杜芬，裴園利，薛瑤瑤，柏魯寧

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000)

缺血性卒中是一種臨床常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有高發(fā)病率、死亡率、致殘率等特點(diǎn)，且以老年人居多[1]。此病目前臨床最有效的治療手段是使缺血區(qū)重新獲得血氧供應(yīng)，但血液恢復(fù)灌注這一舉措會(huì)相應(yīng)出現(xiàn)更加嚴(yán)重的腦功能障礙，即腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI)[2]。CIRI是一種不可逆損傷，發(fā)生后會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷，造成神經(jīng)功能缺損，其病理機(jī)制復(fù)雜，目前臨床沒(méi)有特效藥物，許多研究者將目光投向中醫(yī)藥。杜仲(EucommiaulmoidesOliv)是我國(guó)傳統(tǒng)名貴滋補(bǔ)中藥材之一，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，杜仲的莖、根中富含苯丙素類(lèi)化學(xué)成分[3]，具有顯著的降血脂、降血壓及提高免疫力等活性，而其中化學(xué)成分咖啡酸和阿魏酸對(duì)體外微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有明顯保護(hù)作用[4]，對(duì)改善缺血區(qū)的神經(jīng)元，修復(fù)神經(jīng)損傷具有一定的作用。本研究通過(guò)探討杜仲不同劑量預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注保護(hù)作用的影響，旨在探討杜仲對(duì)腦組織起保護(hù)作用的最佳劑量。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

實(shí)驗(yàn)所用中藥生杜仲由陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室鑒定，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。生杜仲煎煮之前先用涼水浸泡30 min，水面沒(méi)過(guò)藥物大拇指一橫指即可，煎藥濃縮成生藥濃度為 1 g/mL，趁熱過(guò)濾方可，置于4 ℃冰箱保存。尼莫地平片(山西亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：180813)同購(gòu)自陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

SD清潔級(jí)雄性大鼠，體質(zhì)量260～280 g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK(川)2015-030，統(tǒng)一飼養(yǎng)于陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥藥理實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)環(huán)境符合規(guī)定，分籠飼養(yǎng)，飲食和飲水自由，室內(nèi)溫度23～26 ℃。大鼠按隨機(jī)數(shù)字表共分為6組：假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性藥物組、杜仲低劑量組、杜仲中劑量組及杜仲高劑量組，每組10只。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑、耗材與儀器

蘇木素伊紅染色試劑盒(HE)、4%多聚甲醛、10%水合氯醛均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司； MCAO線栓購(gòu)自平頂山豫順生物科技有限公司；電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；Morris水迷宮系統(tǒng)，上海欣軟信息科技有限公司；4 ℃冰箱，中國(guó)海爾(Haier)公司。

1.4 動(dòng)物預(yù)處理與模型制備

動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后，按照陽(yáng)性藥物組(10 mg/kg)、杜仲低劑量組(2 g/kg)、杜仲中劑量(4 g/kg)及高劑量組(8 g/kg)灌胃給藥，每日1次，連續(xù)14 d，保證藥物適宜的溫度與統(tǒng)一的濃度，在灌胃過(guò)程中避免操作不當(dāng)藥物流失，如若發(fā)生補(bǔ)足流失劑量。大鼠術(shù)前均禁食12 h，自由飲水，采用新進(jìn)改良Zea-Longa 線栓法[5]制備腦缺血再灌注損傷模型，統(tǒng)一采用腹腔注射10%水合氯醛0.35 mL/100 g麻醉大鼠，麻醉后將大鼠仰面四肢固定于木板上，按照個(gè)人操作習(xí)慣選擇頭尾固定方向，常規(guī)備皮消毒后找到頸總、頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈，插入線栓使其由頸總經(jīng)過(guò)頸內(nèi)到達(dá)大腦中動(dòng)脈，控制線栓插入時(shí)間，不宜進(jìn)入時(shí)可用利多卡因浸潤(rùn)頸總動(dòng)脈達(dá)到擴(kuò)血管作用，固定線栓，縫合消毒， 2 h后拔出線栓，實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組不插入線栓，其余步驟與手術(shù)組相同。大鼠蘇醒后觀察大鼠是否具備造模成功標(biāo)志，對(duì)沒(méi)有癥狀及意外死亡的大鼠取同批次SD大鼠按相應(yīng)的組別要求造模以補(bǔ)足實(shí)驗(yàn)大鼠只數(shù)。

1.5 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.5.1 神經(jīng)功能評(píng)分

再灌注24 h后采用Zea-Longa評(píng)分法評(píng)估大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分，對(duì)于可自由活動(dòng)、直線行走及行為正常等無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀者計(jì)0分；對(duì)于無(wú)法伸展對(duì)側(cè)前爪或不能完全伸展，伴有輕度神經(jīng)功能缺損者計(jì)1分；對(duì)于行走時(shí)身體向偏癱一側(cè)轉(zhuǎn)圈，達(dá)到中度神經(jīng)功能缺損癥狀者計(jì)2分；對(duì)于行走時(shí)向偏癱一側(cè)傾斜或傾倒，達(dá)到重度神經(jīng)功能缺損者計(jì)3分；對(duì)于意識(shí)喪失、無(wú)法自發(fā)行走者計(jì)4分。

1.5.2 大腦含水量

大鼠再灌注24 h后，開(kāi)顱取腦，去除小腦和嗅球部分，用生理鹽水將表面血漬沖洗干凈，用濾紙吸干表面水分，精準(zhǔn)稱(chēng)量后所得數(shù)據(jù)計(jì)為濕重，后將腦組織置于110 ℃恒溫干燥箱干烤24 h，并準(zhǔn)確稱(chēng)取腦組織所得數(shù)據(jù)計(jì)為干重，腦含水量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.5.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置為一圓柱形水池，池內(nèi)平臺(tái)可移動(dòng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)固定到某一象限不動(dòng)，水位高于平臺(tái) 1.5 cm，水溫需維持在(25 ±1) ℃。造模前5 天對(duì)所有大鼠進(jìn)行第一階段水迷宮實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練(定位航行試驗(yàn))，每天分別從第1、4象限將大鼠放入水中訓(xùn)練2次，間隔時(shí)間為15 min，規(guī)定設(shè)置時(shí)間90 s/次，若在90 s內(nèi)順利找到平臺(tái)者，終止實(shí)驗(yàn)，未找到平臺(tái)者，引導(dǎo)其上臺(tái)后停留10～15 s，以此加深大鼠記憶。第6天連接電腦詳細(xì)記錄定位航行實(shí)驗(yàn)相關(guān)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行第二階段測(cè)試(空間探索實(shí)驗(yàn))，我們將平臺(tái)撤離并選取原平臺(tái)所在鄰象限或者對(duì)象限作為入水點(diǎn)，記錄90 s內(nèi)大鼠通過(guò)平臺(tái)所在象限的次數(shù)以及記錄停留平臺(tái)所在象限的時(shí)間。造模后24 h重復(fù)定位航行及空間探索實(shí)驗(yàn)，完成后通過(guò)數(shù)據(jù)整理對(duì)比造模前后大鼠空間學(xué)習(xí)探索記憶功能的差異。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的大鼠需要立即采取保暖措施，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，必須保持環(huán)境的絕對(duì)固定性和安靜隱蔽性，實(shí)驗(yàn)人員不能隨意走動(dòng)，防止給大鼠形成空間記憶標(biāo)志物。

1.5.4 腦組織病理學(xué)觀察(HE染色)

先取各組自額極起第4片腦片，用甲醛溶液固定24 h以上。修整組織塊，標(biāo)記。然后依次進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、染色、后再脫水、透明，中性樹(shù)膠封固。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 不同劑量杜仲預(yù)處理對(duì)CIRI大鼠神經(jīng)功能及腦含水量的影響

模型制備成功后，大鼠會(huì)出現(xiàn)不同程度運(yùn)動(dòng)障礙，主要表現(xiàn)為對(duì)側(cè)前爪不能伸展、行走時(shí)身體向偏癱一側(cè)轉(zhuǎn)圈、傾斜或傾倒。模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分最高，為(2.70±0.48)分，與模型組比較，杜仲低劑量組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；杜仲中、高劑量組和陽(yáng)性藥物組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分明顯下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組大鼠腦含水量存在差異，模型組大鼠腦含水量最高，為(88.05±0.87)%，與假手術(shù)組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，杜仲低劑量組大鼠腦含水量降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；杜仲中、高劑量組和陽(yáng)性藥物組大鼠腦含水量明顯下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)表1。

表1 杜仲對(duì)CIRI大鼠神經(jīng)學(xué)評(píng)分及腦含水量的影響

2.2 不同劑量杜仲預(yù)處理對(duì)CIRI后大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能的影響

2.2.1 定位航行實(shí)驗(yàn)

在訓(xùn)練5 d后進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄，術(shù)前與假手術(shù)組比較，模型組、陽(yáng)性藥物組和杜仲低、中、高劑量組大鼠的逃避潛伏期與活動(dòng)總路程無(wú)顯著差異(P>0.05)。再灌注24 h后，模型組大鼠逃避潛伏期與活動(dòng)總路程最長(zhǎng)，分別為(69.82±30.24)s，(1 156.03±642.78)mm。與模型組比較，杜仲低劑量組大鼠逃避潛伏期與活動(dòng)總路程縮短，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；杜仲中、高劑量組與陽(yáng)性藥物組大鼠逃避潛伏期與活動(dòng)總路程明顯縮短，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)表2，圖1。

表2 杜仲對(duì)大鼠術(shù)后定位航行實(shí)驗(yàn)活動(dòng)總路徑和潛伏期的影響

2.2.2 空間探索實(shí)驗(yàn)

就游泳軌跡而言，經(jīng)過(guò)5 d的訓(xùn)練，各組在術(shù)前的游泳軌跡差別不明顯；術(shù)后與模型組相比較，杜仲中、高劑量及陽(yáng)性藥物組目標(biāo)明確，向著平臺(tái)游泳，且活動(dòng)范圍大，空間探索趨勢(shì)明顯，見(jiàn)圖1；再灌注24 h后，各組間大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)和所在平臺(tái)停留時(shí)間存在差異。模型組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)最少為(0.90±0.74)次，所在平臺(tái)停留時(shí)間最短為(17.32±8.24)s，與模型組比較，杜仲低劑量組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)增加，所在平臺(tái)停留時(shí)間延長(zhǎng)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；杜仲中、高劑量組和陽(yáng)性藥物組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)明顯增加，所在平臺(tái)停留時(shí)間明顯延長(zhǎng)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)表3。

圖1 術(shù)后各組大鼠空間探索軌跡圖

表3 杜仲對(duì)大鼠術(shù)后空間探索實(shí)驗(yàn)中穿越平臺(tái)次數(shù)和所在平臺(tái)停留時(shí)間的影響

2.3 各組對(duì)腦組織病理學(xué)改變的影響 (HE染色)

如圖2顯示，假手術(shù)組皮層結(jié)構(gòu)緊密，神經(jīng)元分布均勻；模型組皮層軟化，結(jié)構(gòu)疏松，呈碎片狀，神經(jīng)元數(shù)量減少，多無(wú)完整的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，呈不同程度的壞死，胞核固縮深染，胞質(zhì)胞核界限不清，腦膜斷裂，腦膜處及血管周?chē)梢?jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；杜仲低劑量組組織多見(jiàn)毛細(xì)血管周?chē)g隙變大，腦膜多見(jiàn)水腫，結(jié)構(gòu)疏松，腦膜血管擴(kuò)張神經(jīng)元數(shù)量輕度減少且排列不規(guī)則；杜仲中劑量組組織可見(jiàn)血管擴(kuò)張，毛細(xì)血管周?chē)g隙變大，水腫，結(jié)構(gòu)疏松。杜仲高劑量組及陽(yáng)性藥物組皮層結(jié)構(gòu)緊密，神經(jīng)元分布均勻，出現(xiàn)少量神經(jīng)元緊縮深染，未見(jiàn)神經(jīng)元明顯腫脹或壞死。

圖2 CIRI后各組大鼠皮層腦組織病理改變(HE，×20)

3 討論

CIRI是一種繼發(fā)性損傷，常常會(huì)導(dǎo)致不可逆的腦組織損傷，其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全闡明，可能與氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、自噬、細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)[6]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明杜仲具有擴(kuò)張血管、抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛等多種藥理作用[7]，更有研究表明杜仲在保護(hù)神經(jīng)元方面具有較好的效果，證實(shí)其成分綠原酸能夠抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化、NO的產(chǎn)生、IL-1β及TNF-α的釋放，充分發(fā)揮對(duì)神經(jīng)的保護(hù)作用[8]。本研究結(jié)果也表明，杜仲能減輕腦缺血大鼠的神經(jīng)功能障礙，且隨著劑量增加，效果更加顯著。

腦水腫是腦缺血性疾病功能障礙的主要原因，惡性腦水腫也是腦缺血患者死亡的主要原因，是其最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[9]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腦含水量明顯升高，給予杜仲預(yù)處理后，可降低腦缺血大鼠的腦含水量，且具有一定的量效關(guān)系。臨床研究表明缺血性腦卒中患者常存在包括記憶紊亂在內(nèi)的認(rèn)識(shí)障礙、精神運(yùn)動(dòng)速度和執(zhí)行功能下降[10-11]，有研究指出腦缺血后神經(jīng)認(rèn)知功能的障礙與海馬受損神經(jīng)元的數(shù)目有密切關(guān)聯(lián)[12-13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組大鼠逃避潛伏期及活動(dòng)總路程明顯延長(zhǎng)，穿越平臺(tái)次數(shù)明顯減少，平臺(tái)所在停留時(shí)間明顯縮短，給予杜仲預(yù)處理后，大鼠逃避潛伏期及活動(dòng)總路程降低，穿越平臺(tái)次數(shù)增加，平臺(tái)所在停留時(shí)間延長(zhǎng)，且高劑量效果明顯，具有一定的量效關(guān)系，說(shuō)明杜仲可明顯改善CIRI大鼠的認(rèn)知能力。

針對(duì)劑量的選擇，我們通過(guò)藥理實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物與人體間的等效劑量的換算，再聯(lián)合藥物及動(dòng)物本身特性并參考相應(yīng)文獻(xiàn)在發(fā)揮藥效的基礎(chǔ)上逐漸規(guī)律性加大劑量范圍，以此探討并提出一個(gè)“最佳”劑量[14]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示8 g/kg杜仲預(yù)處理可明顯改善腦缺血大鼠的神經(jīng)功能評(píng)分、降低大腦含水量及改善學(xué)習(xí)記憶能力。

杜仲對(duì)CIRI大鼠具有一定的保護(hù)作用，能降低腦缺血大鼠神經(jīng)功能障礙、降低大腦含水量、改善學(xué)習(xí)記憶能力，且存在一定的量效關(guān)系，8 g/kg杜仲預(yù)處理效果最佳。但杜仲藥理成分復(fù)雜，到底何種有效成分發(fā)揮作用,其具體的機(jī)制是什么,都需進(jìn)一步深入研究。