李文娟，蔡延江，朱同彬，黃 平

（1. 中國科學(xué)院重慶綠色智能技術(shù)研究院，重慶 400714；2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3. 亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江農(nóng)林大學(xué)，杭州 311300；4. 自然資源部/廣西壯族自治區(qū)巖溶動力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國地質(zhì)科學(xué)院巖溶地質(zhì)所，廣西桂林 541004）

氧化亞氮（Nitrous oxide，N2O）是大氣中重要的溫室氣體，其單位質(zhì)量的增溫潛勢是二氧化碳（CO2）的265倍[1]，同時(shí)N2O還能在平流層中發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，引起臭氧層的破壞，導(dǎo)致地面紫外輻射增強(qiáng)，威脅人類的健康與生存[2]。N2O的來源有土壤、海洋和淡水湖泊，以及化石燃料燃燒等，而土壤是N2O主要排放源，約占總排放量的60%[3]。土壤N2O排放主要受其產(chǎn)生和還原雙重作用的影響[4]。據(jù)估計(jì)，至2030年，隨著農(nóng)田面積的擴(kuò)大和化肥使用量的增加，N2O排放量將增加35%～60%[3]。

土壤團(tuán)聚體由原生顆粒（砂、粉、黏粒）、膠結(jié)物質(zhì)和孔隙組成[5]，是土壤結(jié)構(gòu)的基本單元和微生物的重要棲息地[6]。不同粒徑的土壤團(tuán)聚體具有獨(dú)特的物理化學(xué)特性，大團(tuán)聚體孔隙連接度高、通氣性好、周轉(zhuǎn)率快、有機(jī)質(zhì)豐富[7]；微團(tuán)聚體持水能力強(qiáng)、穩(wěn)定性碳含量高，且受其保護(hù)的微生物不易被捕食[8]。因而，不同粒徑團(tuán)聚體形成了分化的微生物生態(tài)位[9]，進(jìn)而影響N2O產(chǎn)生和還原的功能微生物分布[10]。本文梳理了不同粒徑團(tuán)聚體N2O排放量的研究，整合分析其結(jié)果存在明顯分歧；通過闡述土壤N2O產(chǎn)生和還原的微生物學(xué)過程和分析不同粒徑土壤團(tuán)聚體微生物的初始分布與環(huán)境擾動下的再分布過程，解釋分歧存在的原因；進(jìn)一步探討氮循環(huán)功能基因在土壤團(tuán)聚體中分布，評估不同粒徑團(tuán)聚體N2O產(chǎn)生和還原熱區(qū)的可行性。

1 不同粒徑土壤團(tuán)聚體的N2O排放

土壤團(tuán)聚體是礦物顆粒在植物根系和土壤有機(jī)質(zhì)、菌絲、土壤氧化物等有機(jī)和無機(jī)膠結(jié)物質(zhì)作用下結(jié)合形成的二次顆粒。根據(jù)分級團(tuán)聚理論，將土壤團(tuán)聚體分成大團(tuán)聚體（Large macroaggregates，>2 mm）、小團(tuán)聚體（Small macroaggregates，2～ 0.25 mm）、微團(tuán)聚體（Microaggregates，0.25～ 0.053 mm）和粉-黏顆粒（Silt-plus Clay-size Particles，<0.053 mm）[11]。不同粒徑土壤團(tuán)聚體具有不同的幾何形狀和孔隙結(jié)構(gòu)，微團(tuán)聚體的平均孔徑較大團(tuán)聚體小。這種差異影響通氣條件、營養(yǎng)物質(zhì)和溶解性有機(jī)碳的擴(kuò)散。相對于微團(tuán)聚體，大團(tuán)聚體的通氣條件較好，含有更多的不穩(wěn)定性碳，其周轉(zhuǎn)率和碳氮比（C/N）也較高[7]，有利于增強(qiáng)好氧菌的活性。但是大團(tuán)聚體內(nèi)細(xì)菌更容易被捕食；特殊水分狀態(tài)（如短時(shí)間內(nèi)快速對流水和長時(shí)間缺水）會限制微生物運(yùn)動和微生物酶運(yùn)輸，不利于細(xì)菌生長[12]。相反，微團(tuán)聚體能夠承受強(qiáng)大的機(jī)械和物理化學(xué)外力；能夠在土壤中保持良好的穩(wěn)定性；同時(shí)具有較低的養(yǎng)分有效性以及較低氣體擴(kuò)散率（圖1）[8]。因此，具有特殊獨(dú)立化學(xué)條件的不同粒徑土壤團(tuán)聚體，可以被視為微生物產(chǎn)生和還原N2O的生物化學(xué)反應(yīng)器[13-14]。目前在不同粒徑土壤團(tuán)聚體中N2O排放的結(jié)果存在較大差異（表1），在不同的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)條件下，大團(tuán)聚體、小團(tuán)聚體和微團(tuán)聚體的排放速率閾值分別為0.044～5 607 μg·kg–1·h–1、0.016～7 637 μg·kg–1·h–1、0.009～4.03 μg·kg–1·h–1。

表1 不同粒徑土壤團(tuán)聚體N2O排放速率 Table 1 N2O emission rate in different sizes of soil aggregates

大量研究發(fā)現(xiàn)大團(tuán)聚體較微團(tuán)聚體具有更高的N2O排放能力[14]。Khalil等[15]發(fā)現(xiàn)較大團(tuán)聚體中的N2O排放高于小團(tuán)聚體，認(rèn)為這是由于團(tuán)聚體內(nèi)的氧氣濃度較低造成的。Diba等[8]研究發(fā)現(xiàn)火山灰土施用肥料時(shí)，大團(tuán)聚體（4.5 mm）較小團(tuán)聚體（<2 mm）排放更多的N2O。Kimura等[16]采用培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究兩種土地利用類型下不同粒徑團(tuán)聚體中N2O排放，發(fā)現(xiàn)熱帶油棕和林地均以大團(tuán)聚體N2O排放最多。Drury等[17]通過培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)N2O在大團(tuán)聚體中排放速率（2～4 mm、4～8 mm）為7.0 mg·kg–1，而在小團(tuán)聚體和微團(tuán)聚體（0.25～0.5 mm、<0.25 mm）中排放速率為0.04 mg·kg–1。同時(shí)，也有研究表明較小團(tuán)聚體中的反硝化速率和N2O排放高于大團(tuán)聚體[10]。Mu?oz等[18]發(fā)現(xiàn)在施用肥料后，隨著團(tuán)聚體粒徑的增大，N2O的排放量減少。Uchida[19]和Robinson[20]等發(fā)現(xiàn)，施用尿肥后， 土壤中小團(tuán)聚體較大團(tuán)聚體N2O排放量更多。Sey[21]和周漢昌[10]等的研究結(jié)果也表明土壤團(tuán)聚體最小粒徑下N2O排放速率更高。由此可以看出，不同粒徑土壤團(tuán)聚體對N2O排放的貢獻(xiàn)存在不一致性，而存在這種分歧的主要原因是產(chǎn)生和還原N2O的微生物在土壤中分布不同[21]。

2 土壤團(tuán)聚體N2O排放的微生物學(xué)過程

土壤團(tuán)聚體N2O排放主要與N2O產(chǎn)生和還原有關(guān)。土壤N2O主要通過微生物的硝化作用（Nitrification）、反硝化作用（Denitrification）以及硝酸鹽異化還原成銨（Dissimilatory nitrate reduction to ammonium，DNRA）、硝化-反硝化耦合作用（Nitrification-Coupled denitrification）、共反硝化作用（Co-denitrification）和非生物分解等過程產(chǎn)生[24]。而完全反硝化和非反硝化微生物攜帶的氧化亞氮還原酶（Nitrous oxide reductase，N2OR）是目前唯一明確的N2O微生物還原途徑[25]。本文重點(diǎn)討論微生物對N2O產(chǎn)生和還原的影響（圖2）。

2.1 N2O產(chǎn)生的微生物學(xué)機(jī)制

微生物硝化作用主要是將NH3氧化為 2NO-，再最終生成 3NO-的過程[26]。其主要微生物包括，氨氧化細(xì)菌（Ammonia oxidizing bacteria，AOB）、氨氧化古菌（Ammonia oxidizing archaea，AOA）、亞硝酸氧化菌（Nitrite oxidizing bacteria，NOB）和完全氨氧化細(xì)菌（Complete ammonia oxidizers，comammox）[4]。AOA和AOB攜帶amoA基因，該基因編碼氨單加氧酶（Ammonia monooxygenase，AMO），將NH3氧化生成羥胺（NH2OH），細(xì)胞色素P460以NO為中間體將NH2OH轉(zhuǎn)化為N2O，或NH2OH經(jīng)化學(xué)分解生成N2O[27]。未被轉(zhuǎn)化的NH2OH則經(jīng)過羥胺氧化還原酶（Hydroxylamine oxidoreductase，HAO）氧化為 2NO-。氨氧化細(xì)菌（AOB）還可以利用 2NO-作為電子受體，進(jìn)行硝化細(xì)菌反硝化作用（Nitrifier denitrification）[28]。目前研究較多的硝化細(xì)菌反硝化作用菌N. europaea含有某種亞硝酸還原酶和一氧化氮還原酶（Nitric o xide reductase，NOR），將 NO-2還原為N2O[27-28]。亞硝酸氧化菌（Nitrite oxidizing bacteria，NOB）攜帶亞硝酸鹽氧化還原酶（Nitrite oxidoreductase，NXR）將 NO-2氧化為 NO3-，nxrB是NXR的編碼基因[29]。完全氨氧化細(xì)菌含有AMO、HAO和NXR，可一步完成硝化作用將NH3氧化 NO-3[30]。目前對完全氨氧化細(xì)菌N.inopinata進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，由于該菌體內(nèi)缺乏將NO轉(zhuǎn)化為N2O的一氧化氮還原酶，進(jìn)而通過非生物NH2OH轉(zhuǎn)化產(chǎn)生N2O。但還需要進(jìn)一步判斷是否其他完全氨氧化微生物含有一氧化氮還原酶[31]。

反硝化作用是微生物將 NO-3依次還原為 NO-2、NO、N2O，最后還原成N2的過程[4]。反硝化細(xì)菌產(chǎn)生N2O過程中，關(guān)鍵作用酶有硝酸還原酶（Nitrate reductase，NAR）、亞硝酸還原酶（Nitrite reductase，NIR）、一氧化氮還原酶[26]。NAR是將 NO-3還原為NO-2，分為膜結(jié)合硝酸還原酶（NAR）和周質(zhì)硝酸還原酶（NAP），對應(yīng)的功能基因分別為：narG和napA，NAR僅在厭氧環(huán)境下發(fā)揮作用[26]。NIR是將NO-2還原為NO，該酶分為含銅亞硝酸鹽還原酶（Cu-NiR）和細(xì)胞色素 cd1亞硝酸鹽還原酶（cd1-NiR），分別由nirK和nirS編碼。2002年首次發(fā)現(xiàn)同時(shí)含有這兩種基因的菌株以前，學(xué)術(shù)界公認(rèn)這兩種基因在同一微生物體內(nèi)不能共存[32-33]。含銅亞硝酸鹽還原酶的微生物一般生存在低氧環(huán)境。NOR將NO還原為N2O，在細(xì)菌和古菌中發(fā)現(xiàn)三類NOR，第一種（cNOR），是雙亞基酶，兩個亞基分別是NorB和NorC，該酶僅在反硝化細(xì)菌中存在，且使用可溶性蛋白質(zhì)作為電子供體，如細(xì)胞色素c[34]；第二類為quinol-dependent NOR（qNOR），是一種單亞基酶，它缺乏細(xì)胞色素c，采用醌作為電子供體，在非硝化致病菌、反硝化菌和古菌中均有發(fā)現(xiàn)[35]；第三類是qCuANOR，從NO還原菌Bacillusazotoformans中分離獲取，其親水域具有雙銅位點(diǎn)，對于該酶的研究目前甚少[36]。

土壤N2O的產(chǎn)生還存在其他微生物過程，如：硝酸鹽異化還原成銨、硝化-反硝化耦合作用和共反硝化等[24]。DNRA將 NO-3轉(zhuǎn)化為 NH+4，與 NO-3反硝化作用具有底物競爭關(guān)系[37]。DNRA的關(guān)鍵酶是細(xì)胞色素c亞硝酸鹽還原酶（Cytochrome c nitrite reductase，NrfA），它能夠催化 NO-2還原為 NH+4[38]；由于將 NO-3還原為 NH+4所需自由能較反硝化作用將 NO-3還原為N2O和N2所需自由能更高，因而大多數(shù)情況下，DNRA很難發(fā)生[39]。但是相對于反硝化作用，在高 C∶ N O3-比條件下，DNRA更容易發(fā)生，此過程中可以產(chǎn)生N2O，但是數(shù)量少，貢獻(xiàn)率低[40]。硝化-反硝化耦合作用是有氧環(huán)境中硝化作用產(chǎn)生 NO-3和 NO-2，然后作為底物直接被存在于厭氧或低氧環(huán)境，被反硝化微生物所利用，從而導(dǎo)致好氧-厭氧界面N2O排放[28]。共反硝化則是在反硝化條件下，尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）將非硝酸或非亞硝酸鹽氮化物（氨基酸、苯胺、疊氮化物、水楊酸和氨等）轉(zhuǎn)化為N2O或N2的過程[41]。在同一土壤團(tuán)聚體中存在哪些N2O產(chǎn)生途徑，以及這些途徑的區(qū)分與相對貢獻(xiàn)的量化還需深入研究。

2.2 土壤N2O還原微生物學(xué)機(jī)制

土壤N2O可以通過多個微生物途徑產(chǎn)生，但N2O還原目前已知的過程僅為nosZ基因編碼的氧化亞氮還原酶（Nitrous oxide reductase，N2OR）將N2O還原為N2[42-43]。nosZ基因存在于細(xì)菌和古菌中，而真菌缺乏該酶，并且在放線菌或酸桿菌門基因組中也明顯缺乏[25]。因此，真菌不能進(jìn)行完全反硝化作用將N2O還原N2[44]。nosZ基因存在nosZI和nosZII兩種基因類型[25]。相對于前者，后者編碼的酶對N2O親和力更高；同時(shí)，前者信號肽采用Sec分泌途徑，酶的運(yùn)輸狀態(tài)未折疊，后者則是Tat途徑，酶的運(yùn)輸狀態(tài)折疊[45]。通常情況下，土壤中nosZII較nosZI分布更廣，并發(fā)現(xiàn)nosZII在非反硝化N2O還原過程中也能發(fā)揮作用[43]。nosZ基因與nirS基因出現(xiàn)頻率明顯高于nirK，nosZ和nirS有更大程度的共同進(jìn)化史。這說明在良好的環(huán)境條件下，nirS型反硝化微生物更有可能發(fā)生完全反硝化作用，因此對N2O排放的貢獻(xiàn)可能小于nirK型反硝化細(xì)菌[25]。

3 土壤團(tuán)聚體對N2O排放的影響機(jī)制

土壤團(tuán)聚體形成與周轉(zhuǎn)過程中，微生物可以通過代謝物黏結(jié)周圍土壤顆粒，形成對其有利的生境[46]。同時(shí)，隨著外界環(huán)境因子改變，微生物也面臨棲息地再選擇[47]。一種情形是，適應(yīng)環(huán)境的微生物快速繁殖產(chǎn)生更多的衍生產(chǎn)物，而處于環(huán)境脅迫下的微生物會因?yàn)樽晕冶Ｗo(hù)作用處于休眠狀態(tài)，直到再次出現(xiàn)適合生存條件被激活或者極端環(huán)境導(dǎo)致死亡[48]；另外一種情形是，土壤大團(tuán)聚體發(fā)生崩解，微生物從團(tuán)聚體內(nèi)部重新釋放到外部環(huán)境，選擇適合生存的棲息地，或重新構(gòu)造新的團(tuán)聚體，進(jìn)而導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)在不同微生境的演變[49]。上述過程均可能導(dǎo)致土壤N2O產(chǎn)生與還原的功能微生物群落在不同粒徑團(tuán)聚體中分異與演化，進(jìn)而影響N2O排放。

3.1 土壤團(tuán)聚體與微生物相互影響機(jī)制

Tisdall和Oades[50]提出的團(tuán)聚體形成模型為0.000 2 mm→0.000 2～0.002 mm→0.002～0.02 mm→ 0.02～0.250 mm→2 mm，微團(tuán)聚體由有機(jī)分子膠結(jié)粉-黏顆粒和多價(jià)陽離子形成復(fù)合粒子，微團(tuán)聚體再相互結(jié)合形成大團(tuán)聚體（如圖1）。土壤微生物的活性在團(tuán)聚體的形成和穩(wěn)定過程中起著至關(guān)重要的作用[51-52]。細(xì)菌對大團(tuán)聚體和微團(tuán)聚體的形成具有較大的貢獻(xiàn)；而真菌在大團(tuán)聚體形成中發(fā)揮著重要作用，真菌釋放的菌絲和糖蛋白能有效地黏著土壤顆粒[53-54]。硝化細(xì)菌（如Nitrospirae）由于硝化和反硝化過程減少土壤50%可利用的氮，減少大團(tuán)聚體形成，而土壤腐生真菌糞殼菌目（Sordariales）則是大團(tuán)聚體形成和穩(wěn)定的關(guān)鍵微生物[55]。真菌的菌絲通過形成大團(tuán)聚體可間接促進(jìn)N2O的排放[56]。微生物通過分泌胞外多糖黏結(jié)土壤顆粒，增加顆粒間的凝聚力；同時(shí)由于胞外多糖的疏水性也有助于增加大團(tuán)聚體的穩(wěn)定性[54]。而微團(tuán)聚體則可以通過有機(jī)鍵保持穩(wěn)定[57]。當(dāng)發(fā)生外界環(huán)境擾動（水淹、耕作、土壤動物活動和根系穿插等）時(shí)，土壤團(tuán)聚體內(nèi)部相對穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)可能發(fā)生崩解[49]；或者隨著時(shí)間的推移，微生物直接消耗土壤團(tuán)聚體中的膠結(jié)劑，導(dǎo)致大團(tuán)聚體崩解并釋放微團(tuán)聚體和基本顆粒，進(jìn)而為新團(tuán)聚體的形成提供基礎(chǔ)構(gòu)件[6，58]。

微生物群落和結(jié)構(gòu)受土壤團(tuán)聚體粒徑的影響，細(xì)菌和真菌群落在不同粒徑團(tuán)聚體中存在明顯結(jié)構(gòu)差異。細(xì)菌和古菌更傾向存活于微團(tuán)聚體，一方面能躲避土壤動物的捕食；另一方面作為原核生物的細(xì)菌和古菌較真核生物的真菌小，更易于在微小生境棲息[59]。Mummey等[60]發(fā)現(xiàn) α-變形桿菌綱（Alphaproteobacteria）、放線菌亞綱（Actinobacteria）、紅色桿菌綱（Rubrobacteriaceae）和芽單孢菌綱（Gemmatimonadetes）等在微團(tuán)聚體中具有較高的豐度，而酸桿菌門（Acidobacteria）在大團(tuán)聚體中的豐度相對較高。Yang等[61]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌在微團(tuán)聚體中主要以芽胞桿菌科（Bacillaceae）和梭菌科（Clostridiaceaea）為主，而草酸桿菌科（Oxalobacteraceae）、鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）、噬纖維細(xì)菌科（Cytophagaceae）和芽單胞菌科（Gemmatimonadaceae）的相對豐度則在大團(tuán)聚體中占主導(dǎo)地位。真菌主要分布在土壤大團(tuán)聚體和團(tuán)聚體表面[62]，其中以毛球殼科（Lasiosphaeriaceae）和新科盾葉科（Rhizophlyctidaceae）為主[59-60]。Liao等[63]研究指出黑土中真菌子囊菌綱（Sordariomycetes）隨團(tuán)聚體粒徑的減少而顯著降低。子囊菌產(chǎn)生N2O 占真菌的90%，其次為擔(dān)子菌門（Basidiomycota）和合子菌門（Zygomycota），分別占7%和3%[64]。還有研究證實(shí)土壤微團(tuán)聚體（<0.02 mm）微生物多樣性和活性高，為微生物提供了良好的棲息地[65]。Bach等[66]通過田間實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和真菌在微團(tuán)聚體中具有更豐富的多樣性。

土壤氮素循環(huán)功能微生物在不同粒徑團(tuán)聚體的分布情況如表1所示。研究發(fā)現(xiàn)固氮螺菌屬（Azospirillum）在粉-黏團(tuán)聚體（<0.002 mm）中豐度最高[67]。硝化作用能在不同粒徑的團(tuán)聚體中發(fā)生，主要取決于活性硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和豐度[68]。添加氮磷鉀肥的情況下，AOA在大團(tuán)聚體中的豐度顯著高于微團(tuán)聚體[69-70]；而未添加肥料時(shí)，AOB和AOA豐度在微團(tuán)聚體（<0.25 mm）中高于其他粒徑團(tuán)聚體（0.25～2 mm、>2 mm）[70]。在不同粒徑團(tuán)聚體上硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌很少發(fā)生完全分離，但是氨氧化細(xì)菌在大團(tuán)聚體（>0.25 mm）中的豐度最高，反硝化細(xì)菌群落在微團(tuán)聚體（<0.25 mm）中占主導(dǎo)地位[21]。周漢昌等[10]研究發(fā)現(xiàn)在<1 mm的團(tuán)聚體中，反硝化細(xì)菌群落數(shù)量顯著高于粒徑2～4 mm的團(tuán)聚體。也有研究發(fā)現(xiàn)反硝化細(xì)菌在<0.002 mm的團(tuán)聚體中生物量最大[71]。Kong等[72]開展了不同氮素管理?xiàng)l件對土壤硝化微生物、反硝化微生物和氮循環(huán)微生物的影響研究，發(fā)現(xiàn)微團(tuán)聚體（0.053～0.25 mm）中硝化細(xì)菌、反硝化細(xì)菌以及總微生物群落明顯大于大團(tuán)聚體（>0.25 mm）和粉-黏團(tuán)聚體（<0.053 mm）[72]。

3.2 環(huán)境因素對團(tuán)聚體中功能微生物豐度以及N2O排放的影響

環(huán)境變化影響土壤團(tuán)聚體功能微生物群落重新分布，進(jìn)而影響N2O排放[73]。底物濃度、土壤含水量、通氣狀況和土地利用方式等諸多環(huán)境因素與土壤N2O排放通量密切相關(guān)。（1）土壤底物濃度（如碳、氮含量等）影響N2O排放。土壤大團(tuán)聚體中有機(jī)碳和總氮的濃度顯著高于微團(tuán)聚體，且易于分解[74-75]。研究表明，土壤有機(jī)碳和總氮含量與細(xì)菌和古菌的amoA基因豐度以及硝化速率密切相關(guān)[70]；有機(jī)碳和 NO3-濃度是反硝化細(xì)菌活性和N2O排放的關(guān)鍵影響因素[76]?；钚杂袡C(jī)碳能夠加快微生物繁殖，形成厭氧環(huán)境促進(jìn)反硝化作用發(fā)生[77]。有機(jī)碳的增加導(dǎo)致反硝化作用最終產(chǎn)物為N2[78]。葡萄糖有機(jī)碳的添加，顯著的提高N2/N2O比例[79]。 NO3-是硝化作用的產(chǎn)物，其濃度升高可能抑制硝化和亞硝化微生 物活性，從而弱化硝化反應(yīng)[80]。土壤微團(tuán)聚體 NO-3含量高，導(dǎo)致微團(tuán)聚體硝化反應(yīng)速率較小團(tuán)聚體更慢[70]。非厭氧環(huán)境條件下，高的 NO-3抑制N2O還原為N2[81]。（2）土壤含水量決定了液體和氣體擴(kuò)散速率，影響微生物碳、氮供給過程[82]。土壤孔隙充水度（Water-filled pore space，WFPS）介于35%～60%時(shí)，硝化作用是N2O產(chǎn)生的主導(dǎo)過程；WFPS超過70%時(shí)，N2O主要由反硝化作用產(chǎn)生；WFPS>90%則較多的N2O還原為N2[83-84]。值得注意的是，不同粒徑團(tuán)聚體中主導(dǎo)N2O產(chǎn)生的硝化和反硝化過程的土壤含水量閾值有所差異。大團(tuán)聚體在80%WFPS仍處于好氧條件；而當(dāng)土壤含水量超過60%WFPS，微團(tuán)聚體中反硝化過程產(chǎn)生更多的N2O[21]。這也證實(shí)60% WFPS是硝化細(xì)菌作用的臨界閾值，大團(tuán)聚體雖然處于好氧狀態(tài)，但是土壤水分條件已不再適宜硝化作用發(fā)生。相比于大團(tuán)聚體，土壤微團(tuán)聚體持水作用強(qiáng)，長期處于厭氧狀態(tài)，在N2O產(chǎn)生過程中反硝化作用占優(yōu)勢[21，74]。（3）土壤通氣性：微生物產(chǎn)生的N2O在傳輸過程中受土壤通氣性的顯著影響。與黏壤土相比，砂壤土中N2O通量較大，說明土壤孔隙結(jié)構(gòu)對氣體排放具有控制作用[23]。大團(tuán)聚體中相對較高的孔隙度利于氧氣擴(kuò)散，提高基質(zhì)分解速率，降低底物濃度，從而減少細(xì)菌的多樣性[74]。隨著土壤團(tuán)聚體粒徑減少，透氣性顯著減弱（微團(tuán)聚體<小團(tuán)聚體<大團(tuán)聚體），微團(tuán)聚體中氧氣擴(kuò)散受抑制，可能釋放更多的N2O[20]。在0.5%和3%（體積比）的氧濃度下，氨氧化菌（AOB）反硝化作用對N2O的產(chǎn)生占其主導(dǎo)作用，而在完全厭氧的環(huán)境中，N2O完全由異養(yǎng)反硝化作用產(chǎn)生[85-86]。厭氧低濃度 NO-3條件下，土壤N2O排放速率高于非厭氧高濃度 NO-3條件[15]，說明土壤通氣性改變了硝態(tài)氮對N2O排放的影響效果。此外，其他環(huán)境條件（如土地利用方式、外源氮素的增加等）主要通過影響微生物所需的營養(yǎng)底物、水分和通氣條件間接影響土壤團(tuán)聚體N2O產(chǎn)生和還原能力。（4）土地利用方式：An等[87]對林地和草地土壤團(tuán)聚體穩(wěn)定性及有機(jī)碳和氮含量研究表明，不同土地利用方式下土壤團(tuán)聚體的穩(wěn)定性表現(xiàn)為：林地>耕地>牧草地，在所有土地利用類型中大團(tuán)聚體有機(jī)碳含量較微團(tuán)聚體高，而微團(tuán)聚體碳氮比較大團(tuán)聚體低，說明土壤有機(jī)碳在微團(tuán)聚體中較大團(tuán)聚體更穩(wěn)定。Zhu等[88]也發(fā)現(xiàn)相似的結(jié)果，草地的有機(jī)碳含量和土壤團(tuán)聚體穩(wěn)定性均顯著低于農(nóng)田。林地與草地和農(nóng)田相比，土壤團(tuán)聚體含水量最高，草地大團(tuán)聚體（>0.5 mm）的硝態(tài)氮含量明顯低于其他土地利用類型[9]。不同土地利用方式下，土壤團(tuán)聚體穩(wěn)定性、底物含量、土壤含水量等存在差異，進(jìn)而影響N2O排放。Vilain等[89]研究指出，N2O排放量最多的是農(nóng)田，其次為草地，林地排放量最少。石洪艾等[90]也發(fā)現(xiàn)由于底物和水分含量影響，相較于草地和撂荒地，在農(nóng)田N2O的排放量最多。（5）外源氮素的增加：氮添加能夠通過改變土壤團(tuán)聚體穩(wěn)定性和碳、氮含量而影響N2O排放。氮添加能夠提高土壤大團(tuán)聚體（>0.25 mm）有機(jī)碳和全氮含量，尤以0.25～2 mm粒徑團(tuán)聚體最為顯著[91]。氮添加可以增加大團(tuán)聚體中產(chǎn)生N2O的真菌數(shù)量[92]，同時(shí)增加微團(tuán)聚體中反硝化細(xì)菌以及大團(tuán)聚體中硝化細(xì)菌的豐度[46]。由此可見，外界環(huán)境的變化可以影響土壤團(tuán)聚體內(nèi)微生物的群落結(jié)構(gòu)和分布，進(jìn)而影響土壤N2O的排放。

4 不同粒徑土壤團(tuán)聚體N2O排放功能基因分布

氮循環(huán)功能基因可作為一項(xiàng)指標(biāo)來衡量N2O排放。目前已有研究表明，土壤N2O產(chǎn)生潛力能用amoA、narG基因表征，N2O還原強(qiáng)度可通過nosZ基因豐度反映[93-94]。Rasche等[95]發(fā)現(xiàn)古細(xì)菌amoA、nirS和nosZ基因豐度與土壤N2O排放呈正相關(guān)。反硝化功能基因napA、narG、nirK、nirS、nosZ基因能評估N2O排放潛力；產(chǎn)生N2O功能基因（nirS/nirK）及其還原功能基因（nosZ）之間的差異也可預(yù)測N2O排放[96]。因此，通過提高nosZ反硝化基因豐度，降低土壤（nirK+nirS）/nosZ比值，可使N2O還原大于產(chǎn)生，從而減少N2O排放[76，97]。

不同粒徑土壤團(tuán)聚體中微生物群落分布不同，攜帶的功能基因也存在一定差異（表2），導(dǎo)致其N2O產(chǎn)生和還原熱區(qū)也不一致。Xin等[98]在長期耕種的水稻生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)AOA和AOB的amoA基因主要分布在小團(tuán)聚體內(nèi)（0.25～2 mm）；Blaud等[9]研究發(fā)現(xiàn)，林地和草地中nifH、amoA bacteria、narG、nirS和nosZ在小團(tuán)聚體中（0.25～0.5 mm）分布最多，而這些功能基因在農(nóng)田土壤中主要分布于<0.25 mm的微團(tuán)聚體。Kong等[72]研究表明amoA和nosZ基因在微團(tuán)聚體（0.053～0.25 mm）中分布最多，同時(shí)在>0.25 mm的大團(tuán)聚體中，amoA基因豐度較nosZ低。周漢昌等[10]采用室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)研究了氮循環(huán)關(guān)鍵功能基因在不同粒徑土壤團(tuán)聚體中的分布，發(fā)現(xiàn)<1 mm的土壤團(tuán)聚體中narG和nosZ基因豐度均高于4～8 mm團(tuán)聚體，且隨著團(tuán)聚體粒徑增加而減少，narG和nosZ基因豐度與N2O排放呈正相關(guān)關(guān)系。大量研究結(jié)果表明，氮循環(huán)關(guān)鍵功能基因分布熱區(qū)在微團(tuán)聚體（0.053～0.25 mm）和小團(tuán)聚體（0.25～2.0 mm），且N2O產(chǎn)生和還原的功能基因nirS和nosZ分布趨勢一致。由此可以看出，微團(tuán)聚體和小團(tuán)聚體可能是N2O產(chǎn)生和還原的熱區(qū)，而N2O產(chǎn)生和還原的相對貢獻(xiàn)目前無法量化，因而尚不能通過nirS和nosZ豐度準(zhǔn)確預(yù)測不同粒徑團(tuán)聚體N2O排放速率。微團(tuán)聚體功能基因豐度高，可能是因?yàn)槲F(tuán)聚體相比大團(tuán)聚體更加穩(wěn)定，利于硝化/反硝化微生物的棲息與被保護(hù)。值得注意的是，如果微團(tuán)聚體中養(yǎng)分虧缺、競爭激烈，微生物可能會選擇更大的團(tuán)聚體作為棲息地。不同土地利用方式、土壤含水量以及底物濃度也會影響N2O產(chǎn)生和還原的功能基因在土壤團(tuán)聚體中的分布。

表2 不同粒徑團(tuán)聚體N2O排放速率及功能基因分布 Table 2 Distribution of functional genes and N2O emission rate in different sizes of soil aggregates

但是Liu等[99]研究表明：在長期的重復(fù)火災(zāi)作用下，環(huán)境因素而非反硝化基因豐度控制N2O排放?？赡苡捎谏鲜龉ぷ鲀H分析了反硝化相關(guān)功能基因豐度，并未涉及其他N2O產(chǎn)生排放過程[100]。因此，通過功能基因豐度直接量化N2O排放趨勢還存在一定的不確定性，需充分考慮土壤基本性質(zhì)和環(huán)境因素。

5 總結(jié)與展望

土壤團(tuán)聚體是微生物進(jìn)行硝化/反硝化作用的生化反應(yīng)器。不同粒徑土壤團(tuán)聚體中孔隙特征、通氣條件、底物濃度以及水分含量等性狀分異能改變微生物群落結(jié)構(gòu)和活性，從而導(dǎo)致不同粒徑團(tuán)聚體中N2O排放差異較大。目前功能微生物對N2O排放的研究重心逐漸從全土尺度轉(zhuǎn)移到團(tuán)聚體尺度，聚焦于微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性以及功能微生物與團(tuán)聚體的生物物理關(guān)聯(lián)機(jī)制下N2O排放研究。

今后的研究主要加強(qiáng)以下幾個方面：

1）土壤團(tuán)聚體N2O產(chǎn)生和還原熱區(qū)探究。土壤團(tuán)聚體內(nèi)部和周圍孔隙是微生物存活的生境，有機(jī)質(zhì)、氧氣濃度、水分條件和底物成分等差異可能是導(dǎo)致微生物群落差異的主要驅(qū)動因素。土壤大團(tuán)聚體通氣條件好，可利用有機(jī)碳含量高，但是容易被外界環(huán)境因素?cái)_動，而微團(tuán)聚體內(nèi)部可能是微生物相對穩(wěn)定和隱蔽的棲息地。微團(tuán)聚體具有長期穩(wěn)定的碳庫，能夠持續(xù)為硝化/反硝化微生物提供生長環(huán)境，并且可能為微生物提供物理保護(hù)。近年來大量研究表明微團(tuán)聚體內(nèi)存在較高的微生物豐度，氮循環(huán)功能基因也在微團(tuán)聚體中大量分布。但是目前對土壤團(tuán)聚體中氮循環(huán)功能基因分布特征研究較少，尚不能明確功能微生物對土壤微團(tuán)聚體粒徑的偏好。今后還需要結(jié)合室內(nèi)控制試驗(yàn)和環(huán)境因子梯度，明確N2O產(chǎn)生和還原的潛在熱區(qū)，進(jìn)一步探究微團(tuán)聚體和大團(tuán)聚體對N2O排放的貢獻(xiàn)。

2）環(huán)境因子閾值范圍確定。大團(tuán)聚體和微團(tuán)聚體均可能為硝化/反硝化微生物提供有利的生境，不同粒徑土壤團(tuán)聚體N2O排放潛勢存在差異，可能是由底物濃度、通氣條件以及水分含量等異質(zhì)性引起。一旦外界環(huán)境壓力超出閾值范圍，則對參與硝化/反硝化過程的微生物生存產(chǎn)生脅迫，從而改變硝化/反硝化過程中N2O排放。通過研究確定環(huán)境因子的臨界范圍，可進(jìn)一步明晰不同粒徑土壤團(tuán)聚體N2O產(chǎn)生和還原所占的比例，可初步判斷N2O排放情況，有利于更好地分析硝化/反硝化對N2O的貢獻(xiàn)率以及微生物驅(qū)動機(jī)制。

3）對系列功能基因（酶）開展整體性研究，而不僅是單個主要基因（酶）。硝化/反硝化過程能夠在微生物體內(nèi)發(fā)生，并排放N2O，是一系列功能基因和酶的運(yùn)轉(zhuǎn)，而非某一個功能基因和酶發(fā)揮作用。例如：目前用nosZ/（nirS+nirK）或者（nirS+nirK）/nosZ來衡量N2O排放，僅關(guān)注了反硝化在N2O排放中的關(guān)鍵作用，而忽略了其他作用的功能基因?qū)2O排放的貢獻(xiàn)。雖然針對個別主要的功能基因能夠突出研究重點(diǎn)，但是也可能造成氮循環(huán)功能基因認(rèn)識的盲區(qū)，甚至是誤區(qū)。因此，結(jié)合其他過程的功能基因（酶）展開研究，探究不同途徑（如硝化作用、硝酸鹽異化還原成銨、共反硝化作用等）對N2O排放的相對貢獻(xiàn)。發(fā)掘這些功能基因是否能夠和N2O排放建立相互關(guān)系以及這些基因（酶）之間互相的調(diào)控機(jī)制。功能基因和酶的活性相結(jié)合可能會成為衡量N2O排放潛勢的新途徑。功能基因不能夠完全用來量化N2O排放潛勢，N2O產(chǎn)生不僅由微生物活性決定，硝化/反硝化過程中酶的活性也是N2O產(chǎn)生的決定性因素。為此，將功能基因和酶結(jié)合研究，可能是量化N2O排放潛勢的有效途徑。