王俊霖，招 茵，蘇茵茵，周詩(shī)慧，曾福源，謝 妙，王 娜，簡(jiǎn)紀(jì)常，龐歡瑛

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院// 廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室// 廣東省教育廳水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病害控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524088；2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100176）

溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）為嗜鹽嗜溫性的革蘭陰性菌[1-2]，普遍存在于海洋環(huán)境和多種海洋動(dòng)物中，是魚(yú)、蝦、貝等海水養(yǎng)殖動(dòng)物的主要致病菌之一[3]。此外，該菌可導(dǎo)致人類的食物中毒、中耳炎、頭痛、乏力以及敗血癥等多種疾病[4]。

III 型分泌系統(tǒng) (Type III secretion system，T3SS)是多數(shù)革蘭陰性菌的重要毒力因子，其功能是將細(xì)菌效應(yīng)蛋白注射至宿主細(xì)胞中，最終導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡[5-6]。近年來(lái)，關(guān)于細(xì)菌T3SS 的結(jié)構(gòu)、裝配以及致病機(jī)理研究取得較大進(jìn)展，研究較為深入的有副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）[7]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[8]、哈維弧菌（Vibrio harveyi）、嗜水氣單胞菌 (Aeromonas hydrophila)[9]等。有關(guān)溶藻弧菌T3SS 的研究主要集中在裝置蛋白[10-12]、效應(yīng)蛋白[13-15]，而對(duì)調(diào)控蛋白的研究報(bào)道較少。

在銅綠假單胞菌中，ExsD 是T3SS 的負(fù)調(diào)控因子[16]，對(duì)T3SS 分泌相關(guān)蛋白、調(diào)節(jié)蛋白和效應(yīng)蛋白有顯著抑制作用[17-18]。副溶血弧菌的T3SS1 主要受ExsACDE 操縱子調(diào)控，在誘導(dǎo)條件下，ExsA 通過(guò)結(jié)合T3SS1 結(jié)構(gòu)基因和效應(yīng)蛋白基因的啟動(dòng)子來(lái)介導(dǎo)T3SS1 的細(xì)胞毒性，ExsD 蛋白可直接與ExsA 蛋白結(jié)合，阻斷T3SS1 的分泌；ExsC 蛋白可直接與ExsD 蛋白結(jié)合，從而免去其對(duì)ExsA 蛋白的抑制作用，促進(jìn)T3SS1 的表達(dá)，即ExsA 和ExsC是T3SS1 的正向調(diào)控子，ExsD 是T3SS1 的負(fù)向調(diào)控子[8]。然而，目前尚鮮見(jiàn)有關(guān)溶藻弧菌T3SS 調(diào)控蛋白ExsD 表型的研究報(bào)道。

本研究通過(guò)overlapPCR 和同源重組技術(shù)，構(gòu)建缺失株ΔexsD，并比較其生長(zhǎng)、泳動(dòng)能力、胞外酶活性、生物膜形成能力、藥物敏感度、毒力等與野生株HY9901 的差異，為進(jìn)一步研究溶藻弧菌ExsD蛋白的功能和T3SS 的致病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株與質(zhì)粒 溶藻弧菌野生株HY9901 為廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；同源重組菌株S17-1λpir (TPR，SMR，ΛPIR)，Biovector Co.,LTD；大腸桿菌感受態(tài)BL21(DE3)，北京全式金生物公司；自殺質(zhì)粒 pDM4(SACB，CMR)，Biovector Co.,LTD，引物見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)用引物Table1 Primers used in this study

1.2 方法

1.2.1缺失株的構(gòu)建 參照Milton 等[19]方法，用引物ExsD-A1-F/ExsD-A1-R 和ExsD-A2-F/ExsD-A2-R對(duì)exsD編碼序列上下游同源臂進(jìn)行擴(kuò)增。除BglII和SalI 限制位點(diǎn)序列外，兩個(gè)擴(kuò)增片段均含有10 bp的重疊序列。將這些產(chǎn)物作為“splicing by overlap extension”(SOE) PCR 的模板，利用引物ExsD-A1-F和ExsD-A2-R 擴(kuò)增融合片段。全片段用BglII 和SalI酶切，連接到自殺載體 pDM4(酶切)，生成pDM4-exsD-A1F+A2R。將所得質(zhì)粒電穿孔至大腸桿菌 S17-1，通過(guò)電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入溶藻弧菌菌株HY9901。用氨芐西林和氯霉素在TSA 板上篩選成功轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的單克隆菌株。取若干插入突變單菌落，劃線于LB平板 (4 g/LL-阿拉伯糖) 中，置28 ℃下培養(yǎng)18 h。挑取平板上菌落，以引物ExsD-A1-F/ExsD-A2-R 檢測(cè)單菌落，野生型溶藻弧菌作為對(duì)照。單菌落純化后，再次進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證缺失株ΔexsD是否構(gòu)建成功。

1.2.2缺失株ΔexsD的驗(yàn)證 參照馮建儒等[20]的方法，提取野生株HY9901 和缺失株ΔexsD的RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用引物ExsD-F/ExsD-R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增驗(yàn)證。

1.2.3突變株的遺傳穩(wěn)定性檢驗(yàn) 將缺失株ΔexsD在TSB培養(yǎng)基上連續(xù)傳代30次，用引物ExsD-A1-F/ExsD-A2-R 進(jìn)行PCR 及電泳檢測(cè)，確定ΔexsD是否可穩(wěn)定遺傳。

1.2.4生長(zhǎng)曲線測(cè)定 挑選溶藻弧菌野生株HY9901、缺失株ΔexsD單菌落，接種于新鮮TSB培養(yǎng)基，在D(600 nm)=0.5 時(shí)按照1∶100 的比例接種到新鮮培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在此期間，每2 h取樣1 次。以時(shí)間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，D(600 nm)為橫坐標(biāo)繪制兩株菌株的生長(zhǎng)曲線。每個(gè)樣品設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

1.2.5細(xì)菌泳動(dòng)實(shí)驗(yàn) 配制LBS 培養(yǎng)基（在LB 培養(yǎng)基中添加20 g/L 的NaCl、3 g/L 的瓊脂[21]，分別用牙簽挑取溶藻弧菌野生株HY9901、缺失株ΔexsD單菌落以垂直的方式插入到上述平板，注意彼此之間的距離。于28 ℃條件下靜置培養(yǎng)7 h，測(cè)量泳動(dòng)圈的直徑。

1.2.6胞外蛋白酶活性檢測(cè) 將高壓滅菌后烘干的玻璃紙平鋪在含有1.5%瓊脂的TSA 平板上。吸取D(600 nm)=0.5 的溶藻弧菌野生株HY9901、缺失株ΔexsD各100 μL，涂布于含有玻璃紙的TSA 平板，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。用4 mL 無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（PBS）緩慢吹打、洗滌玻璃紙，洗滌液于4 ℃、10 000g條件下離心0.5 h。將上清液過(guò)0.22 μm 的微孔濾網(wǎng)，得到細(xì)菌的胞外產(chǎn)物，4 ℃下保存。

分別取溶藻弧菌野生株HY9901、缺失株ΔexsD的胞外產(chǎn)物100 μL，分別加入100 μL 0.5 g/L 的偶氮酪蛋白溶液，混勻。補(bǔ)加pH 8.0 的Tris-HCl 溶液，于37 ℃下孵育0.5 h。加入100 g/L 的三氯乙酸400 μL，室溫下孵育0.5 h，終止反應(yīng)。以12 000g離心5 min，取上清液，加入0.525 mol/L 的NaOH 溶液800 μL 進(jìn)行顯色反應(yīng)，用酶標(biāo)儀測(cè)定D(442 nm)。用煮沸后樣品作為空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

用軟件SPSS12.0 進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan 多重比較，根據(jù)P值確定顯著性。

1.2.7藥敏實(shí)驗(yàn) 用紙片擴(kuò)散法測(cè)定菌株對(duì)30 種抗生素的敏感性。測(cè)定抑菌圈直徑，通過(guò)比對(duì)說(shuō)明書(shū)判讀結(jié)果。

1.2.8半數(shù)致死量LD50測(cè)定 分別接種 HY9901、ΔexsD的單克隆至TSB 中，搖床振蕩培養(yǎng)18 h，以1∶100 比例重新接種到新的TSB 中，培養(yǎng)至D(600 nm)=1.00，以5 000 r/min 離心3 min，收集菌體，用PBS 清洗2 次，并調(diào)節(jié)至梯度濃度108、107、106、105、104，以PBS 為空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)用斑馬魚(yú)（Danio rerio）共180 尾，隨機(jī)分組，每組10 尾。實(shí)驗(yàn)組以肌肉注射方式每尾注射5 μL 菌液。對(duì)照組以同樣方式注射等量PBS。每組設(shè)置3 個(gè)重復(fù)組。記錄7 d 內(nèi)魚(yú)體死亡數(shù)，直至死亡情況穩(wěn)定。用寇氏法計(jì)算半數(shù)致死量。

1.2.9生物膜厚度檢測(cè) 結(jié)晶紫染色。挑取溶藻弧菌野生株HY9901、缺失株ΔexsD單菌落接種于5 mL 新鮮的TSB，培養(yǎng)至D(600 nm)=0.5。按照1∶10 比例稀釋菌液，分別接種于無(wú)菌的96 孔板，每孔加100 μL，28 ℃下分別培養(yǎng)6、12、24、48、72 h。72 h 后用無(wú)菌PBS 300 mL 輕輕洗掉菌液，重復(fù)3 次，倒置晾干。加150 μL 甲醇固定20 min，倒置30 min，晾干。用每孔加150 μL 的結(jié)晶紫草酸銨溶液，染色15 min；用自來(lái)水輕輕沖洗掉，倒置晾干。每孔加入150 μL 的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，室溫放置30 min，在D(570 nm)條件下測(cè)定，以新鮮的TSB 溶液為陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

共聚焦顯微鏡觀察及測(cè)定[22]。將野生株HY9901 及缺失株ΔexsD接種到新鮮TSB 培養(yǎng)基，于28 ℃下震蕩培養(yǎng)24 h，將菌液D(600 nm)調(diào)至0.5，以1∶50 比例加至NEST 玻底培養(yǎng)皿中，37 ℃下靜置培養(yǎng)24 h。用8.5 g/L 生理鹽水清洗3 次，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% SYTO9 綠色熒光染料，置黑暗處染色20 min。用生理鹽水清洗3次，加入100 μL 40% 生理鹽水-甘油，進(jìn)行共聚焦顯微鏡觀察。激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，掃描從底部至頂部的生物膜，測(cè)定膜厚度。

1.2.10T3SS 相關(guān)基因的表達(dá)分析 用高糖培養(yǎng)基（Dulbecco’s Modified Eagle，DMEM）誘導(dǎo)T3SS分泌，T3SS 相關(guān)基因的引物如表1 所示，16S rRNA用作內(nèi)部參考。根據(jù)Li 等[23]方法提取RNA，用合成cDNA 和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 分析T3SS 的hop基因[14-15]在不同時(shí)段的表達(dá)量。

1.2.11數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 缺失株ΔexsD 的構(gòu)建及驗(yàn)證

圖1 可見(jiàn)，正確的缺失突變克隆擴(kuò)增產(chǎn)生948 bp 片段，野生型擴(kuò)增片段長(zhǎng)1 788 bp。

圖1 缺失株ΔexsD 的構(gòu)建Fig.1 Construction of the mutant strain ΔexsD

克隆純化后，再次擴(kuò)增驗(yàn)證，并遞交PCR 產(chǎn)物測(cè)序，測(cè)序結(jié)果證實(shí)，exsD缺失突變株構(gòu)建成功。

野生株和缺失株ΔexsD接種培養(yǎng)18 h 后，成功提取到完整的RNA（圖2(A)）。特定引物ExsD-F/ExsD-R 擴(kuò)增結(jié)果表明，野生株HY9901 處有981 bp的條帶，缺失株ΔexsD擴(kuò)增不出條帶（圖2(B)），證明已成功構(gòu)建缺失株ΔexsD。

圖2 缺失株ΔexsD 的驗(yàn)證Fig.2 Verification of the mutant strain ΔexsD

2.2 突變株的遺傳穩(wěn)定性

野生株HY9901 及缺失株ΔexsD均經(jīng)連續(xù)傳代30 代，野生株可檢測(cè)到1 788 bp 的片段，缺失株ΔexsD得到948 bp 的片段，表明溶藻弧菌HY9901在缺失基因exsD情況下依舊可穩(wěn)定遺傳（圖3）。

圖3 ΔexsD 的遺傳穩(wěn)定性分析Fig.3 Genetic stability detection of deletion mutant ΔexsD

2.3 生長(zhǎng)曲線

比較野生株HY9901 和缺失株ΔexsD在TSB中的生長(zhǎng)曲線（圖4）可知，兩株菌生長(zhǎng)基本一致，說(shuō)明ΔexsD基因缺失不會(huì)影響菌株生長(zhǎng)。兩株菌的繁殖速度均較快，2～ 6 h 時(shí)達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)。

圖4 缺失株ΔexsD 與HY9901 生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth rates of HY9901 ΔexsD and HY9901

2.4 泳動(dòng)能力

圖5 可知，與溶藻弧菌野生株HY9901 比較，缺失株ΔexsD泳動(dòng)能力極顯著上升（P＜ 0.01）。

圖5 泳動(dòng)能力Fig.5 Swimming motility

2.5 胞外蛋白酶活性

圖6 表明，與溶藻弧菌野生株比較，缺失株ΔexsD的酶活性顯著上升（P＜ 0.05）。

圖6 胞外蛋白酶活性Fig.6 Activity of ECPase

2.6 藥敏試驗(yàn)

表2 可見(jiàn)，溶藻弧菌野生株HY9901 與缺失株對(duì)多數(shù)抗生素耐藥，相較于野生株，exsD基因的缺失，使菌株對(duì)米諾環(huán)素、慶大霉素、卡那霉素、多西環(huán)素、新霉素的敏感性從耐藥變成中度敏感。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Drug sensitivity test results of the HY9901 and HY9901 ΔexsD

2.7 半數(shù)致死量LD50

由表3 可知，與野生株比較，突變株ΔexsD對(duì)斑馬魚(yú)的半數(shù)致死劑量下降，是前者的1/3.68，表明exsD基因缺失影響了溶藻弧菌的致病性，導(dǎo)致毒力上升。

表3 溶藻弧菌HY9901、突變株ΔexsD 對(duì)斑馬魚(yú)的LD50Table 3 LD50 of HY9901 and ΔexsD for zebrafish

2.8 生物膜厚度

圖7 可見(jiàn)，溶藻弧菌野生株HY9901 和缺失株ΔexsD形成生物膜的能力在前48 h 略有不同，48 h后則差別不大，在24 h 時(shí)缺失株ΔexsD生物膜（0.62）明顯厚于野生株HY9901（0.36）（P＜ 0.05）。

圖7 野生株、缺失株ΔexsD 的生物膜Fig.7 Biomembrane thickness of HY9901 and its ΔexsD

共聚焦電鏡（24 h）的結(jié)果如圖8 所示，相對(duì)于野生株HY9901，缺失株ΔexsD生物膜厚度顯著增加（P＜ 0.05），與結(jié)晶紫染色結(jié)果相符。

圖8 野生株、缺失株ΔexsD 的生物膜（共聚焦電鏡）Fig.8 Measurement of biofilm by LSCM

2.9 mRNA 表達(dá)差異

圖9 表明，與HY9901 野生型相比，ΔexsD組hop的表達(dá)量在18、24、36、48、72 h 時(shí)均極顯著上升（P＜ 0.01）（圖9）。

圖9 HY9901 和ΔexsD 在DMEM 中T3SS 效應(yīng)蛋白基因hop 的mRNA 表達(dá)Fig.9 Expression of T3SS effector protein gene hop of HY9901 and ΔexsD induced by DMEM

3 討論

細(xì)菌毒力因子T3SS 表達(dá)與分泌受環(huán)境和相關(guān)調(diào)控蛋白ExsAD 的影響，部分細(xì)菌exsD基因有負(fù)調(diào)控T3SS 的作用，但調(diào)控機(jī)制復(fù)雜。如銅綠假單胞菌可與真核細(xì)胞接觸，或在特定環(huán)境條件下誘導(dǎo)T3SS 表達(dá)分泌[16]。T3SS 由ExsA 蛋白直接調(diào)控，而ExsCDE 三個(gè)蛋白可感應(yīng)胞外Ca2+濃度來(lái)調(diào)控ExsA 的轉(zhuǎn)錄活性[8,24-25]。為檢測(cè)銅綠假單胞菌ExsD 對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響，Michelle 等[16]通過(guò)LacZ 報(bào)告基因融合實(shí)驗(yàn)表明，exsD基因的缺失顯著促進(jìn)了T3SS 分泌，及調(diào)節(jié)蛋白和效應(yīng)蛋白的表達(dá)。又如，Zhou 等[26-27]發(fā)現(xiàn)，副溶血弧菌在LB-S 培養(yǎng)基生長(zhǎng)時(shí)，exsD基因的缺失激活T3SS1 基因的轉(zhuǎn)錄，而野生株exsD基因的回補(bǔ)抑制了其基因的轉(zhuǎn)錄；當(dāng)在DMEM 中生長(zhǎng)時(shí)，副溶血弧菌ExsD 在NY-4 中的過(guò)表達(dá)阻止了T3SS1 基因的轉(zhuǎn)錄，表明ExsD 為負(fù)向轉(zhuǎn)錄調(diào)控；ExsD 直接與ExsA 結(jié)合，并可能阻止ExsA 與T3SS1 基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合。Liu 等[28]確定，經(jīng)典的銅綠假單胞菌ExsACDE 蛋白-蛋白調(diào)控模型適用于溶藻弧菌，并在溶藻弧菌中證實(shí)ExsA和ExsC 正調(diào)控T3SS，ExsD 和ExsE 負(fù)調(diào)控T3SS。然而，溶藻弧菌T3SS ExsD 蛋白的表型與具體調(diào)控機(jī)制還未充分闡明，本研究敲除溶藻弧菌T3SS 的調(diào)控基因exsD，并分析其表型特征，可為進(jìn)一步闡明exsD功能提供依據(jù)。

端生鞭毛及眾多周生鞭毛是細(xì)菌表面附屬結(jié)構(gòu)的重要組成部分，影響弧菌的泳動(dòng)力，鞭毛調(diào)控蛋白可直接影響細(xì)菌泳動(dòng)能力[29-30]。劉文竹[31]報(bào)道，溶藻弧菌tssj基因的缺失可影響溶藻弧菌鞭毛的生成，減弱突變株的泳動(dòng)能力。本研究中，野生株HY9901 與缺失株ΔexsD泳動(dòng)能力差異極其顯著（P＜ 0.01），exsD基因的缺失增強(qiáng)了突變株的泳動(dòng)能力，表明ExsD 蛋白與溶藻弧菌的泳動(dòng)能力之間相互關(guān)聯(lián)，推測(cè)exsD基因?qū)θ茉寤【廾纳苫虮廾鞍椎谋磉_(dá)以及泳動(dòng)能力為負(fù)調(diào)控影響。

胞外酶是一類多種活性酶的總稱，也是病原菌致病的主要毒力因子之一，可以特殊形式在宿主體內(nèi)增殖，輕者破壞宿主免疫系統(tǒng)，重者使宿主細(xì)胞發(fā)生溶解進(jìn)而死亡[32]。致病性弧菌的胞外產(chǎn)物有多種酶活性，許兵等[33]用杯碟法測(cè)出溶藻弧菌的胞外產(chǎn)物，且對(duì)對(duì)蝦有致死作用，其中蛋白酶成分是決定病原菌致病性的重要因素。本研究中，缺失株ΔexsD的蛋白酶活性相對(duì)于野生株HY9901 顯著上升（P＜ 0.05），推測(cè)ExsD 蛋白可通過(guò)調(diào)控其他效應(yīng)蛋白，或與其他調(diào)控蛋白協(xié)同作用降低溶藻弧菌的蛋白酶活性。然而ExsD 蛋白如何影響溶藻弧菌蛋白酶活性，還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

目前，對(duì)溶藻弧菌病防治以抗生素為主，但長(zhǎng)期大量使用抗生素會(huì)使溶藻弧菌產(chǎn)生耐藥性[34-35]。另一方面，細(xì)菌的耐藥性也可通過(guò)耐藥質(zhì)粒接合、轉(zhuǎn)導(dǎo)的傳播作用或從其他攜帶耐藥基因的鐵載體上獲得[36-37]。溶藻弧菌存在耐藥基因[38-39]，胡夢(mèng)華等[39]研究發(fā)現(xiàn)，溶藻弧菌菌株VA-76 攜帶arr-2、drfA27、strA、strB、floR、cat和qnrvC耐藥基因，既有一定的致病能力，且對(duì)多種抗生素耐藥。本研究中，溶藻弧菌HY9901 與缺失株ΔexsD也對(duì)大多數(shù)抗生素耐藥，與野生株相比，exsD基因的缺失，使其對(duì)米諾環(huán)素、慶大霉素、卡那霉素、多西環(huán)素、新霉素五種抗生素的耐藥性從耐藥變成中度敏感。這可能說(shuō)明exsD可直接或間接調(diào)控相關(guān)耐藥基因的表達(dá)。而細(xì)菌的生物膜可促進(jìn)細(xì)菌抵御抗生素，在臨床上引起多重耐藥性[40]，本研究中，在6 h 前，ΔexsD形成生物膜能力弱于野生株，這也可能是細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性從耐藥到敏感的原因之一。

細(xì)菌可特異性和選擇性地在介質(zhì)表面黏附，生成一層生物膜，有減輕抗生素干擾并在宿主免疫防御中保護(hù)自身作用[41]。本研究通過(guò)結(jié)晶紫染色和共聚焦掃描兩種方法證明，缺失株ΔexsD形成生物膜能力在24 h 時(shí)高于野生株，說(shuō)明exsD基因在細(xì)菌生長(zhǎng)的穩(wěn)定期對(duì)生物膜形成負(fù)調(diào)控。Sara 等[42]與夏飛等[43]報(bào)道，細(xì)菌在致病過(guò)程中，密度感應(yīng)系統(tǒng)發(fā)揮重要作用，有4%～12%基因受其調(diào)控，并直接控制多種毒力因子表達(dá)，包括生物膜形成。因此，ExsD蛋白在細(xì)菌生長(zhǎng)的穩(wěn)定期顯著影響生物膜厚度可能與密度感應(yīng)現(xiàn)象有關(guān)，這需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

細(xì)菌的毒力體現(xiàn)在產(chǎn)毒力和侵染力，它會(huì)與宿主發(fā)生一系列的相互作用，最終產(chǎn)出毒素并侵染宿主[44]。Phan 等[45]發(fā)現(xiàn)，副溶血弧菌缺失株ΔHUs（Δvp0920、Δvp2911）與野生株相比，exsA、exsD、vp1680、vp1671等T3SS1 相關(guān)基因的表達(dá)水平降低，另外在ΔHUs 株中exsD基因額外的缺失，恢復(fù)了T3SS1 相關(guān)基因的表達(dá)水平和細(xì)胞毒性。在張杰等[46]所構(gòu)建的殺香魚(yú)假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida）exsA突變株對(duì)大黃魚(yú)（Larimichthys crocea）的毒力實(shí)驗(yàn)中，與exsA突變株相比，野生株對(duì)大黃魚(yú)的毒力提高190 倍；殺香魚(yú)假單胞菌ExsA 正向調(diào)控T3SS 相關(guān)蛋白的表達(dá)。本研究的缺失株ΔexsD毒力相較于野生株升高了3.68 倍，與殺香魚(yú)假單胞菌和副溶血弧菌的毒力實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

調(diào)控蛋白對(duì)T3SS 的調(diào)控主要是對(duì)效應(yīng)蛋白的調(diào)控[47]。Liu 等[28]研究發(fā)現(xiàn)，溶藻弧菌ExsD 對(duì)效應(yīng)蛋白Va1686 和Va1687 起負(fù)向調(diào)節(jié)作用。Zhou等[48]研究表明，TyeA 可調(diào)節(jié)溶藻弧菌T3SS，可能參與調(diào)節(jié)效應(yīng)蛋白的表達(dá)，在缺失tyeA基因的情況下，顯著上調(diào)效應(yīng)蛋白VopS 和Hop 的mRNA 表達(dá)量。本研究中，exsD基因的缺失同樣也會(huì)增加T3SS效應(yīng)蛋白Hop 的mRNA 表達(dá)量，可能ExsD 與TyeA蛋白一樣，通過(guò)某種方式來(lái)負(fù)調(diào)控T3SS 相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而增加溶藻弧菌效應(yīng)蛋白的表達(dá)。可見(jiàn)，溶藻弧菌T3SS ExsD 蛋白有負(fù)調(diào)控相關(guān)效應(yīng)蛋白的功能，但具體調(diào)控機(jī)制是否與副溶血弧菌、銅綠假單胞菌相似，還需要進(jìn)一步探究。本研究可為后續(xù)T3SS 的調(diào)控機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究采用同源重組和OverlapPCR 技術(shù)成功構(gòu)建溶藻弧菌HY9901 突變株ΔexsD，分析表明，溶藻弧菌exsD基因的缺失，對(duì)溶藻弧菌的遺傳穩(wěn)定性、生長(zhǎng)速度影響不顯著；但導(dǎo)致其泳動(dòng)能力、對(duì)斑馬魚(yú)的致病性極顯著上升，胞外蛋白酶活性和24 h 形成生物膜的能力顯著上升，對(duì)丁胺卡那、慶大霉素、多西環(huán)素、新霉素、氯霉素五種抗生素藥物敏感度從耐藥上升至中等敏感，上調(diào)了T3SS 效應(yīng)蛋白Hop 的表達(dá)。