的水平。激素放射性免疫試劑盒購于北京北方生物技術(shù)研究所。

1.7 POA和ARC組織kiss1/GnRH mRNA表達、睪丸組織cyclin A1/cyclin B/c-jun/c-fos mRNA表達的檢測將下丘腦和睪丸組織置于離心管中，每50～100 mg組織加入1 mL Trizol RNA提取液，勻漿，室溫放置15 min。先后加入0.2 mL氯仿、0.5 mL異丙醇，分別混勻、離心、棄上清，加入1 mL 75%乙醇洗滌。用50 μL焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水溶解RNA沉淀，核酸蛋白檢測儀測定樣品OD260、OD280和RNA的濃度。樣品RNA濃度統(tǒng)一稀釋到0.25 μg/μL。在0.2 mL無核糖核酸酶（Rnase）的PCR管中依次加入逆轉(zhuǎn)錄試劑，混合后置于PCR擴增儀中進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：37 ℃15 min，85 ℃5 s，4 ℃終止反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄后的cDNA加DEPC水稀釋10～20倍混勻并分裝，于-20 ℃保存。引物序列由Invitrogen公司合成，引物序列見表1。

表1 實時定量PCR引物序列

應(yīng)用日本Takara公司的SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進行實時熒光定量PCR。將配制好的反應(yīng)體系加入到96孔板中，每個樣品的目的基因和內(nèi)參基因都設(shè)3個平行反應(yīng)管。利用ABI 7300型實時熒光定量PCR儀進行PCR擴增。每個樣品設(shè)3個復孔，Ct值取平均值，數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt法分析：ΔCt=Ct目的基因－Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt實驗組－ΔCt對照組。

1.8 統(tǒng)計學方法采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)資料用均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 BPA對子代雄鼠睪丸精子發(fā)生的影響子代雄鼠出生后24 d的睪丸生精小管內(nèi)出現(xiàn)圓形精子細胞，BPA組子代雄鼠睪丸生精小管內(nèi)圓形精子細胞數(shù)量明顯多于對照組，見圖1。24日齡BPA組子代雄鼠的睪丸生精小管直徑、圓形精子細胞數(shù)量和圓形精子細胞管腔率較對照組增加（均P＜0.05）；而BPA組雄鼠睪丸內(nèi)支持細胞、精原細胞和精母細胞的體積與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。見表2。

表2 圍生期低劑量BPA暴露對子代雄鼠睪丸精子發(fā)生的影響（）

表2 圍生期低劑量BPA暴露對子代雄鼠睪丸精子發(fā)生的影響（）

圖1 雄鼠睪丸組織（HE染色×100）

2.2 BPA組子代雄鼠的睪丸精子發(fā)生調(diào)控因子表達睪丸周期蛋白cyclins和AP-1家族基因在精子發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。PCR結(jié)果顯示，BPA組子代雄鼠出生后21 d和24 d的cyclin A1基因表達水平比對照組升高（P＜0.01，見圖2A），cyclin B的基因表達水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，見圖2B）。c-jun和c-fos是cyclin A1的重要正向調(diào)控因子。本研究發(fā)現(xiàn)，21日齡BPA組子代雄鼠的c-jun和c-fos基因表達水平也比對照組明顯增加（P＜0.01，見圖2C、2D）。

圖2 圍生期BPA暴露對子代雄鼠睪丸精子發(fā)生調(diào)控因子的影響

2.3 BPA對子代雄鼠生殖激素的影響垂體和性腺分泌的生殖激素可調(diào)節(jié)睪丸的精子發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，21日齡和24日齡BPA組子代雄鼠血漿FSH和LH的水平高于對照組（P＜0.05，見圖3A、3B），而出生后18 d 2組雄鼠的血漿FSH和LH水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；此外，2組雄鼠血漿T和E2的水平比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，見圖3C、3D）。

圖3 圍生期低劑量BPA暴露對子代雄鼠生殖激素的影響

2.4 BPA對雄鼠下丘腦GnRH和kiss1基因表達的影響垂體促性腺激素的分泌受到下丘腦分泌GnRH的調(diào)控，GnRH的釋放又接受下丘腦kisspeptin神經(jīng)元的參與調(diào)節(jié)。為探討B(tài)PA導致促性腺激素水平升高的可能原因，本研究檢測了21日齡雄鼠下丘腦GnRH和kiss1的基因表達水平。BPA組雄鼠下丘腦GnRH和kiss1 mRNA的表達水平較對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義（GnRH：P＜0.05，kiss1：P＜0.01，見圖4A、4B）。

圖4 圍生期BPA暴露對子代雄鼠下丘腦POA-GnRH和ARC-kiss1基因表達的影響

3 討論

3.1 圍生期接觸低劑量BPA促進子代雄鼠精子發(fā)生BPA作為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，廣泛存在于我們的日常生活中，發(fā)揮模擬或拮抗內(nèi)源性雌激素的作用，干擾機體正常的生殖內(nèi)分泌調(diào)節(jié)[1-2]。Atanassova等[9]發(fā)現(xiàn)，新生兒期接觸低劑量BPA可促進生精發(fā)生的過程。與其結(jié)論相一致的是，本研究發(fā)現(xiàn)，圍生期接觸低劑量BPA也可促進子代雄鼠睪丸生精發(fā)生，與其不同的是，本文中BPA暴露的時期為圍生期，母體是BPA的直接暴露對象，而子代雄鼠只是通過母體血液或母乳的間接接觸進行染毒，因此子代雄鼠的具體染毒劑量尚不明確。此外，本研究顯示，圍生期接觸低劑量BPA促進子代雄鼠（青春前期）睪丸內(nèi)圓形精子細胞數(shù)量顯著增加，但并不影響睪丸支持細胞、精原細胞和精母細胞的數(shù)量。睪丸的精子發(fā)生包括從精原細胞到初級精母細胞的有絲分裂和精母細胞到精子細胞的減數(shù)分裂兩個階段。在生精細胞分裂中檢測支持細胞和各級生精細胞的數(shù)量，可用于評估睪丸的第一波生精過程[10]。圓形精子細胞的出現(xiàn)反映第一波精子發(fā)生減數(shù)分裂的完成。本文提出，圍生期接觸低劑量BPA可促進睪丸第一波精子發(fā)生的減數(shù)分裂，刺激睪丸生精小管內(nèi)圓形精子細胞的生成。而不同劑量的環(huán)境雌激素對生殖發(fā)育的影響卻截然不同。研究發(fā)現(xiàn)，新生兒期接觸高劑量己烯雌酚（環(huán)境雌激素）能干擾雄鼠生殖發(fā)育，而低劑量己烯雌酚卻能促進雄鼠性發(fā)育和生精發(fā)生。也有報道青春前期接觸低劑量BPA可抑制睪丸類固醇生成酶的活性進而減少睪酮的生成[5]。因此，BPA對雄性生殖發(fā)育影響與暴露時期及其劑量密切相關(guān)。

3.2 圍生期接觸低劑量BPA提高睪丸特異性周期蛋白的基因表達為了探討圍生期低劑量BPA暴露促進生精細胞減數(shù)分裂的可能機制，我們進一步檢測了減數(shù)分裂相關(guān)調(diào)節(jié)因子的表達活性。本研究發(fā)現(xiàn)，圍生期接觸低劑量BPA導致青春前期子代雄性睪丸內(nèi)cyclin A1的基因表達顯著增加，而同家族成員cyclin B的表達卻無顯著改變。睪丸周期蛋白在生精細胞分裂過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。睪丸特異性周期蛋白cyclin A1主要表達在粗線期晚期和終變期精母細胞，參與減數(shù)分裂G1/S和G2/M期的轉(zhuǎn)變，在精母細胞第一次減數(shù)分裂過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，生精細胞減數(shù)分裂啟動過程中cyclin A1的表達顯著增加[11-12]。Cyclin A1的編碼基因Ccna1敲除雄鼠生精過程被阻斷在第一次減數(shù)分裂前，表現(xiàn)為不育[11]。提示，BPA可能通過增加睪丸內(nèi)cyclin A1的表達促進生精細胞減數(shù)分裂。本研究還發(fā)現(xiàn)，圍生期低劑量BPA暴露還能增加21日齡子代雄鼠睪丸內(nèi)c-jun和c-fos的基因表達。AP-1家族成員基因c-jun和c-fos是cyclin A1上游重要的正向調(diào)節(jié)因子，c-jun和c-fos可形成異二聚體，共同提高cyclin A1基因的表達[13]。提示，圍生期接觸低劑量BPA可能通過提高c-jun和c-fos的表達，增強cyclin A1基因的轉(zhuǎn)錄活性，進而促進睪丸精子發(fā)生的減數(shù)分裂過程。

3.3 圍生期接觸低劑量BPA促進子代雄鼠促性腺激素的分泌垂體分泌的FSH和睪丸分泌的睪酮是啟動和維持精子發(fā)生的主要因素。FSH對支持細胞的增殖和活性起決定性作用，F(xiàn)SH通過調(diào)節(jié)因子直接或間接促進支持細胞的增殖[14]。FSH還能夠增加生精細胞的數(shù)量，促進精母細胞進入減數(shù)分裂。而睪酮能夠促進生精細胞減數(shù)分裂的完成[15]。LH作用于睪丸間質(zhì)細胞，促進睪酮的生成。本研究發(fā)現(xiàn)，圍生期接觸低劑量BPA導致子代雄鼠血漿中FSH和LH的水平顯著增加，但并不改變血漿中睪酮和E2的水平。推測，BPA組雄鼠血漿FSH和LH水平的升高是促進睪丸精子發(fā)生的關(guān)鍵因素。與血漿FSH的變化不一致，2組間睪丸支持細胞的體積（代表數(shù)量）并無差異，分析原因為支持細胞的增殖過程一般在出生后18 d之前結(jié)束，而BPA組雄鼠FSH水平的升高出現(xiàn)在出生后21 d之后，因此2組間支持細胞的數(shù)量無顯著差異。盡管BPA組雄鼠血漿LH的水平顯著增加，血漿睪酮的水平卻無明顯變化，體外研究發(fā)現(xiàn)，BPA可干擾人蛻膜細胞LH受體的表達[16]，因此推測BPA對睪丸生精細胞LH受體存在潛在影響。以上結(jié)果提示，圍生期低劑量BPA暴露可能通過增加促性腺激素的生成，促進睪丸的生精發(fā)生。C-fos基因的表達受到促性腺激素的正向調(diào)節(jié)[17]。本研究中BPA組雄鼠c-fos基因表達的增加可能是受到促性腺激素的間接調(diào)節(jié)作用，但尚不能排除BPA對睪丸基因表達直接作用。

3.4 圍生期接觸低劑量BPA提高子代雄鼠下丘腦ARC-kiss1和POA-GnRH基因表達文獻報道，圍生期接觸高劑量BPA能夠增加子代雄鼠下丘腦kiss 1和GnRH基因的表達[18]。與其報道相一致，本研究發(fā)現(xiàn)，圍生期接觸低劑量BPA就能增加ARC-kiss 1和POA-GnRH的基因表達。雄鼠ARC-kiss 1在出生后3 d開始表達，青春期啟動時ARC-kiss 1的基因表達急劇增加[19]。大鼠青春期ARC-kiss 1基因的表達水平是幼年期的1.5倍[20]。95%的GnRH神經(jīng)元上表達kisspeptin的受體GPR54，當下丘腦ARC-kisspeptin神經(jīng)元活性增強時，可通過GPR54受體激活GnRH神經(jīng)元，啟動下游的生殖內(nèi)分泌軸[7]。提示圍生期低劑量BPA暴露能夠提前激活ARC-kisspeptin系統(tǒng)，促進GnRH的合成和釋放，提高血漿FSH水平，促進睪丸精子發(fā)生。

4 結(jié)語

BPA對人類生殖健康的影響已受到廣泛關(guān)注，既往研究主要集中在BPA的生殖毒性（精子數(shù)量減少、精子畸形率增加等）和導致生殖發(fā)育異常（雌性性早熟等）。與既往研究結(jié)果不同的是，本研究發(fā)現(xiàn)圍生期接觸低劑量BPA可促進子代雄鼠睪丸的精子發(fā)生，除BPA對睪丸的直接作用外，BPA還可能通過激活ARC-kisspeptin神經(jīng)元，提前啟動生殖內(nèi)分泌軸，導致睪丸生精發(fā)生提前。但是BPA導致子代雄鼠生精發(fā)生提前的具體作用靶點尚不明確，還需要進一步更深入的研究。作為人類生活中塑料制品的主要成份，BPA對人和動物生殖健康的影響越來越受到人們的重視，尋找有效的并且安全的BPA替代物是許多研究者們不斷努力的方向。