韓昊洋，丁濤，董俊升，崔璐瑩，孟霞，李建基，朱國強(qiáng)，王亨*

(1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2. 教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009；3. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

硒作為動(dòng)物體內(nèi)一種必需的微量元素，在抗氧化防御、抵抗炎癥反應(yīng)、甲狀腺激素活化、DNA合成、生育和生殖等生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用[1-2]。機(jī)體內(nèi)硒的主要來源是通過飲食獲取，并由小腸吸收進(jìn)入血液，其中以十二指腸及空腸的吸收率最高[3]。目前，畜禽飼料中主要以無機(jī)硒(亞硒酸鈉)和有機(jī)硒(蛋氨酸硒)兩種形式添加。無機(jī)硒用于飼料添加時(shí)，與有機(jī)硒相比，效率低，潛在毒性高[4]。高羊毛氨酸硒(selenohomolanthionine, SeHLan)是在日本辛辣蘿卜中發(fā)現(xiàn)的新型含硒氨基酸，與蛋氨酸硒相比，其代謝途徑更直接，主要參與硒蛋白的合成，生物利用率高，毒性低[5]。新生胎兒的硒水平與母體的硒攝取量密切相關(guān)。在妊娠期，硒經(jīng)血液循環(huán)，透過胎盤屏障供給胎兒；哺乳期，硒經(jīng)乳汁轉(zhuǎn)移到幼兒[6]。新生胎兒腸道是生長發(fā)育所必需營養(yǎng)物質(zhì)的重要攝取場所，因其發(fā)育不全，易受氧化物和自由基的攻擊，引起腸功能障礙，導(dǎo)致代謝紊亂，影響動(dòng)物體生長和發(fā)育[7]。硒作為多種硒蛋白的主要組成，能清除動(dòng)物體內(nèi)代謝產(chǎn)生的氧自由基，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)新生胎兒正常的生長發(fā)育。日糧中，添加0.15 mg/kg的硒，是能滿足大鼠正常生理狀態(tài)的攝入量，并且進(jìn)行超高劑量硒的大鼠毒性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，超過5 mg/kg的日糧硒會(huì)產(chǎn)生毒性作用[8]。本試驗(yàn)通過飼喂無硒基礎(chǔ)飼料，并通過在孕鼠飲水中分別添加0.03、0.15和1.5 mg/kg的高羊毛氨酸硒補(bǔ)充日糧硒，探討其對新生乳鼠十二指腸和空腸抗氧化能力的影響，為高羊毛氨酸硒在畜禽養(yǎng)殖和寵物飼養(yǎng)中的應(yīng)用提供理論研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

高羊毛氨酸硒購自英聯(lián)貿(mào)易(上海)有限公司，無硒基礎(chǔ)飼料購于常州鼠一鼠二生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取10周齡Wistar孕鼠18只(購自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心)，隨機(jī)分成3組(n=6)，即缺硒組、正常硒對照組和富硒組，統(tǒng)一飼喂無硒基礎(chǔ)飼料，并在飲水中分別添加0.03、0.15和1.5 mg/kg的高羊毛氨酸硒。

孕鼠均單獨(dú)飼養(yǎng)于籠中，環(huán)境溫度(22±1)℃、濕度(60±5)%，晚上7點(diǎn)至早上7點(diǎn)進(jìn)行12 h的明暗循環(huán)，自由采食、飲水。

1.3 主要試劑

總抗氧化能力(T-AOC)測試盒(貨號(hào):A015)，過氧化氫酶(CAT)測試盒(貨號(hào):A007-1)，總超氧化物歧化酶(T-SOD)測試盒(貨號(hào):A001-1)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測試盒(貨號(hào):A005)和丙二醛(MDA)測試盒(貨號(hào):A003-1)均購自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

每只孕鼠自然分娩4 d后，分別選取4只乳鼠，每組共計(jì)24只乳鼠，測定新生乳鼠體重后，對其實(shí)施安樂死，分離胸腺及脾臟，稱重并計(jì)算臟器指數(shù)。取新生乳鼠的十二指腸及空腸 -20 ℃保存，用于檢測組織中T-AOC、GSH-Px、CAT、T-SOD和MDA 。臟器指數(shù)=臟器重量/體重。

將取自同只孕鼠分娩的新生乳鼠的十二指腸樣本，兩兩混合成一個(gè)樣本，每只孕鼠可采集2個(gè)乳鼠的混合十二指腸樣本，每組共計(jì)12個(gè)乳鼠十二指腸樣本。同樣的方法，收集乳鼠空腸樣本。取0.1 g左右十二指腸或空腸樣品，放入2 mL的離心管，并按1∶9的質(zhì)量體積比，加入4 ℃生理鹽水制成10%組織勻漿，將勻漿以4 ℃，3 500 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，吸上清液，按試劑盒說明書進(jìn)行抗氧化相關(guān)指標(biāo)的檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng) SPSS Statistics 25.0處理，進(jìn)行單因素方差A(yù)NOVA統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 孕鼠補(bǔ)SeHLan對新生乳鼠體重的影響

由圖1可見，分娩后第4天，對每組24只乳鼠，共計(jì)72只乳鼠進(jìn)行體重檢測，發(fā)現(xiàn)3組間體重差異不顯著(P>0.05)。

圖1 孕鼠補(bǔ)SeHLan對分娩后第4天乳鼠體重的影響

2.2 孕鼠補(bǔ)SeHLan對新生乳鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響

由圖2可見，取出生第4天的乳鼠脾臟和胸腺進(jìn)行臟器指數(shù)檢測，缺硒組新生乳鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均極顯著低于正常硒對照組(P<0.01)；富硒組新生乳鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著高于正常硒對照組(P<0.05)。

與對照組相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下同

2.3 孕鼠補(bǔ)SeHLan對新生乳鼠十二指腸抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

由圖3、圖4可見，與正常硒對照組相比, 缺硒組新生乳鼠十二指腸的CAT、GSH-Px活性和T-AOC均出現(xiàn)顯著降低(P<0.05)，且MDA含量極顯著升高(P<0.01)；富硒組新生乳鼠十二指腸的GSH-Px和T-AOC活性均顯著升高(P<0.05)，CAT活性極顯著升高(P<0.01)，且MDA含量顯著降低(P<0.05)。各組間T-SOD活性隨補(bǔ)硒劑量增加而升高，但差異不顯著(P>0.05)。

圖3 孕鼠補(bǔ)SeHLan對新生乳鼠十二指腸抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

圖4 孕鼠補(bǔ)SeHLan對新生乳鼠十二指腸MDA含量的影響

2.4 孕鼠補(bǔ)SeHLan對新生乳鼠空腸抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

由圖5和圖6可見，與正常硒對照組相比，缺硒組新生乳鼠空腸內(nèi)的CAT、GSH-Px活性和T-AOC均顯著降低(P<0.05)，且MDA含量極顯著升高(P<0.01)；富硒組新生乳鼠空腸內(nèi)的CAT、GSH-Px和T-AOC活性均顯著升高(P<0.05)。各組間T-SOD活性隨補(bǔ)硒劑量增加而升高，但差異不顯著(P>0.05)。

圖5 孕鼠補(bǔ)SeHLan對新生乳鼠空腸抗氧化相關(guān)指標(biāo)的影響

圖6 孕鼠補(bǔ)SeHLan對新生乳鼠空腸MDA含量的影響

3 討論

3.1 孕鼠補(bǔ)SeHLan對新生乳鼠體重和臟器指數(shù)的影響

硒是機(jī)體生長發(fā)育所必需的微量營養(yǎng)元素，可通過硒蛋白發(fā)揮其功能。妊娠期硒的缺乏會(huì)增加包括胎兒生長受限在內(nèi)的妊娠并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)[9]。富硒日糧可改善機(jī)體硒的水平，維持母體的生育能力及胎兒的正常發(fā)育，減弱妊娠應(yīng)激造成的不利影響[10]。動(dòng)物免疫器官是淋巴細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞發(fā)育、分化、成熟、增殖并產(chǎn)生免疫反應(yīng)的地方。研究表明，硒能促進(jìn)體外培養(yǎng)的小鼠脾細(xì)胞增殖以及白細(xì)胞介素-4(interleukin 4，IL-4)和γ-干擾素(interferon γ，IFN-γ)的產(chǎn)生，增強(qiáng)細(xì)胞免疫和體液免疫[11-13]。Peng等[14]用低硒日糧飼喂雛雞21 d后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測胸腺細(xì)胞周期，發(fā)現(xiàn)胸腺細(xì)胞G0/G1期阻滯，且細(xì)胞凋亡增多，缺硒抑制了胸腺的發(fā)育。Fredericks等[15]研究證實(shí)，在硒蛋白K缺陷型小鼠中，T細(xì)胞增殖減少，中性粒細(xì)胞遷移減緩，巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出過度的氧化應(yīng)激。胸腺是中樞免疫器官，幼年時(shí)逐漸發(fā)育，性成熟后逐漸退化；脾臟是外周免疫器官，終生存在。胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)在一定程度上能反映機(jī)體的非特異性免疫狀態(tài)。王亨等[16]報(bào)道，妊娠期補(bǔ)充亞硒酸鈉可顯著提高新生乳鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。本試驗(yàn)在母鼠妊娠期補(bǔ)充不同劑量的SeHLan，發(fā)現(xiàn)SeHLan顯著提高胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，提示妊娠期母鼠補(bǔ)充的SeHLan能經(jīng)血液或乳汁作用于新生乳鼠，增強(qiáng)新生乳鼠的非特異性免疫。Meyer等[17]研究發(fā)現(xiàn)，妊娠期母羊缺硒會(huì)導(dǎo)致新生羔羊體重降低。本試驗(yàn)對新生乳鼠的體重也進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，但發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充SeHLan對新生乳鼠的體重沒有顯著影響，這可能與鼠的妊娠期短、產(chǎn)仔數(shù)多以及種屬差異有關(guān)。

3.2 孕鼠補(bǔ)SeHLan對新生乳鼠十二指腸及空腸抗氧化能力的影響

腸道不僅是阻止細(xì)菌及毒素等有害物質(zhì)侵入機(jī)體的重要屏障，也是產(chǎn)生炎癥介質(zhì)以及調(diào)節(jié)機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)的重要器官[18]。腸道氧化應(yīng)激的重要損傷機(jī)制是氧自由基水平升高引起DNA損傷、線粒體損傷、蛋白質(zhì)變性、脂質(zhì)過氧化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常、能量代謝紊亂和腸道細(xì)胞凋亡，進(jìn)而導(dǎo)致腸黏膜結(jié)構(gòu)破壞，影響吸收功能，造成相關(guān)疾病[19]。谷胱甘肽過氧化物酶、硒蛋白P和硒蛋白S等在腸道中發(fā)揮著重要的氧化還原調(diào)節(jié)、抗氧化及抗炎作用[20]，促進(jìn)腸道穩(wěn)態(tài)。新生兒腸道發(fā)育不全，生理機(jī)能發(fā)育不成熟，會(huì)顯著影響新生兒的營養(yǎng)吸收，導(dǎo)致代謝異常、生長受限，并引發(fā)胃腸道疾病[7]。Salman等[21]在奶牛妊娠期與哺乳期添加相同劑量無機(jī)硒與有機(jī)硒后，發(fā)現(xiàn)相比較于無機(jī)硒，有機(jī)硒更有效地提高了牛乳中的硒水平，且牛初乳中的硒含量最高，而后逐漸降低。本試驗(yàn)結(jié)果表明妊娠期的孕鼠補(bǔ)充SeHLan，能提高新生乳鼠十二指腸和空腸的抗氧化能力，減弱其氧化損傷程度。這可能是SeHLan通過胎盤和乳汁作用于新生乳鼠，提高了乳鼠血液和腸道內(nèi)硒和硒蛋白的含量，增強(qiáng)了乳鼠腸道抵御氧化損傷的能力。本試驗(yàn)中，乳鼠十二指腸和空腸中T-SOD活性隨孕鼠補(bǔ)硒劑量的增加而呈升高趨勢，但無顯著性，這可能與硒不是超氧化物歧化酶的活性中心有關(guān)。

綜上所述，在本研究中，孕鼠補(bǔ)SeHLan提高了新生乳鼠先天非特性免疫力以及十二指腸和空腸的抗氧化能力。該試驗(yàn)結(jié)果表明，妊娠期母畜通過在日糧中添加SeHLan可增強(qiáng)新生動(dòng)物先天免疫力及腸道抗氧化能力。