白雪，杜井峰

廣東省深圳市深圳大學(xué)總醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東深圳518000

結(jié)腸癌是常發(fā)于直腸與乙狀結(jié)腸交接處的消化道惡性腫瘤，以中老年患者居多，雖有研究報(bào)道，家族遺傳、環(huán)境因素和生活習(xí)慣在一定程度上會(huì)影響腸胃健康，甚至導(dǎo)致消化道疾病，但是結(jié)腸癌具體的發(fā)病機(jī)制尚未明確[1-2]。抑癌基因是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞增長(zhǎng)分化、維持機(jī)體細(xì)胞穩(wěn)定的、可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的基因，這類基因的突變、失活或缺失時(shí)會(huì)引起其內(nèi)啟動(dòng)子區(qū)域高甲基化，抑癌功能喪失會(huì)引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化導(dǎo)致腫瘤[3]。B細(xì)胞白血病/淋巴瘤6B（B-cell leukemia/lymphoma 6 member B,BCL6B）基因，位于17號(hào)染色體p13.1上，作為B細(xì)胞白血病/淋巴瘤6（B-cell leukemia/lymphoma 6,BCL6）家族一員具有抑制轉(zhuǎn)錄功能[3-4]。然而目前雖有研究報(bào)道稱，BCL6與胃癌的生長(zhǎng)及其預(yù)后相關(guān)，但其對(duì)結(jié)腸癌患者的作用機(jī)制尚未明確[4]。故此，該研究方便選取2018年6月—2020年6月56例在該院接受治療的結(jié)腸癌患者進(jìn)行分析，旨在探討結(jié)腸癌患者BCL6B基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化情況，研究結(jié)腸癌發(fā)生及發(fā)展機(jī)制，以期為臨床預(yù)防結(jié)腸癌發(fā)病及其治療提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選取在該院接受治療的56例結(jié)腸癌患者，以其術(shù)后切除的癌組織和配對(duì)的癌旁組織為標(biāo)本進(jìn)行研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查確診為結(jié)腸癌[5]；②男性34例，女性22例；③年齡44～80歲，平均（58.41±9.28）歲；④按TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期24例，Ⅲ、Ⅳ期32例；⑤有轉(zhuǎn)移33例，無轉(zhuǎn)移23例；⑥分化程度：高分化18例，中、低分化38例。排除標(biāo)準(zhǔn)：①已經(jīng)或正在接受放化療者；②伴有其他臟器合并癥者；③精神障礙或其他不能配合治療的情況者。同時(shí)期選取同數(shù)量在該院做健康體檢的正常人，選取其腸鏡活檢的正常結(jié)腸黏膜組織對(duì)照研究。該研究符合醫(yī)學(xué)倫理，患者及家屬知情并同意。

1.2 方法

檢測(cè)所用試劑購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）試劑和石蠟包埋組織DNA提取試劑盒，以及深圳華大基因有限公司的去甲基化引物。BCL6B基因非甲基化引物序列為5'-TTTTGTTTTGG ATTTGTTATTTGGAGAGT-3'(上游)和5'-CTTAACCTCAACTCCTTTATCTAACCA-3'（下游）；甲基化引物序列為5'-CGTTTTGGATTCGTTATTTGGAGAGC-3'（上游）和5'-CTTAACCTCAACTCCTTTATCTAACCA-3'（下游）。反應(yīng)條件:95℃預(yù)性5 min，95℃下40 s，60℃下45 s，72℃下40 s，共循環(huán)35個(gè)PCR，最后72℃退火5 min。每項(xiàng)檢測(cè)均設(shè)置陰性對(duì)照，甲基化引物擴(kuò)增出條帶為陽性，其余記為陰性[6]。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察結(jié)腸癌患者臨床指標(biāo)與BCL6B基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化關(guān)系；正常結(jié)腸組織、癌細(xì)胞組織與癌旁細(xì)胞組織BCL6B基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化情況（包括有無甲基化、甲基化陽性數(shù)量、甲基化率等）。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)數(shù)資料用[n(%)]表示，采用χ2檢驗(yàn)，事后經(jīng)Logistic回歸分析影響因素，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同患者BCL6B基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化率比較

結(jié)腸癌患者不同性別及年齡之間BCL6B基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；Ⅰ、Ⅱ期患者甲基化率（陽性）50.00%明顯低于Ⅲ、Ⅳ期患者甲基化率（陽性）81.25%；高分化患者甲基化率44.44%明顯低于中、低分化患者甲基化率78.95%；有發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移患者的甲基化率78.79%（陽性）84.85%明顯高于無淋巴轉(zhuǎn)移患者的甲基化率（陽性）43.48%，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 不同患者BCL6B甲基化率比較[n(%)]

2.2 Logistic二次元分析影響B(tài)CL6B基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的因素

通過Logistic進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示，TNM分期、分化程度以及有無轉(zhuǎn)移均為BCL6B基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化率的獨(dú)立影響因素（P＜0.05），見表2。

表2 Logistic二次元分析影響B(tài)CL6B基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化的因素

2.3 正常結(jié)腸組織、結(jié)腸癌細(xì)胞系和結(jié)腸癌組織的BCL6B基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀況比較

經(jīng)PCR檢測(cè)，相關(guān)指標(biāo)解讀為只能擴(kuò)增出甲基化條帶的陽性對(duì)照（IVD），正常人外周血淋巴細(xì)胞陰性對(duì)照（NL），滅菌雙蒸水的空白對(duì)照（H2O），非甲基化條帶（U），甲基化條帶（M）。檢測(cè)結(jié)果如下：圖1a所示正常結(jié)腸組織的BCL6B未發(fā)現(xiàn)甲基化狀況；圖1b表示結(jié)腸癌細(xì)胞系甲基化狀況，其中RKO、HT29為完全甲基化；圖1c表示選取的56例結(jié)腸癌患者中BCL6B基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化38例，甲基化率67.86%，見圖1。

圖1 不同組織的BCL6B甲基化狀況

3 討論

結(jié)腸癌在我國(guó)惡性腫瘤榜高居不下，近年來，盡管經(jīng)濟(jì)條件、生活水平不斷提高，但我國(guó)結(jié)腸癌的發(fā)病率未見改善。隨著醫(yī)的進(jìn)步，雖然對(duì)于結(jié)腸癌的治療效果有一定提高，但是目前臨床對(duì)結(jié)腸癌的具體發(fā)病機(jī)制仍未明確，因此，探究與其發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子標(biāo)志物，對(duì)于結(jié)腸癌的治療具有重要意義[4,7]。

近年來，隨著研究的推進(jìn)，表觀遺傳學(xué)在基因相關(guān)調(diào)控中的作用愈發(fā)重要[8]。有研究表明，腫瘤細(xì)胞基因異常甲基化與患者的性別、年齡、TNM分期、分化程度及有無轉(zhuǎn)移等指標(biāo)相關(guān)[9-10]。該研究表明，結(jié)腸癌組織BCL6B基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化率在TNM分期、分化程度及有無轉(zhuǎn)移指標(biāo)中相關(guān)；但與患者性別、年齡無關(guān)；且經(jīng)Logistic回歸二次分析可知，TNM分期、分化程度以及有無淋巴轉(zhuǎn)移均可作為BCL6B基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化率的獨(dú)立影響因素，這與鄒庚藝、陳笑等[9-10]觀點(diǎn)一致。

惡性腫瘤由于多種因素導(dǎo)致局部組織的細(xì)胞在基因水平上失去了正常調(diào)控，BCL6B基因與BCL6基因?qū)儆谕葱约?xì)胞族群，其甲基化修飾是抑癌基因失活的一種表現(xiàn)[11-12]。該研究結(jié)果顯示，未在正常結(jié)腸組織中發(fā)現(xiàn)BCL6B基因甲基化，而結(jié)腸癌細(xì)胞系內(nèi)BCL6B基因甲基化率為67.86%，經(jīng)去甲基化藥物處理后BCL6B表達(dá)上升，表明結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)BCL6B啟動(dòng)子區(qū)域存在異常高甲基化狀況。堵一喬等[12]認(rèn)為BCL6B基因甲基化可作為輔助診斷CRC的較好指標(biāo)，且明顯可知健康人甲基化敏感度低至10%，而CRC患者甲基化率高達(dá)70%～100%，由此可明確，細(xì)胞BCL6B基因甲基化異常升高與是否罹患結(jié)腸癌，以及結(jié)腸癌嚴(yán)重程度息息相關(guān)。

綜上所述，結(jié)腸癌的發(fā)生及發(fā)展與BCL6B基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化密切相關(guān)，BCL6B基因在結(jié)腸癌呈高甲基化，臨床TNM分期過高、高分化及有淋巴轉(zhuǎn)移均可影響甲基化，可為臨床診治結(jié)腸癌提供參考。但是該研究樣本量較少，還需多角度多方面取樣，進(jìn)一步進(jìn)行研討。