劉海姣，廖音娟，唐智（.長沙市第四醫(yī)院，長沙 40006；2.長沙都正生物科技有限責(zé)任公司，長沙 40000）

諾氟沙星是一種廣譜抗菌劑，已在多個國家使用，可有效治療人類和動物的感染，用于治療尿路感染、呼吸道感染、胃腸道感染、傷口感染等[1-5]。目前，有研究報道了海水、生物體液、食物以及人血漿中諾氟沙星的測定方法[4，6-8]，常用的技術(shù)有紫外或熒光檢測的高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、分光光度法、薄層色譜法、微生物法等[9]。Maia 等[10]使用基于HLB 柱的固相萃?。⊿PE）進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）定量污水中7 種不同的氟喹諾酮類抗菌藥物，Ziarrusta 等[11]使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定魚組織、生物體液和環(huán)境水中的氟喹諾酮類藥物。Helmy 等[12]用高效液相測定血漿中諾氟沙星的含量，Amjadi 等[13]使用硅摻雜碳點、鐵（Ⅱ）和K2S2O8組成的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)測定人血漿中的諾氟沙星，有研究采用LC-MS/MS 法并使用環(huán)丙沙星作為內(nèi)標(biāo)定量測定人血漿中諾氟沙星的濃度[14]，也有報道采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS）法測定血漿中諾氟沙星的濃度[15]，但所需分析時間普遍較長（4 min 以上），未完善對方法學(xué)的考察，如未進(jìn)行樣品溶血基質(zhì)效應(yīng)、高血脂基質(zhì)效應(yīng)及全血穩(wěn)定性的考察，這些因素均可影響到樣本測試結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。因此建立一種準(zhǔn)確、可靠的檢測人血漿樣品中諾氟沙星濃度的分析方法至關(guān)重要。

本試驗采用UPLC-MS/MS 法，以同位素為內(nèi)標(biāo)測定人血漿樣品中諾氟沙星的濃度，檢測過程更加簡單、快速，極大地縮減了分析時間和項目實施成本，可以更好地應(yīng)用于諾氟沙星人體生物等效性研究。

1 材料

1.1 儀器

UPLC I-Class、Xevo TQD 質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源，UNIFI 數(shù)據(jù)處理軟件（美國Waters 公司）；MSA6.6S-CE 電子天平（Sartorius 公司）；MilliQ Direct 8 超純水儀（Merck Millipore公司）；ST16R 離心機(jī)（Thermo Fisher Thermo 公司）；Pipetman NEO 和Pipet-Lite XLS＋移液器（Gilson 和RAININ 公司）；XW-80A 渦旋混合器（寧波新芝）；Talboys 數(shù)顯多管式渦旋震蕩器（Troemner 公司）；DTA-27 超聲波清洗器（鼎泰恒盛）；GZX-9140MBE 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅）；MLTS1368 醫(yī)用低溫冰箱（Thermo 公司）。

1.2 試藥

諾氟沙星（中國食品藥品檢定研究院，批號：13450-201206，純度：99.5%）；內(nèi)標(biāo)諾氟沙星-d8（批號：12-ZCA-49-4，純度：97%，TRC）。甲醇、乙腈（色譜純，Merck 公司）；甲酸（FA，色譜純，ACS）；水為試驗室超純水儀自制水。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流動相：0.2%甲酸水-乙腈＝85∶15（V/V）；流速：0.4 mL·min－1；運(yùn)行時間：1.5 min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：40 ℃；自動進(jìn)樣器溫度：20 ℃。

2.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源（ESI），正離子模式，MRM 監(jiān)測，離子源溫度為150℃，毛細(xì)管電壓為0.5 kV，脫溶劑氣流為1000 L·h－1，溫度為500℃，諾氟沙星與內(nèi)標(biāo)諾氟沙星-d8 的離子對分別為m/z320.11 →m/z276.13 和m/z328.17 →m/z284.20。其中諾氟沙星的錐孔電壓為40 V，碰撞能為14 eV，駐留時間為0.08 s；諾氟沙星-d8 錐孔電壓為40 V，碰撞能為16 eV，駐留時間為0.08 s。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)工作液及質(zhì)控工作液的配制

精密稱取諾氟沙星對照品和諾氟沙星-d8 對照品適量（經(jīng)折算），分別用50%甲醇水（含0.1%FA）溶解并定容至25 mL，搖勻，即得諾氟沙星儲備液和諾氟沙星-d8 儲備液。取諾氟沙星儲備液適量，用50%甲醇水（0.1%FA）稀釋，得含諾氟沙星質(zhì)量濃度分別為16 000、8000、4000、2000、1000、800、400、200 ng·mL－1的系列濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液，12 800、6000、1600、600 ng·mL－1的系列濃度質(zhì)控工作液及質(zhì)量濃度為200 ng·mL－1的定量下限工作液。取內(nèi)標(biāo)諾氟沙星-d8 對照品儲備液，用50%甲醇水（含0.1%FA）稀釋，得質(zhì)量濃度為10 μg·mL－1的內(nèi)標(biāo)溶液，取適量內(nèi)標(biāo)溶液用甲醇稀釋（內(nèi)標(biāo)溶液∶甲醇＝3∶1000），得諾氟沙星-d8 質(zhì)量濃度為30 ng·mL－1的內(nèi)標(biāo)工作液，同時也是蛋白沉淀劑。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品及質(zhì)控樣品配制

精密吸取人空白血漿190 μL，加入系列質(zhì)量濃度工作液（16 000、8000、4000、2000、1000、800、400、200 ng·mL－1）或質(zhì)控工作液 （12 800、6000、1600、600 ng·mL－1） 10 μL， 渦旋混勻，得到線性范圍濃度為10～800 ng·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以及濃度為30（LQC）、80（MQC）、300（HMQC）、640（HQC）ng·mL－1的質(zhì)控樣品。

2.5 生物樣品處理方法

2.5.1 空白血漿樣品 精密吸取血漿樣品200 μL，加入甲醇400 μL，振蕩30 s，離心（18 400×g，8 min），取上清液100 μL，加稀釋劑（0.2%FA 水）400 μL，振蕩30 s 即得。

2.5.2 零濃度血漿樣品 精密吸取空白血漿200μL，加入400 μL 內(nèi)標(biāo)工作液，振蕩30 s，其余操作同“2.5.1”項下。

2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品200μL，加入400 μL 內(nèi)標(biāo)工作液，振蕩30 s，其余操作同“2.5.1”項下。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 專屬性 取空白血漿樣品、定量下限（LLOQ）濃度水平的樣品、只含內(nèi)標(biāo)的樣品以及只含待測物的定量上限（ULOQ）濃度水平的樣品?？疾靸?nèi)源性物質(zhì)及內(nèi)標(biāo)是否存在干擾。空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不對待測物與內(nèi)標(biāo)產(chǎn)生干擾；待測物與內(nèi)標(biāo)之間互相不產(chǎn)生干擾。結(jié)果見圖1。

圖1 人血漿中諾氟沙星和諾氟沙星-d8 的典型色譜圖Fig 1 Typical chromatogram of norfloxacin and norfloxacin-d8 in human plasma

2.6.2 殘留考察 按定量上限樣品、空白樣品、定量下限樣品的順序進(jìn)樣，記錄待測物與內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積值，考察殘留情況。待測物進(jìn)樣殘留小于20%且內(nèi)標(biāo)的進(jìn)樣殘留小于5%。表明以本方法測試高濃度諾氟沙星人血漿樣品后，在系統(tǒng)中的殘留對于后續(xù)低濃度樣品的測試無影響。

2.6.3 線性范圍與定量下限考察 配制標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿系列濃度樣品，按“2.5”項下方法處理，進(jìn)樣分析，記錄待測物與內(nèi)標(biāo)的色譜峰峰面積值，以諾氟沙星與內(nèi)標(biāo)的色譜峰峰面積比值（Y）為縱坐標(biāo)，以系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

結(jié)果諾氟沙星在10～800 ng·mL－1與測定值線性關(guān)系良好，定量下限為10 ng·mL－1，回歸方程為y＝0.0227x－0.0037，r2＝0.9995。

2.6.4 精密度與準(zhǔn)確度 配制質(zhì)量濃度為10、30、80、300、640 ng·mL－1的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品各6 份，按“2.5”項下方法處理后進(jìn)樣測定，計算各樣品濃度，計算批內(nèi)和批間的精密度，結(jié)果見表1。

表1 人血漿樣本中諾氟沙星的批內(nèi)、批間精密度(x±s，n ＝6)Tab 1 Intra- and inter-batch precision of norfloxacin in human plasma (x±s，n ＝6)

2.6.5 提取回收率 取6 份不同來源的空白血漿190 μL，每個來源平行2 份，加入甲醇400 μL，振蕩30 s，離心（18 400×g，8 min），得到6 份基質(zhì)上清液，用0.2%FA 水配制含諾氟沙星低、中、高質(zhì)量濃度溶液2.5、6.667、53.333（ng·mL－1）、和內(nèi)標(biāo)（5 ng·mL－1）。振蕩30 s，混勻，進(jìn)樣10 μL，記錄待測物諾氟沙星與內(nèi)標(biāo)諾氟沙星-d8 的色譜峰峰面積值。

諾氟沙星質(zhì)控樣品低、中、高濃度的回收率分別為82.7%，86.0%、82.7%，總體變異系數(shù)（CV）為2.30%。內(nèi)標(biāo)平均回收率為81.6%。

2.6.6 基質(zhì)效應(yīng) 取6 份不同來源的空白血漿190 μL，加入10 μL 50%甲醇水（0.1%FA）溶液，再加入甲醇400 μL，振蕩30 s，離心（18 400×g，8 min），得6 份不同來源空白基質(zhì)上清液備用。按空白血漿方式同樣處理可得溶血基質(zhì)上清、高脂基質(zhì)上清。

移取空白基質(zhì)上清100 μL，加入諾氟沙星低、中、高濃度溶液400 μL，振蕩30 s，混勻，即得基質(zhì)效應(yīng)考察樣本。按照空白血漿方式同樣處理可得溶血血漿、高脂血漿基質(zhì)效應(yīng)考察樣本。

取67%甲醇水溶液100 μL，加入諾氟沙星低、中、高濃度溶液400 μL，振蕩30 s，混勻，即得基質(zhì)效應(yīng)參比樣本。

人空白血漿、溶血血漿、高脂血漿均無明顯基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果見表2。

表2 人血漿中諾氟沙星基質(zhì)效應(yīng)(x±s，n ＝6)Tab 2 Matrix effect of norfloxacin in human plasma ( ±s，n ＝6)

表2 人血漿中諾氟沙星基質(zhì)效應(yīng)(x±s，n ＝6)Tab 2 Matrix effect of norfloxacin in human plasma ( ±s，n ＝6)

諾氟沙星濃度/（ng·mL－1）空白血漿空白溶血血漿高脂血漿內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子CV/%內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子CV/%內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子CV/%30.001.07±0.021.870.99±0.055.051.00±0.066.00 80.001.04±0.032.880.97±0.022.060.98±0.033.06 640.001.11±0.032.700.98±0.033.061.01±0.021.98

2.6.7 穩(wěn)定性 對樣品采集、樣品儲存及分析過程中所涉及到的穩(wěn)定性條件進(jìn)行考察，結(jié)果見表3。

表3 諾氟沙星不同條件下的穩(wěn)定性Tab 3 Stability test of norfloxacin under different conditons

2.6.8 稀釋方法學(xué)驗證 配制質(zhì)量濃度為1600 ng·mL－1的諾氟沙星血漿樣品，用空白血漿稀釋10倍，平行處理6份，考察血漿樣品的稀釋可靠性。結(jié)果平均準(zhǔn)確度偏差為－4.95%，精密度為2.1%。

2.6.9 分析批容量考察 配制標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品及低、中、高濃度質(zhì)控樣品，按照“2.5”項下血漿樣品處理方法處理后進(jìn)樣分析，分析批進(jìn)樣數(shù)量作為分析批容量考察結(jié)果。結(jié)果表明，分析批中可以連續(xù)進(jìn)樣至少180 個未知樣本。

2.7 測定方法在生物等效性（BE）研究中的應(yīng)用

2.7.1 給藥方案與血樣采集 本研究經(jīng)湖南省腦科醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)（編號為2017010）。在一項單中心、隨機(jī)、開放、2×2 交叉設(shè)計的諾氟沙星BE 研究，入組8 例受試者且所有受試者均完成兩周期研究，洗脫期為7 d。受試者在早餐后單次口服受試制劑100 mg（1 片）或參比制劑100 mg（1 片），240 mL 常溫水送服。在給藥前（0 h）以及給藥后 0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、2、3、4、5、6、8、10、12、24 h 進(jìn)行血樣采集。血樣采集后置于已編號的肝素鈉抗凝負(fù)壓管內(nèi)，輕柔顛倒混勻，4℃離心10 min（3500 r·min－1）后分離得血漿樣品，－80℃冰箱保存待測。

取受試者血漿樣本按“2.5.3”項下方法處理后進(jìn)行測定，記錄待測物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)的峰面積，代入回歸方程，計算血藥濃度。

2.7.2 數(shù)據(jù)分析 血藥濃度數(shù)據(jù)采用Phoenix WinNonlin 軟件（Pharsight Corporation）進(jìn)行非房室模型藥代動力學(xué)參數(shù)的估算分析，計算主要藥代動力學(xué)參數(shù)，以全面反映藥物在人體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄的特點。

2.7.3 健康受試者的藥代動力學(xué)研究 8 名受試者單劑量口服諾氟沙星受試制劑及參比制劑后血漿中諾氟沙星平均藥濃度-時間曲線見圖2；主要藥代動力學(xué)參數(shù)見表4。AUC0～t和AUC0～∞指標(biāo)均提示受試制劑與參比制劑生物等效。Cmax指標(biāo)結(jié)果提示尚不能拒絕生物不等效，因本試驗設(shè)計密集采血點為0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5 h，實際結(jié)果受試制劑tmax中位值為2.25 h，Q1～Q3 為1.5～3 h；參比制劑tmax中位值為3 h，Q1～Q3 為2～3.5 h，密集采血時間早于受試制劑和參比制劑tmax、Cmax相關(guān)數(shù)據(jù)可能非真實值。本次為預(yù)試驗，樣本量較小，因此Cmax相關(guān)數(shù)據(jù)需要進(jìn)一步驗證。

表4 8 名受試者單劑量口服諾氟沙星的主要藥代動力學(xué)參數(shù)(x±s)Tab 4 Main pharmacokinetic parameters of norfloxacin in 8 healthy volunteers after a single oral dose (x±s)

圖2 受試者口服受試制劑和參比制劑后血漿諾氟沙星平均血藥濃度-時間曲線（n ＝8）Fig 2 Mean plasma concentration-time curve of norfloxacin in the test and reference preparations after the oral administration （n ＝8）

3 討論

3.1 配制溶液及色譜柱的選擇

本方法的關(guān)鍵點是根據(jù)諾氟沙星的結(jié)構(gòu)特點對其色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。諾氟沙星在水中溶解度較小[16]，《中國藥典》中也對其溶解性進(jìn)行了闡述，根據(jù)這些信息，本方法選擇50%甲醇水（含0.1%FA）溶液配制諾氟沙星溶液。此外，諾氟沙星屬于喹啉羧酸類化合物，同時含有羧基和氨基，其logP為0.82，表明該化合物極性較大，在常規(guī)的C18柱中保留較差[17]，所以在液相條件摸索過程中，選擇Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），該色譜柱完全耐受100%水相且對含有羧酸基團(tuán)的化合物有較好的保留。

3.2 流動相的選擇

本試驗過程中對流動相進(jìn)行了優(yōu)化，水相考察了不同比例甲酸水及緩沖鹽體系，通過對比，確定使用水相中含0.2%FA 最為適合。有機(jī)相分別用甲醇和乙腈進(jìn)行洗脫，經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn)使用乙腈作為有機(jī)相時，色譜峰峰寬更窄，且響應(yīng)更好。另外乙腈的洗脫能力比甲醇強(qiáng)，很好地避免了諾氟沙星在色譜柱中殘留。

3.3 質(zhì)譜條件的考察

本試驗采用正離子模式，在流動相中加入適量甲酸，有助于提高離子化效率，提高響應(yīng)，同時也能獲得較好的色譜峰，而負(fù)離子模式則響應(yīng)較低，與峰形不能同時兼顧，且文獻(xiàn)也多采用正離子模式[14-15，18]。

3.4 內(nèi)標(biāo)的選擇

本試驗采用同位素內(nèi)標(biāo)，其被廣泛用于化學(xué)和臨床分析中的定量分析[19-20]，同位素內(nèi)標(biāo)具有與分析物幾乎相同的物理化學(xué)性質(zhì)，在分析物信號波動和量的損失上的矯正作用更強(qiáng)，可以有效校正甚至消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。為保證待測物和內(nèi)標(biāo)之間不存在明顯干擾，本試驗對同位素內(nèi)標(biāo)和待測物之間的通道干擾進(jìn)行了考察，最終選定m/z320.11 →m/z276.13 和m/z328.17 →m/z284.20 分別作為諾氟沙星和內(nèi)標(biāo)的檢測離子對。

3.5 分析效率的優(yōu)化

本方法通過對色譜柱、流動相體系、前處理過程中稀釋劑的優(yōu)化，避免了殘留。得益于樣品前處理過程的優(yōu)化，使得本方法通過簡單的等度洗脫就可以實現(xiàn)很好的檢測結(jié)果，與采用梯度洗脫的方式相比，基線更平穩(wěn)，樣品保留時間更穩(wěn)定，也不容易出現(xiàn)殘留，而且對儀器的要求降低，即使單液相泵也可以正常運(yùn)行該方法，另外樣品之間不需要設(shè)置平衡時間來讓系統(tǒng)恢復(fù)到所需的流動相比例，可以極大地縮短進(jìn)樣時間，這對于樣品測定來說，相同時間內(nèi)可以檢測更多的樣品，明顯提升測定效率，顯著降低儀器占用成本和人工成本。本方法將分析時間縮短為1.5 min，極大地提高了分析效率，非常適合于大批量樣品的分析。

3.6 小結(jié)

本次方法學(xué)驗證嚴(yán)格按照國內(nèi)外法規(guī)要求進(jìn)行，驗證內(nèi)容完整且各項驗證內(nèi)容均符合驗證接受標(biāo)準(zhǔn)。尤其是近年來備受關(guān)注的溶血基質(zhì)效應(yīng)、高脂基質(zhì)效應(yīng)和全血穩(wěn)定性內(nèi)容，本方法均進(jìn)行了完整的考察，使得方法更加完善、可靠，且已用于諾氟沙星片人體BE 研究，樣品測試完成后還開展了試驗樣品再分析（ISR）測試，ISR 合格率為100%，表明該方法可以穩(wěn)定、可靠、可準(zhǔn)確地檢測人血漿樣品中諾氟沙星的濃度，為諾氟沙星BE 研究提供真實、可靠的血藥濃度數(shù)據(jù)。