鄭艷萍，張曉琳，彭雲(yún)，趙開軍，貴書琪，4，刁和芳*（.江蘇弘典中藥產(chǎn)業(yè)研究院有限公司 南京市工程技術(shù)研究中心，南京 004；.蘇州思源天然產(chǎn)物研發(fā)有限公司，江蘇 蘇州 56；.南京中山制藥有限公司 江蘇省中藥經(jīng)典名方工程技術(shù)研究中心，南京 0046；4.中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院，南京 98）

五味消毒飲出自《醫(yī)宗金鑒》，由金銀花、蒲公英、天葵子、野菊花、紫花地丁5 味藥組成，具有清熱解毒、消散疔瘡等功效，常用于疔毒等癥。現(xiàn)代研究表明，本方主要含有綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、蒙花苷等成分[1-5]，具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等作用[6-7]，臨床上廣泛用于五官科、內(nèi)科、外科、婦科等火毒濕熱所致的感染性疾患[8-10]。目前，五味消毒飲臨床應(yīng)用以傳統(tǒng)湯劑為主[11]，然而，其質(zhì)量一致性易受煎煮方式及原藥材品質(zhì)的影響。因此，為了確保五味消毒飲后續(xù)研發(fā)的劑型能保持原方的藥效，有必要建立標(biāo)準(zhǔn)煎液的質(zhì)量控制方法。

中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，部分指標(biāo)性成分檢測(cè)并不能充分體現(xiàn)整體質(zhì)量與藥效。中藥指紋圖譜能全面、系統(tǒng)地反映復(fù)方制劑的整體特征，已成為中藥質(zhì)量控制的有效手段[12-13]。本研究采用HPLC 法建立五味消毒飲標(biāo)準(zhǔn)煎液的指紋圖譜，為五味消毒飲標(biāo)準(zhǔn)煎液的質(zhì)量評(píng)價(jià)提供方法及依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

LC-20AT 高效液相色譜儀（日本島津公司）；EL104 電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司）。

1.2 試藥

金銀花Lonicera japonicaThunb.產(chǎn)地來(lái)源為山東和河南，野菊花Chrysanthemum indicumL.產(chǎn)地來(lái)源為安徽和湖北，蒲公英Taraxacum mongolicumHand.-Mazz.產(chǎn)地來(lái)源為河南、山西、內(nèi)蒙古，紫花地丁Viola yedoensisMakino 產(chǎn)地來(lái)源為河南、山東、陜西，天葵子Semiaquilegia adoxoides（DC.）Makino 產(chǎn)地來(lái)源為安徽、湖北、湖南，各10 個(gè)批次（均購(gòu)于安徽匯中州中藥飲片有限公司和安徽金芙蓉中藥飲片有限公司，經(jīng)南京中山制藥有限公司李輝執(zhí)業(yè)中藥師鑒定）。經(jīng)檢驗(yàn)，以上藥材水分、灰分、含量、浸出物等均符合2015年版《中國(guó)藥典》一部相關(guān)規(guī)定。

綠原酸（批號(hào)：110753-201716，純度≥99%）和咖啡酸（批號(hào)：110885-201703，純度≥99%）（對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院），木犀草苷（批號(hào)：17030405，純度≥99%）和蒙花苷（批號(hào)：15101207，純度≥99%）（對(duì)照品，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院）。

甲醇、乙腈（色譜純，安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰荆姿幔ǚ治黾?，南京化學(xué)試劑股份有限公司），水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取綠原酸、咖啡酸、木犀草苷、蒙花苷對(duì)照品適量，加80%甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為32、19.68、10.7、17.28 μg·mL－1的對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 取金銀花150 g、野菊花60 g、蒲公英60 g、紫花地丁60 g、天葵子60 g，加4.5 L 水，浸泡20 min，加熱至沸，沸騰20 min 后過(guò)濾，藥渣加4 L 水，加熱至沸，沸騰20 min 后過(guò)濾，合并藥液，減壓濃縮至含生藥1.0 g·mL－1。量取濃縮液1 mL，加入1 mL 水，混勻，用80%甲醇定容至50 mL，搖勻，過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。按照表1對(duì)應(yīng)的產(chǎn)地及批號(hào)的藥材制備16 批五味消毒飲標(biāo)準(zhǔn)煎液。

表1 16 批五味消毒飲標(biāo)準(zhǔn)煎液藥材樣品產(chǎn)地及批號(hào)Tab 1 Origin places and batch numbers of herbs in 16 batches of Wuwei Xiaoduyin standard decoction

2.1.3 單味藥供試液 分別取金銀花150 g，野菊花60 g，蒲公英60 g，紫花地丁60 g，天葵子60 g，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，即得各單味藥的供試液。

2.2 色譜條件

色譜柱：YMC-Pack ODS-A 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），洗脫梯度（0～20 min，90%～80%B；20～40 min，80%～75%B；40～52 min，75%～70%B；52～52.01 min，70%～90%B；52.01～60 min，90%B）；流速：1.0 mL·min－1；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密稱取綠原酸對(duì)照品10.3 mg 和蒙花苷對(duì)照品1.1 mg 置25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容，得到各對(duì)照品儲(chǔ)備液。綠原酸對(duì)照品儲(chǔ)備液用甲醇稀釋至264、132、66、33、16.5 μg·mL－1，蒙花苷對(duì)照品儲(chǔ)備液用甲醇稀釋至35.2、17.6、8.8、4.4、2.2 μg·mL－1，進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度（μg·mL－1）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程：綠原酸Y＝6.11×104X－2.23×104（r＝0.9999），線性范圍：16.5～264 μg·mL－1；蒙花苷Y＝5.03×104X＋4.25×103（r＝0.9999），線性范圍：2.2～35.2 μg·mL－1。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8 h 進(jìn)樣，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于3%，表明供試品溶液在8 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5 次，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 參照“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備5 份供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收試驗(yàn)

① 綠原酸加樣回收試驗(yàn)：按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備9份標(biāo)準(zhǔn)煎液濃縮液，每3份一組，取0.25 mL 置25 mL 量瓶中，加入0.25 mL 水，搖勻，分別加入165 μg·mL－1綠原酸對(duì)照品溶液10、13、15 mL，加80%的甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液為供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果低、中、高回收率均在101.0%～102.8%，RSD均小于1.0%。

② 蒙花苷加樣回收試驗(yàn)：按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備9份標(biāo)準(zhǔn)煎液濃縮液，每3份一組，取0.30 mL 置50 mL 量瓶中，加入0.70 mL 水，搖勻，分別加入44 μg·mL－1蒙花苷對(duì)照品溶液4、5、6 mL，加80%的甲醇定容，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液為供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果低、中、高回收率均在97.0%～99.2%，RSD均小于1.0%。

2.4 五味消毒飲標(biāo)準(zhǔn)煎液含量測(cè)定

取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè)，計(jì)算綠原酸及蒙花苷含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n ＝3，mg·g－1)Tab 2 Sample content determination (n ＝3，mg·g－1)

2.5 五味消毒飲標(biāo)準(zhǔn)煎液指紋圖譜的建立

將16 批供試品溶液按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄1 h 內(nèi)的色譜圖。將其導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012 版”，生成五味消毒飲標(biāo)準(zhǔn)煎液特征指紋圖譜，見圖1，結(jié)果確定了13 個(gè)共有峰。取混合對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，見圖2，通過(guò)比對(duì)各峰與混合對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間，確認(rèn) 3、6、9、13號(hào)峰分別為綠原酸、咖啡酸、木犀草苷和蒙花苷。

圖1 16 批五味消毒飲標(biāo)準(zhǔn)煎液HPLC 指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprint of 16 batches of Wuwei Xiaoduyin standard decoction

圖2 混合對(duì)照品HPLC 指紋圖譜Fig 2 HPLC fingerprint of mixed reference substances

在16 批五味消毒飲標(biāo)準(zhǔn)煎液指紋圖譜中，3號(hào)峰（綠原酸）峰面積最大且分離度好，故選用3號(hào)峰作為參照峰，計(jì)算共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

采用“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012版”，對(duì)16 批標(biāo)準(zhǔn)煎液的指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，結(jié)果分別為0.998、0.999、0.999、0.999、0.998、0.998、0.998、0.999、0.999、0.998、0.999、0.999、0.998、0.999、0.996、0.998，均大于0.99，說(shuō)明樣品制備方法及所建立的指紋圖譜穩(wěn)定可靠，能作為五味消毒飲標(biāo)準(zhǔn)煎液質(zhì)量控制的參考依據(jù)。

2.6 指紋圖譜特征峰的歸屬分析

將單味藥供試液按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)煎液及其對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行比較，確定各特征峰歸屬，結(jié)果見圖3。指紋圖譜特征峰主要由金銀花、野菊花、蒲公英、紫花地丁4 味藥材所貢獻(xiàn)。其中，1 號(hào)峰、3號(hào)峰、4 號(hào)峰、9 號(hào)峰、10 號(hào)峰、11 號(hào)峰、12 號(hào)峰主要來(lái)源于金銀花，次要來(lái)源于野菊花；2 號(hào)峰單獨(dú)來(lái)源于蒲公英；5 號(hào)峰和7 號(hào)峰單獨(dú)來(lái)源于紫花地??；6 號(hào)峰來(lái)源于蒲公英和金銀花；8 號(hào)峰來(lái)源于紫花地丁和金銀花；13 號(hào)峰單獨(dú)來(lái)源于野菊花。五味消毒飲標(biāo)準(zhǔn)煎液共有峰歸屬見表3。

表3 五味消毒飲標(biāo)準(zhǔn)煎液共有峰歸屬Tab 3 Common peaks attribution in Wuwei Xiaoduyin standard decoction

圖3 單味藥標(biāo)準(zhǔn)煎液HPLC 指紋圖譜及對(duì)照指紋圖譜Fig 3 HPLC fingerprint of single medicinal material standard decoction and reference substance

3 討論

在對(duì)五味消毒飲標(biāo)準(zhǔn)煎液指紋圖譜特征峰進(jìn)行歸屬分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)天葵子沒(méi)有對(duì)應(yīng)特征峰，可能是因?yàn)樘炜拥闹饕煞譃閮?nèi)酯類和氰苷類化合物[14]，其中內(nèi)酯類化合物微溶于水[5]，按照五味消毒飲經(jīng)典名方的傳統(tǒng)工藝，藥材加水制備標(biāo)準(zhǔn)煎液后，其溶于標(biāo)準(zhǔn)煎液中的含量很低，難以檢測(cè)。

為了對(duì)五味消毒飲進(jìn)行質(zhì)量控制，張宇等[7]采用HPLC 法測(cè)定了其口服液中綠原酸和咖啡酸的含量，楊宏靜等[6]利用HPLC 法測(cè)定了五味消毒飲中綠原酸、咖啡酸、蒙花苷和秦皮乙素的含量。然而，利用己知的少量活性成分的含量來(lái)控制中藥的質(zhì)量不充分，指紋圖譜能更全面地反映其整體特征[15]。楊曉琴等[11]建立了五味消毒飲口服液的HPLC 指紋圖譜，并對(duì)其特征峰進(jìn)行了對(duì)照品歸屬，但并未歸屬到藥材。本研究建立了五味消毒飲標(biāo)準(zhǔn)煎液的HPLC 特征指紋圖譜，對(duì)共有峰進(jìn)行了中藥材歸屬和化學(xué)成分指認(rèn)，較全面地反映了五味消毒飲標(biāo)準(zhǔn)煎液的整體化學(xué)特征，該方法穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好，可為五味消毒飲標(biāo)準(zhǔn)煎液的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

此外，本課題組前期對(duì)供試品的制備方法進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)減壓濃縮后，直接用80%甲醇稀釋會(huì)產(chǎn)生大量淺棕色大片絮狀沉淀，沉淀會(huì)包裹藥液成分，影響測(cè)定結(jié)果，加水后再稀釋，這種情況得到較大改善。對(duì)60%甲醇、70%甲醇、80%甲醇稀釋溶劑進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)80%甲醇為稀釋溶劑時(shí)，各成分的峰面積都較高，故選擇濃縮液加水稀釋后用80%甲醇稀釋定容。比較了色譜柱Comasil ODS AR-Ⅱ、Nucleosil C18、YMC-Pack ODS-A 洗脫效果，結(jié)果表明，YMCPack ODS-A 對(duì)應(yīng)圖譜的色譜峰分離最佳，峰形最好，因此選用YMC-Pack ODS-A 色譜柱。對(duì)流動(dòng)相甲醇-0.3%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.4%磷酸水溶液進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)以甲醇-0.3%磷酸水溶液洗脫時(shí)，色譜峰拖尾；以乙腈-0.4%磷酸水溶液洗脫時(shí)，色譜峰分離度較差；以乙腈-0.1%磷酸水溶液洗脫時(shí)，色譜峰分離度較好，保留時(shí)間適中，故流動(dòng)相確定為乙腈-0.1%磷酸水溶液。對(duì)供試液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果在檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm 時(shí)，圖譜信息最為豐富，響應(yīng)值普遍較高，且分離效果較好，因此選擇330 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。