元哲進(jìn)，金麗華，白野

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

過(guò)量攝入高糖高脂飲食導(dǎo)致的肥胖是多種慢性疾病的誘因之一，典型的如2型糖尿病[1-2](Type 2 diabetes, T2D)。T2D是一種以胰島素抵抗為病理學(xué)標(biāo)志的代謝性疾病，同時(shí)有多食、多飲、多尿、身體消瘦的“三多一少”臨床表現(xiàn)[3]。若不及時(shí)治療，將會(huì)導(dǎo)致糖尿病病足、神經(jīng)病變、糖尿病腎病等嚴(yán)重并發(fā)癥甚至危及生命[4]。目前T2D的治療主要依靠口服降糖藥和注射胰島素，但這些藥物的安全性依然具有爭(zhēng)議[5]。盡管傳統(tǒng)意義上的T2D為成年人所患的疾病，但近年來(lái)兒童的發(fā)病率也逐漸提高[6]。因此，尋找能夠治療T2D且同時(shí)兼具安全和副作用小兩大優(yōu)點(diǎn)的藥物是十分重要的。

金銀花(LoniceraeJaponicaeFlos, LJ)是忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花[7]。其作為我國(guó)傳統(tǒng)藥食兩用植物，富含多種有機(jī)酸和類黃酮等藥效活性成分，在臨床上被廣泛用作抗菌和抗炎藥物。同時(shí)因其具有寒性，在民間常被用來(lái)治療中暑和保護(hù)視力[8]。

哺乳動(dòng)物的胰島素信號(hào)通路與體內(nèi)糖穩(wěn)態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖力和壽命密切相關(guān)[9]，此信號(hào)通路失調(diào)將導(dǎo)致多種代謝性疾病。目前，多種動(dòng)物模型用于研究其發(fā)病機(jī)制，黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster,Drosophila)是其中之一[10]。果蠅生活周期短、子代多、致病基因與人類高達(dá)74% 的同源性，使其成為研究胰島素代謝疾病的良好模型。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)果蠅喂食含有1 mol/L蔗糖的高糖培養(yǎng)基HSD作為對(duì)照組，HSD加入5%或10% LJ作為實(shí)驗(yàn)組，分析了果蠅生命周期、體質(zhì)量、發(fā)育時(shí)間、成蟲(chóng)生殖能力、后代存活力。同時(shí)，分析了LJ對(duì)S6k基因缺失突變體的細(xì)胞大小和脂肪儲(chǔ)存的影響，探討LJ對(duì)高糖誘導(dǎo)的代謝紊亂和胰島素信號(hào)通路的影響，為治療T2D提供理論基礎(chǔ)。

1 試劑與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑

金銀花：黑龍江省哈爾濱市人民同泰藥店；蔗糖(Sucrose)：Sigma公司；氟硼二吡咯(Boron-dipyrromethe, BODIPY)、鬼筆環(huán)肽(Phalloidin)：Life Technologies公司。

1.1.2 果蠅品系及培養(yǎng)條件

野生型黑腹果蠅(Drosophila)w1118購(gòu)自于Bloo-mingtonDrosophilastock center (Bloomington, IN, USA)，轉(zhuǎn)基因型黑腹果蠅S6kl-1/TM6B由Tian Xu教授饋贈(zèng)。培養(yǎng)溫度(25 ±1) ℃，相對(duì)濕度60%～70%。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

ALC-210.4型電子分析天平(北京賽多利斯公司)；Elix5型純化水系統(tǒng)(Millipore公司)；SZ51型顯微鏡(日本 Olympus公司)；Axioskop 2 plus型熒光顯微鏡( Zeiss公司)。

1.2 方法

1.2.1 金銀花提取物的制備

參考周洋等人[11]的水萃取法對(duì)金銀花進(jìn)行提取：稱20 g金銀花，加200 mL去離子水浸泡過(guò)夜，加熱煮沸后中火熬制3 h，過(guò)濾后，在濾渣中再加200 mL去離子水以同樣方法再次加熱熬制，收集兩次濾液并濃縮至100 mL即得到質(zhì)量體積比濃度為 0.2 g/mL(20%)的金銀花水提液備用。

1.2.2 果蠅培養(yǎng)基的配置及分組

參考李文佳等人[12]的玉米粉-酵母培養(yǎng)基配制方法分別配制含有0.15 mol/L蔗糖的低糖(設(shè)為L(zhǎng)SD組)和含有1 mol/L蔗糖的高糖培養(yǎng)基(設(shè)為HSD組)。HSD組中的去離子水換成等體積的金銀花提取物(LJ)，同時(shí)按質(zhì)量體積比保證相應(yīng)LJ的濃度，配制5%或10%提取物的培養(yǎng)基為HSD+5%LJ組成HSD+10%LJ組。

1.2.3 果蠅成蟲(chóng)生命周期的測(cè)定

取來(lái)自不同培養(yǎng)基中已經(jīng)羽化3 d的果蠅轉(zhuǎn)移至相同的新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，之后將雌性與雄性果蠅分開(kāi)，每組30只。以2 d為一個(gè)周期，將果蠅轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基中，并觀察記錄果蠅死亡情況，直至全部死亡。

1.2.4 蛹體積和果蠅成蟲(chóng)體質(zhì)量的測(cè)定

參考JUN等人[13]的蛹體積測(cè)定方法：將蛹放置在顯微鏡下以相同倍數(shù)進(jìn)行拍攝，圖片使用ImageJ軟件測(cè)量出蛹的長(zhǎng)度和寬度，以LSD組體積為標(biāo)準(zhǔn)，利用公式V=4/3π×(L/2)×(l/2)2(L：長(zhǎng)度；l：寬度)計(jì)算得到各組體積。收集果蠅成蟲(chóng)(羽化不超過(guò)8 h)至新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，之后將雌性與雄性果蠅分開(kāi)，每組30只，用天平稱重并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.5 成蟲(chóng)羽化率、成蟲(chóng)產(chǎn)卵率和受精卵孵化率的測(cè)定

將一定數(shù)量的雌果蠅6 h內(nèi)產(chǎn)的受精卵收集起來(lái)培養(yǎng)至蛹期，觀察，每24 h記錄蛹和蛹?xì)さ臄?shù)量，成蟲(chóng)羽化率即為蛹?xì)?shù)與總蛹數(shù)的比。將羽化5 d左右的雌雄成蟲(chóng)各100只裝入接卵器中，食物只供酵母，采用蘋(píng)果汁瓊脂平板封底，2 h左右進(jìn)行更換，同時(shí)數(shù)出受精卵的個(gè)數(shù)并記錄。成蟲(chóng)產(chǎn)卵率為雌果蠅每小時(shí)產(chǎn)下的受精卵個(gè)數(shù)。將上述平板放置在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)22 h后，記錄1齡幼蟲(chóng)(L1)的個(gè)數(shù)，受精卵孵化率即為每個(gè)平板中L1的數(shù)量與該平板中受精卵總數(shù)的比值。

1.2.6 三齡幼蟲(chóng)脂肪體細(xì)胞和脂肪油滴的染色

參考白野[14]等人的染色方法，在顯微鏡下，預(yù)冷PBS中提取三齡幼蟲(chóng)脂肪體組織，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBST清洗幾次后，用Phalloidin和 BODIPY分別染色30 min，中間也采用PBST清洗，DAPI染色 10 min，最后slow fade封片，顯微鏡下觀察并拍攝圖片。以LSD組染色數(shù)據(jù)為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果用ImageJ軟件分析脂肪體細(xì)胞和脂肪油滴面積。

1.2.7 成蟲(chóng)翅膀細(xì)胞面積的測(cè)定

分離20只雄果蠅成蟲(chóng)翅膀，在顯微鏡下以相同倍數(shù)進(jìn)行拍攝，在相同面積內(nèi)，使用ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)圖片中翅膀相同位置剛毛的個(gè)數(shù)。翅膀細(xì)胞面積即為該區(qū)域的面積與剛毛個(gè)數(shù)的比值。以LSD組翅膀細(xì)胞面積作為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算翅膀細(xì)胞面積。

1.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 金銀花對(duì)HSD果蠅生命周期的影響

ZHANG等人證實(shí)高糖飲食會(huì)縮短果蠅生命周期[9]。為了探究金銀花對(duì)HSD果蠅生命周期的影響，HSD中添加5%或10% LJ后喂食果蠅，分析其平均壽命、半數(shù)死亡時(shí)間和最長(zhǎng)壽命。為排除激素影響，雌雄果蠅在交配后被分開(kāi)單獨(dú)檢測(cè)。結(jié)果顯示，與LSD組相比，HSD組雌雄果蠅平均壽命、半數(shù)死亡時(shí)間和最長(zhǎng)壽命均顯著縮短(圖1，表1)，而補(bǔ)充5%或10% LJ后顯著延長(zhǎng)了雌雄果蠅的壽命。當(dāng)HSD中添加LJ后，果蠅平均壽命最少也延長(zhǎng)了3 d，半數(shù)死亡時(shí)間至少延長(zhǎng)了2 d，雌雄最長(zhǎng)壽命分別延長(zhǎng)了4 d和7 d以上(表1)。這些結(jié)果表明LJ明顯能夠提高HSD果蠅的生命周期，且10% LJ延長(zhǎng)效果更好，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用此濃度。

表1 LJ提取物對(duì)HSD果蠅生命周期的影響

2.2 金銀花對(duì)HSD果蠅個(gè)體大小的影響

HSD喂養(yǎng)的果蠅由于胰島素抵抗，發(fā)育異常，個(gè)體變小[15]。 為了探究金銀花能否改善這一現(xiàn)象，分別測(cè)量了蛹體積和成蟲(chóng)體質(zhì)量檢測(cè)幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)大小。結(jié)果顯示，HSD組相對(duì)蛹體積比LSD組下降44.9%(圖2A，C)。 同時(shí)，HSD組雌雄成蟲(chóng)體質(zhì)量較LSD組也分別下降38.7%、35.9%(圖2B，D)。當(dāng)添加10% LJ后，大小和體質(zhì)量得到顯著的改善。HSD+LJ組與HSD組比較，相對(duì)蛹體積增加64.1%，雌果蠅體質(zhì)量增加28.4%，但是雄果蠅體質(zhì)量沒(méi)有明顯的變化。這些結(jié)果表明金銀花可以緩解由HSD導(dǎo)致的果蠅蛹變小以及雌性成蟲(chóng)體質(zhì)量減輕的情況。

注：A.雌性果蠅；B.雄性果蠅。圖1 LJ提取物對(duì)HSD果蠅生命周期的影響

注：*P<0.05,***P<0.001。圖2 LJ提取物對(duì)HSD果蠅個(gè)體大小的影響

2.3 金銀花對(duì)HSD果蠅幼蟲(chóng)發(fā)育時(shí)間、成蟲(chóng)生殖能力、后代存活能力的影響

HSD喂養(yǎng)的果蠅生長(zhǎng)速度顯著減慢[16]。為了探究金銀花能否緩解HSD果蠅發(fā)育遲緩現(xiàn)象，分析了成蟲(chóng)孵化率。結(jié)果顯示，HSD顯著延長(zhǎng)了幼蟲(chóng)發(fā)育時(shí)間，當(dāng)接卵13 d后才有成蟲(chóng)孵出，而HSD+LJ組第11天就有成蟲(chóng)孵出(圖3A)。另外，HSD組蛹的最終孵化率為83.4%，而HSD+LJ組為95.4%(圖3A)。通過(guò)分析產(chǎn)卵率和受精卵孵化率發(fā)現(xiàn)，HSD組每小時(shí)產(chǎn)卵量約53個(gè)，LSD組約196個(gè)(圖3B)，兩組受精卵孵化率分別為78.7%和98.0%(圖3C)。當(dāng)HSD中補(bǔ)充10% LJ時(shí)，與HSD組相比產(chǎn)卵率提高4倍、受精卵孵化率提高了19.9%。這些結(jié)果表明，LJ顯著加快了 HSD果蠅幼蟲(chóng)的發(fā)育時(shí)間，且提升了HSD果蠅生殖能力和后代的存活能力。

注：***P<0.001。圖3 LJ對(duì)HSD果蠅幼蟲(chóng)發(fā)育時(shí)間、成蟲(chóng)生殖能力和后代存活能力的影響

2.4 金銀花對(duì)S6k突變體果蠅脂肪儲(chǔ)存的影響

在胰島素/胰島素生長(zhǎng)因子樣信號(hào)的傳導(dǎo)過(guò)程中，核糖體蛋白S6激酶(Ribosomal protein S6 Kinase, S6k)被激活后，會(huì)使磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸增加，發(fā)揮促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育的作用[16-17]。果蠅和哺乳動(dòng)物的S6k功能相似，控制生物體的生長(zhǎng)和發(fā)育[16-17]。在上述研究中，發(fā)現(xiàn)金銀花能夠緩解高糖誘導(dǎo)的生長(zhǎng)速度、壽命、個(gè)體大小和繁殖力，因此，為進(jìn)一步明確LJ對(duì)這一信號(hào)通路的影響，利用S6k基因缺失突變體果蠅喂食金銀花，分析其脂肪貯存和脂肪細(xì)胞大小。脂肪體是果蠅體內(nèi)的重要器官，主要作用為儲(chǔ)存脂肪以及遠(yuǎn)程控制營(yíng)養(yǎng)攝入與胰島素之間的穩(wěn)態(tài)[18]。結(jié)果顯示，和野生型相比S6k突變體脂肪油滴相對(duì)面積顯著減小了，當(dāng)在培養(yǎng)基中加入LJ后，與喂食LSD的突變體相比，LSD+LJ組的脂肪油滴面積增加了95.8%(圖4)。這些結(jié)果說(shuō)明，LJ可以有效緩解由于S6k的缺失導(dǎo)致的果蠅脂肪體脂肪油滴面積減小。

注：***P<0.001。圖4 LJ對(duì)S6k突變體果蠅脂肪儲(chǔ)存的影響

2.5 金銀花對(duì)S6k突變體果蠅脂肪體細(xì)胞和翅膀細(xì)胞大小的影響

和野生型比較S6k突變體果蠅個(gè)體和細(xì)胞面積減小[19]。 因此，通過(guò)分析脂肪體細(xì)胞和翅膀細(xì)胞的面積來(lái)分析LJ對(duì)個(gè)體大小的影響。結(jié)果顯示，與野生型比較S6k突變體果蠅的脂肪體細(xì)胞和翅膀細(xì)胞大小均顯著縮小(圖5)。當(dāng)在培養(yǎng)基中添加10% LJ后，與普通飲食的S6k突變體相比兩種細(xì)胞大小分別增加了11.9%和24.8%(圖5)。 以上結(jié)果表明LJ能夠增加S6k缺失果蠅的細(xì)胞大小。

注：***P<0.001。圖5 LJ對(duì)S6k突變體果蠅脂肪體細(xì)胞和翅膀細(xì)胞大小的影響

3 討論

目前T2D的治療主要包括口服降糖藥和注射胰島素兩種方法，但降糖藥普遍具有副作用且無(wú)論選擇哪種方法，都只是暫時(shí)延緩并發(fā)癥發(fā)生，而不是根治T2D。最近研究顯示，一些高血糖患者普遍存在葡萄糖代謝紊亂，但是不符合T2D的標(biāo)準(zhǔn)診斷，這種情況被稱為“前驅(qū)糖尿病”，如果這一階段能夠得到及時(shí)治療，可以完全治愈[20]。因此，副作用小且安全有效的降糖藥的開(kāi)發(fā)對(duì)于預(yù)防以及治療T2D是十分重要。金銀花是歷史悠久的藥食兩用植物，近年來(lái)有少量研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)降血糖有一定作用，但金銀花與胰島素信號(hào)通路相關(guān)的研究鮮見(jiàn)報(bào)道[21-22]。本研究利用喂食高糖飲食，建立了代謝紊亂的果蠅模型，通過(guò)分析生長(zhǎng)周期、個(gè)體大小、重量、羽化時(shí)間、生殖能力等，探究金銀花對(duì)高糖誘導(dǎo)的代謝紊亂的緩解作用。結(jié)果表明，LJ增加了HSD果蠅蛹的體積和成蟲(chóng)重量，加速了HSD幼蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育速度。同時(shí)，LJ提升了HSD果蠅生殖能力和后代生存能力。這些結(jié)果均顯示LJ可能通過(guò)影響胰島素信號(hào)通路來(lái)改善HSD果蠅體內(nèi)的糖代謝。為進(jìn)一步驗(yàn)證這個(gè)結(jié)論，分析了LJ對(duì)胰島素信號(hào)通路中重要基因—S6k基因低表達(dá)果蠅的脂肪儲(chǔ)存和細(xì)胞大小的影響。結(jié)果表明，LJ可以有效緩解由于S6k的缺失導(dǎo)致的果蠅脂肪油滴面積減小和細(xì)胞減小。這些結(jié)果進(jìn)一步證明LJ有可能影響了胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑，但具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。綜上所述，LJ具有價(jià)格低廉、副作用少、易獲得等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于臨床治療。本研究為金銀花治療T2D提供了理論基礎(chǔ)，為T2D治療藥物的開(kāi)發(fā)與利用提供了新思路。