彭麗瑤，魏桂紅，黃張建，孔 輝，解衛(wèi)平*

1南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥學科，江蘇 南京 210029；2中國藥科大學新藥研究中心天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇 南京 210009

肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一類以肺血管重構及肺血管阻力進行性升高為特征，右心室后負荷逐漸增加，最終導致右心衰竭甚至死亡的進展性疾病。肺血管重構是PAH發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎，主要表現(xiàn)為肺血管內膜增生、中膜肥厚、外膜纖維化及炎癥細胞浸潤等［1］。研究表明，肺動脈外膜是最早響應血管應激或損傷并發(fā)生病理改變的結構［2］。在缺氧、血管擴張等各種因素的作用下，肺動脈外膜成纖維細胞（pulmonary artery adventitia fibroblast，PAAF）作為肺動脈外膜中主要的細胞成分首先被激活，主要表現(xiàn)為細胞的增殖、遷移能力顯著增強，并可以向肌成纖維細胞轉化，產生更多的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）、生長因子、趨化因子以及炎性細胞因子，調節(jié)血管壁細胞的生長，參與肺血管重構過程［3］。

缺氧可以誘導細胞產生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），當ROS 的產生超過了機體抗氧化防御能力時，組織細胞便會出現(xiàn)基因突變、凋亡壞死、脂質過氧化等一系列氧化應激損傷。研究表明，氧化應激可以誘導肺血管過度收縮、肺動脈內皮功能障礙以及肺血管重構，參與PAH的發(fā)生發(fā)展［4］。核轉錄相關因子-2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）是細胞防御氧化應激的主要轉錄調節(jié)因子，在維持細胞的氧化還原平衡及代謝中發(fā)揮重要作用［5］。甲基巴多索隆（bardoxolone methyl，CDDO-Me）是一種新型三萜類齊墩果酸衍生物，可激活Keap1/Nrf2/ARE 信號通路發(fā)揮抗氧化應激作用，在慢性腎病［6］、2型糖尿病［7］、急性肺損傷及肺纖維化［8-9］中具有潛在治療作用。然而目前尚無研究報道其對缺氧誘導的PAAF的影響。本文旨在探索CDDO-Me 對缺氧誘導的PAAF 活化后功能的影響并探討其相關機制。

1 材料和方法

1.1 材料

人PAAF、成纖維細胞培養(yǎng)基（ScienCell 公司，美國），CDDO-Me（中國藥科大學黃張建教授惠贈），CCK-8 試劑盒（同仁公司，日本），轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β1、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、白細胞介素（interleukin，IL）-1β ELISA 檢測試劑盒（武漢華美生物），2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA，Sigma公司，美國），總谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（上海碧云天生物），總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒（南京建成生物工程研究所）。βactin 抗體、α-平滑肌肌動蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）抗體、Ⅰ膠原蛋白（Collagen Ⅰ）抗體、羊抗兔/羊抗鼠二抗（武漢Proteintech 公司），波形蛋白（Vimentin）抗體（Abcam 公司，美國），NF-κB pp65/p65 抗體、p-Smad3/Smad3 抗體（CST 公司，美國），羊抗兔熒光二抗（Invitrogen公司，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及分組

人PAAF 培養(yǎng)于成纖維細胞完全培養(yǎng)基中（含2%胎牛血清、1%成纖維細胞生長因子、100 U/mL青霉素及鏈霉素），置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞生長至70%融合時分組處理，分為4組：常氧組、缺氧組、缺氧+CDDO-Me 組、常氧+CDDO-Me組，其中缺氧組和缺氧+CDDO-Me組置于含5%CO2、1%O2缺氧箱中處理。CDDO-Me在放入缺氧箱前1 h加入。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞活力

收集對數(shù)生長期的人PAAF，按每孔1×104個細胞接種于96 孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h 后棄培養(yǎng)基，按照分組分別加入無血清培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基配制的不同濃度CDDO-Me工作液。1 h后，將缺氧組及缺氧+CDDO-Me組置入缺氧箱中培養(yǎng)。24 h后，棄培養(yǎng)基，每孔加入含10%CCK-8原液的培養(yǎng)基100 μL，孵育4 h，應用酶標儀于450 nm 波長處檢測吸光度。細胞活性=（實驗組吸光度值-空白組吸光度值）/（對照組吸光度值-空白組吸光度值）×100%。

1.2.3 Transwell遷移實驗

收集對數(shù)生長期的人PAAF，PBS洗滌3遍后用無血清培養(yǎng)基將其重懸制成1×105個/mL 的細胞懸液，在Transwell 上室中加入100 μL 細胞懸液，下室中加入600 μL 含所需藥物的完全培養(yǎng)基。根據(jù)分組，置于不同培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后取出小室，棄去上室培養(yǎng)基，用棉簽擦去小室膜上層細胞，多聚甲醛固定，PBS 洗滌，結晶紫染色后于顯微鏡下觀察，使用Image-Pro Plus 圖像分析軟件分析每組遷移至下室的細胞所占面積，計算細胞相對遷移率。

1.2.4 細胞免疫熒光分析

人PAAF以5×104個/孔的密度接種于24孔板細胞爬片上，隔天棄去培養(yǎng)基，藥物處理1 h后分別置于不同培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，PBS清洗后多聚甲醛固定30 min，0.5%TritonX-100 PBS液洗滌20 min，5%BSA室溫封閉1 h，隨后加入一抗α-SMA、p65（1∶200），置于4 ℃冰箱孵育過夜，PBS清洗3次后加入免疫熒光二抗（1∶1 000），置于室溫孵育1 h。PBS清洗后每孔加入Hoechst 33342染核30 min，PBS清洗后用抗熒光淬滅液封片，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 Western blot

收集處理后的人PAAF，PBS洗3遍后加入預冷的RIPA裂解液提取細胞總蛋白。常規(guī)SDS-PAGE凝膠電泳、濕法轉膜，5%脫脂奶粉溶液室溫封閉1 h，隨后加入一抗（1∶1 000）置于4 ℃冰箱孵育過夜。TBST 洗膜后加入二抗（1∶8 000），室溫孵育1 h，洗膜后化學發(fā)光顯影，使用Image Lab圖像分析軟件分析蛋白表達量。

1.2.6 氧化應激水平檢測

ROS 檢測：按照1.2.4 方法培養(yǎng)細胞，24 h 后棄去培養(yǎng)基，每孔加入無血清培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA（10 μmol/L），37 ℃細胞培養(yǎng)箱內孵育20 min。用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3 次，置于熒光顯微鏡下觀察拍照。

GSH、MDA 和SOD 檢測：按照1.2.5 方法收集細胞裂解液，按照試劑盒說明書操作，GSH 檢測在412 nm 波長處測定吸光度、MDA 檢測在532 nm 波長處測定吸光度、SOD檢測在450 nm波長處測定吸光度。

1.2.7 酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）

人PAAF 以5×104個/孔的密度接種于24 孔板中，隔天棄去培養(yǎng)基，藥物處理1 h后分別置入不同培養(yǎng)箱培養(yǎng)，藥物處理24 h后收集細胞上清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。取出細胞上清和ELISA檢測試劑盒室溫復溫30 min，按照試劑盒說明書操作，應用酶標儀于450 nm 波長處檢測各孔吸光度值。應用CurveExpert 軟件制作標準曲線，根據(jù)樣本吸光度值計算細胞因子濃度。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤（）表示，多組間樣本統(tǒng)計分析采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CDDO-Me 對缺氧誘導的PAAF 細胞活力和遷移的影響

CCK-8實驗結果顯示，在常氧條件下，500.0 nmol/L及以下濃度的CDDO-Me 對細胞活力的影響與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖1A），表明500.0 nmol/L 及以下濃度的CDDO-Me 對PAAF 無細胞毒性。缺氧刺激24 h 可以顯著增強PAAF 細胞活力，與常氧組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖1B）；CDDO-Me 可以濃度依賴性地降低缺氧誘導的PAAF 細胞活力的升高，并在250.0 nmol/L 和500.0 nmol/L 濃度時具有顯著抑制作用（P＜0.05），故使用500.0 nmol/L 的CDDO-Me 進行后續(xù)研究。Transwell 遷移實驗結果顯示，與常氧組相比，缺氧組細胞遷移數(shù)量顯著增加，而缺氧+CDDO-Me 組細胞遷移數(shù)量顯著減少（P＜0.05，圖1C、D），提示CDDO-Me 可以顯著抑制缺氧誘導的PAAF 遷移。上述結果表明，缺氧可以誘導PAAF 細胞活力和遷移能力增強，而CDDO-Me可以顯著抑制上述改變。

圖1 CDDO-Me對缺氧誘導的PAAF細胞活力和遷移的影響Figure 1 Effects of CDDO-Me on the viability and migration of PAAF induced by hypoxia

2.2 CDDO-Me 對缺氧誘導的PAAF 向肌成纖維細胞轉化的影響

細胞形態(tài)學結果顯示（圖2A），在常氧條件下PAAF呈現(xiàn)細長紡錘狀，細胞整體長度較長，寬度較窄。在缺氧刺激24 h后，PAAF的胞體寬度增加，細胞呈現(xiàn)肥大改變，而缺氧+CDDO-Me 組的PAAF 細胞肥大程度得到改善。同時，細胞免疫熒光結果顯示（圖2B），與常氧組相比，缺氧組PAAF內α-SMA熒光強度增強，而缺氧+CDDO-Me 組α-SMA 熒光強度相較于缺氧組顯著減弱。Western blot 半定量結果進一步表明，缺氧可以顯著上調PAAF 中肌成纖維細胞標志物Collagen Ⅰ、Vimentin 和α-SMA 的表達水平，與常氧組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖2C～E）。而缺氧+CDDO-Me 組PAAF 的Collagen Ⅰ、Vimentin和α-SMA的表達水平與缺氧組相比顯著下降（P＜0.05）。以上結果表明，CDDO-Me 可以抑制缺氧誘導的PAAF向肌成纖維細胞轉化。

圖2 CDDO-Me對缺氧誘導的PAAF向肌成纖維細胞轉化的影響Figure 2 Effects of CDDO-Me on the myofibroblast transformation of PAAF induced by hypoxia

2.3 CDDO-Me對缺氧誘導的PAAF氧化應激的影響

ROS 檢測結果顯示，與對照組相比，缺氧組PAAF 中ROS 熒光強度顯著增強（P＜0.05，圖3A、B），提示缺氧顯著上調細胞內ROS 水平，而CDDOMe可顯著抑制缺氧誘導的ROS升高，與缺氧組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。此外，缺氧刺激24 h后，PAAF 中反映細胞氧化損傷程度的重要指標MDA 的表達水平顯著上調，發(fā)揮細胞抗氧化作用的GSH和SOD表達水平顯著下調（P＜0.05，圖3C～E）。與缺氧組相比，CDDO-Me可以顯著抑制缺氧誘導的MDA產生，并上調GSH和SOD表達水平（P＜0.05）。

圖3 CDDO-Me對缺氧誘導的PAAF氧化應激的影響Figure 3 Effects of CDDO-Me on the oxidative stress of PAAF induced by hypoxia

2.4 CDDO-Me 對缺氧誘導的PAAF 中TGF-β1/Smad3信號通路的影響

ELISA（圖4A）及Western blot 結果（圖4B）顯示，與對照組相比，缺氧組PAAF合成分泌的細胞因子TGF-β1水平顯著升高，Smad3磷酸化水平顯著上調（P＜0.05）。與缺氧組相比，缺氧+CDDO-Me 組PAAF 的TGF-β1 表達水平以及Smad3 磷酸化水平顯著下降（P＜0.05）。以上結果提示，CDDO-Me 可以抑制缺氧誘導的PAAF 中TGF-β1/Smad3 信號通路的激活。

圖4 CDDO-Me對缺氧誘導的PAAF中TGF-β1/Smad3信號通路的影響Figure 4 Effects of CDDO-Me on the TGF-β1/Smad3 signaling pathway in PAAF induced by hypoxia

2.5 CDDO-Me 對缺氧誘導的PAAF 中NF-κB 信號通路的影響

免疫熒光結果顯示（圖5A），常氧組PAAF中NFκB（p65）主要表達于細胞質中，缺氧組NF-κB 主要表達于細胞核中，表明缺氧可誘導NF-κB向細胞核轉位，而CDDO-Me 處理后可抑制上述改變。Western blot和ELISA結果進一步表明，與對照組相比，缺氧組PAAF 中NF-κB 磷酸化蛋白水平顯著上調，同時NF-κB 信號通路下游靶基因IL-1β和TNF-α的表達水平顯著升高（P＜0.05，圖5B～D）。與缺氧組相比，CDDO-Me處理可以顯著降低NF-κB磷酸化水平，并下調IL-1β和TNF-α的表達水平（P＜0.05）。以上結果表明，CDDO-Me可以抑制缺氧誘導的PAAF中NF-κB信號通路的激活。

圖5 CDDO-Me對缺氧誘導的PAAF中NF-κB信號通路的影響Figure 5 Effects of CDDO-Me on the NF-κB signaling pathway in PAAF induced by hypoxia

3 討論

肺血管重構是PAH特征性的病理改變，涉及肺血管內膜和中膜增厚以及血管外膜的纖維化。肺動脈內皮細胞功能障礙和平滑肌細胞過度增殖是PAH的研究重點，而成纖維細胞作為血管外膜最豐富的細胞成分，其在PAH發(fā)生發(fā)展中的作用常被忽略。近年來越來越多的研究表明，在響應損傷和應激時，血管外膜成纖維細胞最先被激活，在肺循環(huán)和體循環(huán)血管結構的調節(jié)中發(fā)揮重要作用［2，10］。尤其是在缺氧條件下，肺血管外膜常在肺動脈中膜增厚以及肺血管壓力升高之前便出現(xiàn)結構改變，包括成纖維細胞的過度增殖與遷移、肌成纖維細胞轉化、大量膠原蛋白的沉積以及ECM的重構［11］。這種改變不僅使血管壁順應性降低，同時ECM作為多種大分子蛋白組成的復雜網(wǎng)狀結構，其成分變化參與調節(jié)血管壁細胞增殖、遷移、分化等多種生物學過程［12］。

氧化應激損傷在缺氧性PAH 中發(fā)揮至關重要的作用。缺氧刺激血管壁細胞產生大量ROS，同時細胞內清除ROS的能力下降，細胞自身的氧化/抗氧化平衡失調造成大量ROS蓄積，誘導細胞發(fā)生炎癥、凋亡、壞死，促進血管重構［13］。ROS還可以與一氧化氮（nitric oxide，NO）相互作用降低NO的生物利用度，增加血管張力［14］。Nrf2是細胞抗氧化應激的重要轉錄因子，調控下游如GSH、硫氧還蛋白、醌氧化還原酶等抗氧化相關蛋白及細胞保護酶的表達，在維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。CDDO-Me 是一種半合成的齊墩果酸衍生物，可以有效激活Keap1/Nrf2/ARE信號通路，誘導抗氧化相關蛋白及酶類的表達，降低ROS水平，保護細胞功能［15］。研究顯示，CDDO-Me 可以減輕缺血再灌注引起的大鼠急性腎損傷［16］、保護糖尿病腎病腎小管功能［17］，也可以減輕放射線照射和博來霉素誘導的小鼠肺部損傷和纖維化［8-9］。此外近年來研究表明，CDDO-Me 可改善內皮細胞功能、抑制平滑肌細胞收縮［18］。Ⅱ期臨床試驗結果顯示CDDO-Me可改善PAH患者運動耐力［19］。以上研究均提示CDDO-Me 具有較大的PAH治療潛力。本課題組前期研究結果表明，CDDO-Me可降低野百合堿誘導的PAH大鼠平均肺動脈壓，在PAH 動物模型中具有一定治療作用［20］。然而目前CDDO-Me對PAAF生物學功能的影響尚不明確。

肺血管外膜纖維化是肺血管重構的一個重要病理改變。在缺氧性PAH早期，肺動脈外膜便出現(xiàn)大量表達α-SMA 的肌成纖維細胞。肌成纖維細胞作為膠原蛋白和其他ECM蛋白的主要產生細胞，在誘導血管外膜纖維化、降低血管順應性中發(fā)揮重要作用［21］。此外，肌成纖維細胞具有更強的收縮和遷移能力，參與血管新生內膜的形成［22］。本研究結果顯示，CDDO-Me 可以抑制缺氧誘導的PAAF過度增殖、遷移和肥大，抑制α-SMA、Vimentin和Collagen Ⅰ的表達，提示CDDO-Me 能夠抑制缺氧誘導的PAAF向肌成纖維細胞轉化。

成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉化過程受到復雜的微環(huán)境調控，包括生長因子、細胞因子、黏附分子和ECM 分子。研究表明，缺氧可以誘導NADPH氧化酶（NADPH oxidases，Nox）表達增加，進而產生大量ROS，促進成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化［23］。抑制Nox4 或應用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸降低細胞內ROS 水平可以改善博來霉素誘導的肺纖維化［24］。本研究結果表明，CDDO-Me可以顯著升高細胞中GSH水平，增加抗氧化金屬酶SOD的表達，減少缺氧誘導的ROS 蓄積和脂質過氧化產物MDA 的生成，提示CDDO-Me 可以提高細胞抗氧化應激能力。此外，缺氧還可以通過上調缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）的表達來促進TGF-β1 的分泌，促進纖維化進程［25］。TGF-β1是強有力的促纖維化細胞因子，其下游底物分子Smad3 可以結合促纖維化相關蛋白的啟動子區(qū)域，促進α-SMA和膠原蛋白的表達，誘導基質金屬蛋白酶組織抑制因子的產生并抑制基質金屬蛋白酶的活性，從而減少ECM降解，因此TGF-β1/Smad3信號通路的過度活化是纖維化疾病發(fā)生發(fā)展的重要機制之一［26］。本研究結果證實，缺氧可以促進PAAF分泌細胞因子TGF-β1，激活下游Smad3 信號通路，而CDDO-Me能夠抑制缺氧誘導的TGF-β1/Smad3信號通路的活化。以上實驗結果表明，CDDO-Me可能通過減少PAAF 中ROS 的蓄積，抑制缺氧誘導的TGF-β1/Smad3 信號通路的活化來調控PAAF 向肌成纖維細胞轉化。

此外，成纖維細胞可以分泌多種炎性因子［27］，研究表明，其可能通過激活STAT3、C/EBPβ等信號通路，誘導巨噬細胞的招募與激活，促進巨噬細胞向炎癥表型轉化，參與PAH 的發(fā)生發(fā)展［28］。NF-κB活化是炎癥反應的中心環(huán)節(jié)，靜息狀態(tài)下NF-κB與IκB 結合存在于胞漿中，其功能受到抑制。當細胞外信號刺激時，IκB被泛素化降解，NF-κB得以解離并轉位至細胞核中，調節(jié)炎癥趨化因子如單核細胞趨化蛋白-1和多種炎癥細胞因子（如IL-6和TNF-α）的表達，在炎癥、氧化應激、細胞增殖與凋亡等過程中發(fā)揮重要作用［29］。本研究結果顯示，缺氧可以激活PAAF中NF-κB信號通路，誘導NF-κB的核轉位，升高NF-κB 蛋白磷酸化水平并促進炎癥因子IL-1β和TNF-α的合成釋放。而CDDO-Me 可以抑制缺氧誘導的PAAF 中NF-κB 信號通路的活化，降低下游炎癥因子IL-1β和TNF-α的表達。這一結果與既往研究相一致，即Nrf2信號通路與NF-κB信號通路之間具有相互作用，Nrf2信號通路的激活可以抑制NFκB的活化以及相關炎癥因子的表達［30］，同時CDDOMe也在多種疾病模型中表現(xiàn)出抗炎作用［15］。

綜上所述，CDDO-Me 可以抑制缺氧誘導的PAAF增殖、遷移以及肌成纖維細胞轉化，其可能與提高PAAF 抗氧化應激能力、降低ROS 水平并抑制TGF-β1/Smad3信號通路相關。CDDO-Me 還可以抑制缺氧誘導的NF-κB 信號通路活化，減少PAAF 炎癥因子的釋放，發(fā)揮抗炎作用?，F(xiàn)有的PAH治療藥物在改善肺血管重構方面作用有限，以CDDO-Me為載體研發(fā)的CDDO-NO，兼具擴張肺血管和抑制肺血管重構的作用，在野百合堿誘導的PAH大鼠模型中具有一定治療效果［20］。在今后的研究中，仍需進一步探索CDDO-Me 及以其為載體的生物合成藥物更深層次的分子作用機制以及信號通路，為PAH的治療提供新的方向。