趙純 管養(yǎng)洪 劉艷 張杰

肺癌是原發(fā)于氣管、支氣管和肺的惡性腫瘤，發(fā)病率、死亡率高，被稱為“癌癥頭號(hào)殺手”[1]，患者中大約85%為非小細(xì)胞肺癌[2]。肺癌治療方法有肺移植、化療、放療等，化療是主要手段，但化療藥物容易產(chǎn)生耐藥性且毒副作用大，嚴(yán)重影響治療效果和患者的生存率[3]。槲皮素是一種多酚羥基化合物，具有較好的祛痰、止咳作用，并且還有一定的平喘作用。相關(guān)研究表明槲皮素具有抗癌、抗氧化、抗病毒、保護(hù)心血管、免疫調(diào)節(jié)等多種藥理學(xué)活性[4,5]。順鉑是臨床上非小細(xì)胞肺癌治療的標(biāo)準(zhǔn)化療藥物，其抗癌的主要作用是造成DNA 損傷誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[6]。本次實(shí)驗(yàn)觀察槲皮素聯(lián)合順鉑作用對(duì)肺癌A549/DDP 細(xì)胞增殖、凋亡及磷脂酰肌醇-3-激酶（phasphatidy inositol-3 kinase，PI3K）/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（serine-threonine protein kinase，Akt）信號(hào)通路的影響，研究槲皮素與順鉑的協(xié)同作用，探討其作用機(jī)制，為臨床治療非小細(xì)胞肺癌提供新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般材料 本次實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2020 年3 月至2020 年10 月，采用人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株A549/DDP（由湖南豐暉生物科技有限公司生產(chǎn)）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，并選用槲皮素（由上海源葉生物科技有限公司生產(chǎn)）、順鉑（由上海脈鉑醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)）、CCK-8 檢測(cè)試劑盒、JC-1 檢測(cè)試劑盒（由上海碧云天生物公司生產(chǎn)）、凋亡檢測(cè)試劑盒（由上海翊圣生物公司生產(chǎn)）、PI3K、Akt（由武漢三鷹生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）等材料。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞分組處理 實(shí)驗(yàn)分為槲皮素+順鉑組（槲皮素濃度160 μmol/L，順鉑濃度25 μmol/L）、順鉑組（濃度為25 μmol/L）、槲皮素組（濃度為160 μmol/L）和對(duì)照組（藥物濃度為0）；其中各組二甲基亞礬（dimethyl sulfoxide，DMSO）濃度均控制在0.1%。

1.2.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 將不同濃度的槲皮素、順鉑單獨(dú)及聯(lián)合加入各孔，每個(gè)濃度梯度設(shè)4 個(gè)平行孔及藥物空白孔（去除藥物溶液自身顏色對(duì)測(cè)定的影響），并設(shè)添加0.1% DMSO完全培養(yǎng)基的對(duì)照組，等待48 h 后每孔加入20 μl CCK-8，細(xì)胞培養(yǎng)箱（由山東博科生物有限公司生產(chǎn)）內(nèi)孵育2 h 后，于酶標(biāo)儀（由上海聚慕醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)）450 nm 處測(cè)定吸光度值。計(jì)算各組細(xì)胞增殖抑制率。

1.2.3 Annexin V/PI 雙染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 實(shí)驗(yàn)分為槲皮素+順鉑組（0.1% DMSO、IC50槲皮素及IC50順鉑）、順鉑組（0.1% DMSO 及IC50順鉑）、槲皮素組（0.1% DMSO 及IC50槲皮素）、對(duì)照組（0.1% DMSO，藥物濃度為0）。藥物作用于細(xì)胞48 h 后，采集各組細(xì)胞，按照Annexin V-FITC 試劑盒（由上海翊圣生物公司生產(chǎn)）說明書進(jìn)行操作步驟。計(jì)算各組細(xì)胞調(diào)亡率。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)蛋白的表達(dá) 細(xì)胞種板及藥物分組與流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率相同，藥物作用48 h 后，按總蛋白提取試劑盒說明書提取各組總蛋白，用Bradford 法蛋白定量，經(jīng)分離后，轉(zhuǎn)膜，封閉，添加對(duì)應(yīng)一抗，隨后二抗孵育，TBST 洗滌，ECL 發(fā)光液加于PVDF 膜上，X 線膠片曝光，經(jīng)顯影、定影、掃描后觀察結(jié)果。對(duì)掃描圖像的目的條帶進(jìn)行灰度分析，目的條帶與β-actin 的灰度比值即為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。計(jì)量資料比較采用F檢驗(yàn)和t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。設(shè)P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組的細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率比較見表1

表1 各組的細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率比較/%

由表1可見，各組A549/DDP 細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別=12.26、163.10，P均＜0.05）。槲皮素組的細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率高于對(duì)照組（t分別=20.58、8.54，P均＜0.05）；順鉑組的細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率高于槲皮素組（t分別=2.17、6.32，P均＜0.05）；槲皮素+順鉑組的細(xì)胞增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率高于順鉑組（t分別=2.54、5.78，P均＜0.05）。

2.2 p-PI3K、p-Akt蛋白的表達(dá)見表2

表2 各組的p-PI3K、p-Akt蛋白的表達(dá)比較

由表2可見，各組A549/DDP細(xì)胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別=47.88、41.30，P均＜0.05）。槲皮素組的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=4.77、4.09，P均＜0.05）；順鉑組的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白表達(dá)水平低于槲皮素組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=2.38、4.34，P均＜0.05）；槲皮素聯(lián)合順鉑組的p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白表達(dá)水平低于順鉑組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t分別=7.05、10.28，P均＜0.05）。

2.3 p-PI3K、p-Akt蛋白的表達(dá)結(jié)果見圖1

由圖1 可見，與對(duì)照組比較，槲皮素組p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)下降；與槲皮素組比較，順鉑組的p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)下降；與順鉑組比較，槲皮素+順鉑組p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)下降。

圖2 p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)示意圖

3 討論

肺癌目前全球死亡率和發(fā)病率最高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人們的健康[7]。肺癌一般多發(fā)于中年以后的男性，近些年隨著現(xiàn)代生活的發(fā)展，肺癌的發(fā)病率出現(xiàn)了年輕化趨勢(shì)，而這種情況與不良生活習(xí)慣和環(huán)境污染有著較大的關(guān)系[8]。目前，世界上使用比較廣泛的化療藥物是順鉑，它在肺癌的治療過程中表現(xiàn)出較好的治療效果，但長期應(yīng)用會(huì)引起腫瘤細(xì)胞對(duì)其產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致治療效果不佳，并且其毒副作用較大。因此，為了提高肺癌患者的臨床治療效果，尋找抵抗耐藥性的新藥非常重要[9]。相關(guān)研究表明，槲皮素是一種天然的黃酮類化合物，包括蕓香苷和槲皮苷2 種糖基化形式，廣泛分布于水果、蔬菜及多種中草藥中，有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎以及保護(hù)心血管等功能。槲皮素還在多種惡性腫瘤中發(fā)揮抗癌活性，如乳腺癌、肝癌、肺癌、白血病等[10]。另外槲皮素還具有成本低和不良反應(yīng)少的優(yōu)點(diǎn)。相關(guān)研究表明，槲皮素可以減少順鉑引起的毒性反應(yīng)[11]，增加順鉑化療敏感性[12]。本次實(shí)驗(yàn)研究槲皮素聯(lián)合順鉑對(duì)肺癌治療的協(xié)同作用，并初步探討其與PI3K/Akt信號(hào)通路之間的關(guān)系。

本次研究顯示，槲皮素和順鉑單獨(dú)使用時(shí)對(duì)肺癌A549/DDP細(xì)胞有增殖抑制作用，但槲皮素和順鉑聯(lián)合應(yīng)用后，對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖抑制作用更加明顯。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，槲皮素聯(lián)合順鉑使A549/DDP 細(xì)胞凋亡率明顯上升。單用槲皮素或者順鉑也可使肺癌A549/DDP細(xì)胞凋亡率上升，但是槲皮素和順鉑聯(lián)用后可明顯誘導(dǎo)肺癌A549/DDP 細(xì)胞核破碎，且細(xì)胞早期凋亡率較槲皮素、順鉑單用組明顯上升。劉強(qiáng)等[13]研究也證實(shí)，細(xì)胞凋亡在細(xì)胞生物體發(fā)育生長過程關(guān)鍵的作用，參與了多種生理病理過程，尤其是在癌癥化療治療中為潛在的治療策略。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示槲皮素與順鉑兩藥聯(lián)用明顯降低了p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達(dá)水平。

肺癌細(xì)胞的增殖、凋亡與PI3K/Akt 信號(hào)通路有關(guān)[14]。本次實(shí)驗(yàn)通過Western blot 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，單用槲皮素、順鉑組的p-PI3K/p-Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)水平均較低，但隨著槲皮素、順鉑聯(lián)用，p-PI3K、p-Akt 蛋白相對(duì)表達(dá)水平均降低，這說明槲皮素聯(lián)合順鉑可以調(diào)控p-PI3K、p-Akt 信號(hào)通路。這可能與Akt 是重要的PI3K 下游調(diào)節(jié)激酶之一有關(guān)。槲皮素聯(lián)合順鉑通過抑制PI3K 的表達(dá)，使得PI3K 無法與Akt 的PH 區(qū)域含有蘇氨酸和絲氨酸殘基的底物磷酸化結(jié)合，抑制了Akt 的PH 區(qū)域含有蘇氨酸和絲氨酸殘基的底物磷酸化活化，Akt 發(fā)揮抗凋亡、促細(xì)胞生長的生物學(xué)效應(yīng)主要通過對(duì)Akt 的PH 區(qū)域而實(shí)現(xiàn)。此過程活化被抑制使Akt 信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖均受到抑制，導(dǎo)致細(xì)胞趨向于凋亡。這與施銀等[15]對(duì)PI3K/Akt 信號(hào)通路與細(xì)胞的增殖、凋亡及其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的研究結(jié)果相類似。

綜上所述，槲皮素聯(lián)合順鉑抑制癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其作用機(jī)制與PI3K/Akt 信號(hào)通路有密切關(guān)系，這為肺癌臨床治療提供了新的思路。同時(shí)也存在一些不足之處，細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)的情況不完全一致，還需通過動(dòng)物模型甚至患者進(jìn)行進(jìn)一步深入研究，為將槲皮素聯(lián)合順鉑應(yīng)用于肺癌的臨床治療提供確切的理論依據(jù)。