朱勤鳳，聶莉，陳倩，雷丹丹，廖尚高，徐國波（貴州醫(yī)科大學藥學院，貴州 貴安新區(qū) 550025）

飛龍掌血Toddalia asiatica（L.）Lam.是蕓香科飛龍掌血屬植物，又名三百棒、大救駕、三文藤、牛麻簕，產(chǎn)自秦嶺南坡以南各地，全株用作草藥，多用其根[1]?！顿F州省中藥材民族藥材質(zhì)量標準》記載其具有袪風止痛、散瘀止血、消腫解毒等功效，主要用于治療風濕痹痛、胃痛、跌撲損傷等癥[2]。文獻報道該植物的化合物結(jié)構(gòu)類型包括香豆素類、生物堿類以及三萜類等[3]，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、止血、抗心血管疾病等藥理活性[4]。為促進飛龍掌血植物資源的綜合開發(fā)與利用，本實驗對采自貴州貴陽的飛龍掌血根開展深入的化學成分研究。

1 材料

1.1 儀器與試藥

Shimadzu UV-2401A 紫外可見分光光度儀（Shimadzu 公司，日本）；Bruker Tensor-27 傅里葉變換紅外光譜儀、Bruker AV-600 型超導(dǎo)核磁共振儀（Bruker 公司，德國）；LC3000 制備型高效液相色譜儀（北京創(chuàng)新通恒科技）；WB-2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；薄層色譜用硅膠（青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20 柱色譜凝膠（Pharmacia 公司，瑞典）；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB，杭州百思生物技術(shù)有限公司）；白假絲酵母菌（ATCC 5314，廣東省微生物保藏中心）；兩性霉素B（＞750 μg·mg－1，批號：J0602A，大連美侖生物技術(shù)有限公司）；所用試劑均為分析純或色譜純。

1.2 藥材

飛龍掌血藥材于2020年6月采集于貴陽市南明區(qū)，經(jīng)貴州醫(yī)科大學中藥民族藥標本館龍慶德副教授鑒定為蕓香科飛龍掌血屬植物飛龍掌血Toddalia asiatica，留樣標本（No.2020062301）保存于貴州醫(yī)科大學藥學院天然藥物化學教研室。

2 方法

2.1 化合物提取與分離

飛龍掌血干燥根4.0 kg 粉碎后經(jīng)95%乙醇（20 L×3）冷浸提取，提取液減壓濃縮得流浸膏580 g。流浸膏上樣于D101 大孔樹脂層析柱，40%～95%乙醇水梯度洗脫，洗脫液經(jīng)過TLC薄層色譜檢測，合并相似部分，得到7 個組分，分別為Fr.A～Fr.G。

Fr.D（72.0 g）放置后析出淡黃色針狀結(jié)晶，即得化合物2（17.3 g），其余部分用硅膠柱色譜分離，以石油醚-丙酮（9∶1，V/V）洗脫，得到16 個組分Fr.D1～Fr.D16。其中Fr.D12、Fr.D15 在乙酸乙酯-甲醇溶液中析出淡黃色結(jié)晶，用乙酸乙酯-甲醇（1∶1，V/V）反復(fù)洗滌，分別得到化合物10（30.9 mg）和化合物3（1.2 g）。剩余部分通過薄層色譜（TLC）分析后合并相似餾分，得到12 個組分（Fr.D1a～Fr.D12a）。Fr.D2a（0.110 g）經(jīng)硅膠柱層析、Sephadex LH-20 分離純化得到化合物8（3.2 mg）和化合物13（1.8 mg）。Fr.D3a（1.2 g）經(jīng)Sephadex LH-20 葡聚糖凝膠色譜分離得到化合物11（13.2 mg）。Fr.D4a 段經(jīng)Prep-HPLC 液相色譜制備得到化合物5 [4.9 mg，甲醇-水＝54∶46（V/V），tR＝32.5 min，流速3 mL·min－1]以及化合物1 [4.0 mg，甲醇-水＝70∶30（V/V），tR＝19.0 min，流速3 mL·min－1]。

Fr.E（14.602 g）經(jīng)硅膠柱層析石油醚-乙酸乙酯（5∶2，V/V）洗脫得到3 個組分Fr.E1～Fr.E3。Fr.E1（62.1 mg）經(jīng)硅膠柱色譜、葡聚糖凝膠柱色譜純化得到化合物6（6.2 mg）和化合物4（2.0 mg）。Fr.E3 經(jīng)Sephadex LH-20 分離得到化合物7（3.1 mg）和化合物9（2.3 mg）。Fr.E2 經(jīng)硅膠柱色譜用不同比例溶劑體系洗脫，得到5 個組分（Fr.E2-1～Fr.E2-5），F(xiàn)r.E2-3（50.4 mg）經(jīng)Prep-HPLC液相色譜制備[甲醇-水＝54∶46（V/V），tR＝32.0 min，流速 3 mL·min－1]分離得到化合物12（8.6 mg）（各化合物結(jié)構(gòu)見圖1）。

圖1 化合物1～13 的化學結(jié)構(gòu)Fig 1 Structure of compound 1～13

2.2 抗菌活性篩選

將受試菌于－80℃冰箱取出，用接種環(huán)挑取一環(huán)接種在沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）里，28℃培養(yǎng)24 h，麥氏比濁法后用無菌蒸餾水稀釋至最終濃度為（5～10）×105CFU·mL－1。采用96 孔板二倍稀釋法檢測單體化合物的最低抑菌濃度（MIC）值[5-6]，各單體化合物用0.02%DMSO無菌水溶液分別配制成256 μg·mL－1的儲備液，用無菌蒸餾水稀釋進行二倍稀釋，最終得到質(zhì)量濃度分別為256、128、64、32、16、8、4 μg·mL－1的樣品溶液。在96 孔板中分別加入100 μL 不同濃度的樣品溶液和100 μL 受試菌液，設(shè)置兩性霉素B 為陽性對照，0.02% DMSO 無菌水溶液為陰性對照和空白對照（無菌對照組），將接種好的菌株放在28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后記錄MIC值。在空白組無細菌生產(chǎn)的情況下，實驗孔內(nèi)完全抑制細菌生長的最低樣品濃度為該樣品對受試細菌的MIC值，各樣品每次實驗重復(fù)3 次。

3 結(jié)果

3.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：無色針狀晶體（甲醇）。UVλMeOHmax331，258，204 nm；IRνKBrmax1729，1602，1428，1171，1055 cm－1。HR-ESIMS 給出其準分子離子峰m/z289.1085[M-H]－（計算值為289.1081），確定其分子式為C16H18O5，不飽和度為8?；衔? 的1H-NMR（CD3OD，600 MHz）譜數(shù)據(jù)（見表1）顯示其有2 個甲氧基信號，δH4.07（3H，s，-OCH3），δH3.80（3H，s，-OCH3），2 個甲基信號δH1.70（3H，s，4'-CH3），δH1.79（3H，s，5'-CH3），1 對烯烴質(zhì)子信號δH7.88（1H，d，J＝9.7 Hz） 和δH6.21（1H，d，J＝9.7 Hz）；1 個活潑羥基信號δH6.33（1H，s）；1 個烯烴信號δH5.21（1H，m）和1 個亞甲基信號δH3.39（2H，d，J＝6.9 Hz）。 同時13C-NMR（CD3OD，150 MHz）結(jié)合HSQC 譜表明該化合物含有16 個碳，分別為1 個酯基（δC160.5），3 個烯碳（δC：139.7，121.8，112.1），2 個甲氧基（δC：63.6，62.0），2 個甲基（δC：25.9，18.0），1 個亞甲基（δC：23.2），7 個季碳（δC：151.2，151.1，145.5，132.8，130.5，118.5，107.2）（見圖2）。

圖2 化合物1 的化學結(jié)構(gòu)及主要1H-1H COSY、HMBC 相關(guān)信號Fig 2 Structure，1H-1H COSY，and key HMBC of compound 1

在HMBC 譜中，δH1.70（4'-CH3）和1.79（5'-CH3）分別與δC132.8（C-3'）和121.8（C-2'）有相關(guān)關(guān)系，結(jié)合1H-1H COSY 譜中觀察到的δH5.21（H-2'）?3.39（2H-1'）質(zhì)子自旋偶合體系，表明分子結(jié)構(gòu)存在異戊烯基片段；δH6.33（7-OH）與δC130.5（C-6）、151.2（C-7）、118.5（C-8）有相關(guān)，δH3.39（2H-1'）與δC151.2（C-7）、118.5（C-8）有相關(guān)，確定1 個羥基和異戊烯基分別位于C-7 和C-8 上。δH3.80（5-OCH3）和δC151.1（C-5）有相關(guān)，δH4.07（6-OCH3）和δC130.5（C-6）有相關(guān)，表明C-5 和C-6 位發(fā)生甲氧基取代。δH7.88（H-4）與δC160.5（C-2）和145.5（C-8a）相關(guān)，δH6.21（H-3）與δC160.5（C-2）和δC107.3（C-4a）相關(guān)以及δH6.21（H-3）?7.88（H-4）偶合體系的存在，推測分子中存在不飽和內(nèi)酯環(huán)。該化合物的NMR數(shù)據(jù)與文獻報道的化合物6-methoxycoumurrayin[7]具有較高的相似度，不同之處在于該化合物少了7位的甲氧基信號。根據(jù)1H-NMR 和13C-NMR 譜信號結(jié)合1H-1H COSY，HSQC 和HMBC 譜信息，對化合物碳氫信號進行歸屬（見表1）。

表1 化合物1 的1H-NMR 和13C-NMR 數(shù)據(jù)(CD3OD，600 MHz/150 MHz)Tab 1 1H-NMR and 13C-NMR data of compound 1 (CD3OD，600 MHz/150 MHz)

根據(jù)以上數(shù)據(jù)推斷，確定化合物1 的結(jié)構(gòu)鑒定為6-methoxy-7-demethylcoumurrayin，是一個新的香豆素類化合物。

化合物2：淡黃色針狀結(jié)晶（甲醇），HRESIMS 給出其準分子離子峰m/z247.0606 [M ＋H]＋（計算值為247.0601），分子式：C13H10O5。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH：6.37（1H，d，J＝14.7 Hz，H-3），8.10（1H，d，J＝14.7 Hz，4-H），7.66（1H，d，J＝3.3 Hz，H-2'），7.08（1H，d，J＝3.3 Hz，H-3'），4.03（3H，s，5-OCH3），4.14（3H，s，6-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC：161.0（C-2），114.2（C-3），140.0（C-4），109.5（C-4a），144.5（C-5），135.2（C-6），143.3（C-7），113.8（C-8），149.9（C-8a），145.5（C-2'），104.4（C-3'），62.5（6-OCH3），61.3（5-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻[8]報道基本一致，故鑒定化合物2 為茴芹內(nèi)酯。

化合物3：淡黃色針狀結(jié)晶（甲醇），HRESIMS 給出其準分子離子峰m/z247.0605 [M ＋H]＋（計算值為247.0604），分子式：C13H10O5。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH：6.21（1H，d，J＝9.6 Hz，H-3），8.05（1H，d，J＝9.6 Hz，H-4），7.56（1H，d，J＝2.4 Hz，H-2'），7.00（1H，d，J＝2.4 Hz，H-3'），4.09（3H，s，5-OCH3），4.10（3H，s，8-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CDCI3）δC：160.5（C-2），112.8（C-3），139.4（C-4），107.6（C-4a），144.3（C-5），114.8（C-6），150.0（C-7），128.2（C-8），143.6（C-8a），145.1（C-2'），105.1（C-3'），60.8（5-OCH3），61.7（8-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]報道的1H-NMR、13C-NMR 數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物3 為異茴芹內(nèi)酯。

化合物4：淡黃色粉末，HR-ESIMS 給出其準分子離子峰m/z301.1076 [M ＋H]＋（計算值為301.1071）， 分子式：C17H16O5。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH：6.21（1H，d，J＝9.6 Hz，H-3），8.51（1H，d，J＝9.6 Hz，H-4），7.55（1H，d，J＝2.4 Hz，H-2'），6.92（1H，d，J＝2.4 Hz，H-3'），4.77（2H，d，J＝7.2 Hz，H-1''），5.53（1H，m，H-2''），1.67（3H，s，4''-CH3），1.63（3H，s，5''-CH3），4.11（3H，s，5-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC：160.5（C-2），112.8（C-3），139.4（C-4），107.5（C-4a），144.3（C-5），114.5（C-6），150.8（C-7），126.9（C-8），144.3（C-8a），145.1（C-2'），105.0（C-3'），70.4（C-1''），119.8（C-2''），139.7（C-3''），25.8（C-4''），18.0（C-5''），60.7（5-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道[10]基本一致，故鑒定化合物4 為珊瑚菜內(nèi)酯。

化合物5：淺黃色粉末，HR-ESIMS 給出其準分子離子峰m/z493.1131 [M ＋H]＋（計算值為493.1129），分子式：C26H20O10。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH：4.04（2H，m，H-3，H-3''），4.39（1H，m，H-4，H-4''），7.45（1H，d，J＝3.3 Hz，H-2'，H-2'''），6.73（1H，d，J＝3.3 Hz，H-3'，H-3'''），3.83（3H，s，5-OCH3，5''-OCH3），3.67（3H，s，6-OCH3，6''-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC：164.7（C-2，C-2''），39.7（C-3，C-3''），38.2（C-4，C-4''），106.4（C-4a，C-4a''），139.4（C-5，C-5''），134.5（C-6，C-6''），148.1（C-7，C-7''），113.7（C-8，C-8''），147.5（C-8a，C-8a''），60.7（5-OCH3，6-OCH3，5''-OCH3，6''-OCH3），144.5（C-2'，C-2'''），103.9（C-3'，C-3'''）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[11]，故鑒定化合物5 為走馬芹內(nèi)酯。

化合物6：白色針狀結(jié)晶（甲醇）。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH：6.26（1H，d，J＝14.2 Hz，H-3），7.58（1H，d，J＝14.2 Hz，H-4），6.77（1H，s，H-5），5.75（1H，d，J＝15.1 Hz，H-3'），6.88（1H，d，J＝15.1 Hz，H-4'），3.89（3H，s，6-OCH3），1.53（6H，s，-CH3×2）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC：161.4（C-2），113.4（C-3），144.4（C-4），111.6（C-4a），108.7（C-5），145.7（C-6），146.0（C-7），110.4（C-8），144.7（C-8a），78.2（C-2'），131.0（C-3'），115.4（C-4'），56.7（6-OCH3），28.1（-CH3×2）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道[12]基本一致，故鑒定化合物6 為布拉易林。

化合物7：白色粉末，HR-ESIMS 給出其準分子離子峰m/z275.1281 [M ＋H]＋（計算值為275.1278）， 分子式：C16H18O4。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH：6.14（1H，d，J＝9.6 Hz，H-3），7.98（1H，d，J＝9.6 Hz，H-4），6.31（1H，s，H-6），3.43（2H，d，J＝7.3 Hz，H-1'），5.19（1H，t，J＝7.3 Hz，H-2'），1.65（3H，s，4'-CH3），1.82（3H，s，5'-CH3），3.91（3H，s，5-OCH3），3.92（3H，s，7-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC：162.1（C-2），110.4（C-3），139.18（C-4），104.1（C-4a），155.5（C-5），90.6（C-6），161.2（C-7），111.1（C-8），153.8（C-8a），21.7（C-1'），122.1（C-2'），132.5（C-3'），18.3（C-4'），26.2（C-5'），56.3（5-OCH3），56.2（7-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道[13]基本一致，故鑒定化合物7 為九里香內(nèi)酯。

化合物8：淡黃色針狀結(jié)晶（甲醇），HRESIMS 給出其準分子離子峰m/z271.0968 [M ＋H]＋（計算值為271.0965），分子式：C16H14O4。1H-NMR（600 MHz，CD3OD）δH：6.26（1H，d，J＝9.8 Hz，H-3），8.09（1H，d，J＝9.8 Hz，H-4），7.73（1H，d，J＝2.1 Hz，H-2'），6.87（1H，d，J＝2.1 Hz，H-3'），3.75（2H，d，J＝6.7 Hz，H-1''），5.06（1H，t，J＝6.7 Hz，H-2''），1.69（3H，s，4''-CH3），1.86（3H，s，5''-CH3）；13C-NMR（150 MHz，CD3OD）δC：162.9（C-2），113.9（C-3），143.8（C-4），115.1（C-4a），123.7（C-5），126.8（C-6），146.7（C-7），130.0（C-8），142.0（C-8a），147.7（C-2'），106.8（C-3'），28.5（C-1''），124.0（C-2''），133.3（C-3''），18.2（C-4''），25.8（C-5''）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道[14]基本一致，故化合物8 鑒定為別歐前胡素。

化合物9：橙色粉末，HR-ESIMS 給出其準分子離子峰m/z407.1134 [M ＋H]＋（計算值為407.1125），分子式：C23H18O7。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH：6.05（1H，d，J＝9.7 Hz，H-3），7.97（1H，d，J＝9.7 Hz，H-4），6.34（1H，s，H-6），3.93（3H，s，5-OCH3），3.74（3H，s，7-OCH3），6.05（1H，s，H-3'），7.93（1H，s，H-5'），7.23（1H，s，H-7'），3.70（3H，s，2'-OCH3）2.43（3H，s，6'-CH3）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC：161.5（C-2），111.1（C-3），139.0（C-4），104.0（C-4a），156.8（C-5）90.5（C-6），160.5（C-7）110.4（C-8），152.9（C-8a），56.2（5-OMe），56.3（6-OMe），185.4（C-1'），160.7（C-2'）108.7（C-3'）179.9（C-4'）133.6（C-4a'）127.5（C-5'）144.9（C-6'）138.8（C-7'），133.3（C-8'），127.2（C-8'a），56.5（2'-OCH3），22.0（6'-CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道[15]基本一致，故化合物9 鑒定為飛龍掌血香豆醌。

化合物10：淡黃色棱晶（甲醇），HR-ESIMS給出其準分子離子峰m/z260.0921[M ＋H]＋（計算值為260.0917），分子式：C14H13NO4。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH：7.91（1H，d，J＝13.8 Hz，H-5），7.15（1H，d，J＝13.8 Hz，H-6），7.50（1H，d，J＝4.2 Hz，H-2'），6.93（1H，d，J＝4.2 Hz，H-3'），4.32（3H，s，4-OCH3），3.94（3H，s，7-OCH3），4.03（3H，s，8-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC：163.3（C-2），101.0（C-3），156.2（C-4），113.8（C-4a），117.2（C-5），110.9（C-6），140.3（C-7），151.1（C-8），140.8（C-8a），141.9（C-2'），103.6（C-3'），60.0（4-OCH3），55.7（7-OCH3），60.6（8-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道基本一致[16]，故鑒定該化合物為茵芋堿。

化合物11：無色粉末，HR-ESIMS 給出其準分子離子峰m/z216.0655 [M ＋H]＋（計算值為216.0655），分子式：C12H9NO3。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH：7.47（1H，d，J＝5.4 Hz，H-2），6.91（1H，d，J＝5.4 Hz，H-3），7.58（1H，m，H-5），7.21（1H，t，J＝8.4 Hz，H-6），7.07（1H，m，H-7），4.28（3H，s，-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC：162.5（C-2），103.8（C-3），157.5（C-4），118.7（C-4a），110.3（C-5），124.2（C-6），113.0（C-7），151.0（C-8），135.7（C-8a），143.3（C-2'），105.0（C-3'），59.0（4-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道基本一致，故鑒定該化合物為大葉桉亭。

化合物12：無色針狀結(jié)晶（氯仿），HRESIMS 給出其準分子離子峰m/z200.0710 [M ＋H]＋（計算值為200.0706），分子式：C12H9NO2。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH：7.43～8.26（4H，m，Ar-H），7.06（1H，d，J＝4.2 Hz，H-10），7.61（1H，d，J＝4.2 Hz，H-11），4.43（3H，s，4-OCH3）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC：163.9（C-2），103.5（C-3），156.9（C-4），118.8（C-4a），122.5（C-5），123.8（C-6），129.7（C-7），127.9（C-8），145.7（C-8a），143.6（C-2'），104.9（C-3'），59.1（4-OCH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻報道數(shù)據(jù)一致[18]，故鑒定該化合物為白蘚堿。

化合物13：無色油狀物。1H-NMR（600 MHz，CDCl3）δH：5.43（1H，s，H-6），2.2（1H，m，H-11），0.94（3H，d，J＝6.0 Hz，12-CH3），0.92（3H，d，J＝6.0 Hz，13-CH3），1.91（3H，s，14-CH3），1.20（3H，s，15-CH3），3.37（5H，q，J＝8.0 Hz，-OCH2CH3），1.10（5H，t，J＝8.0 Hz，-OCH2CH3）；13C-NMR（150 MHz，CDCl3）δC：49.9（C-1），37.2（C-2），40.5（C-3），80.2（C-4），48.1（C-5），121.1（C-6），149.6（C-7），22.4（C-8），24.6（C-9），79.0（C-10），36.2（C-11），21.6（C-12），21.5（C-13），18.5（C-14），21.2（C-15），55.8（OCH2），16.3（OCH2CH3）。以上數(shù)據(jù)與文獻[19-20]報道基本一致，故鑒定該化合物為4α-ethoxy-10αhydroxyguai-6-ene。

3.2 抗菌活性篩選

考察了單體化合物對白假絲酵母菌 ATCC 5314 的抑制作用。結(jié)果顯示化合物11 對白假絲酵母菌 ATCC 5314 有一定抑制作用，MIC值為32 μg·mL－1（陽性對照兩性霉素BMIC值＜1 μg·mL－1）。剩余化合物在濃度為128 μg·mL－1時對白假絲酵母菌未顯示明顯抑制作用。

4 討論

本文對飛龍掌血根的95%乙醇提取液進行化學成分研究，從中分離鑒定化合物13 個，包括9 個香豆素類化合物（1～9）、3 個喹啉生物堿類化合物（10～12）以及1 個愈創(chuàng)木烷型倍半萜類化合物（13）。其中化合物1 為新化合物，化合物13 為首次從蕓香科中分離得到。前期對飛龍掌血的化學成分研究主要集中在香豆素和生物堿類成分，筆者從中分離到了新的香豆素類化合物及倍半萜類成分，豐富了飛龍掌血的化學信息。文獻報道飛龍掌血根的乙醇提取物有明顯的抑菌效果[21-22]；白假絲酵母菌的抑制活性測試結(jié)果表明，僅有化合物11 具有一定的白假絲酵母菌抑制活性，提示可能是其他結(jié)構(gòu)類型的化合物發(fā)揮抗菌作用，需要進一步研究闡明。